摘要:自2002年以来，在用γ-逆转录病毒载体治疗X连锁重度复合性免疫缺陷病 (X-SCID) 的10例病人中已有4例因载体整合在原癌基因lmo2等附近而得了白血病。这一事件提高了人们对基因治疗载体安全性的关注。与γ-逆转录病毒载体相比，慢病毒载体因尚未发现有整合在lmo2附近的现象，被认为是安全性较好的基因治疗载体。然而自灭活慢病毒载体与γ-逆转录病毒载体一样存在着转录“通读”的现象。近些年来，科学家们在改善自灭活慢病毒载体的通读率上做了一些工作并取得了一些积极成果。以下对慢病毒载体转录“通读”现象的发生机理和解决途径作了综合描述。

摘要:聚合高分子电解质含有大量阳离子或阴离子，通过静电作用结合带相反电荷的蛋白质，生成聚合高分子电解质-蛋白质复合物，电解质-蛋白质复合物通过桥连作用或疏水作用形成沉淀颗粒；聚合高分子电解质的选择性沉淀作用受电解质的分子量、添加剂量、溶液离子强度和pH的影响。用高分子电解质从大规模的低浓度溶液中选择性地沉淀目的蛋白质，为生物工程的下游处理开辟了一条新途径。

摘要:甲状旁腺激素相关蛋白 (Parathyroid hormone related protein，PTHrP) 具有广泛生物学功能，对调控钙代谢具有重要作用。采用RNA干扰和重组腺病毒技术，对山羊乳腺上皮细胞中PTHrP基因表达进行沉默，为进一步研究该基因在乳腺上皮细胞中的功能奠定基础。采用BLOCK-iT shRNA腺病毒干扰系统，将设计好的寡聚shRNA-322/357经退火复性后插入穿梭质粒pENTR/CMV-GFP/U6中。经Western blotting检测干扰效率后，选择pENTR/CMV-GFP/U6-322与病毒骨架质粒pAd/PL-DEST进行同源重组，成功获得重组干扰腺病毒载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-322，并转染HEK-293细胞，通过包装、扩增后产生干扰重组腺病毒AD-PTHrP-322，TCID50法测定其滴度为2.0×109 PFU/mL。用AD-PTHrP-322感染山羊原代乳腺上皮细胞(MOI=200)，经实时定量PCR及Western blotting检测表明在病毒感染24 h、48 h和72 h后，山羊乳腺上皮细胞中PTHrP mRNA表达量分别下调了29.2％、68.1％和82.6％ (P＜0.05)，其蛋白表达水平也明显下调，干扰效果明显。

摘要:为深入了解两种新型人工抗菌肽mytilin-derived-peptide-1 (MDP-1) 和mytilin-derived-peptide-2 (MDP-2) 的溶液结构和抗菌机理并探讨两种抗菌肽之间活性差异的结构基础，采用二维核磁共振技术 (2-D NMR) 研究MDP分子的溶液结构；采用透射电镜技术 (Transmitted electron microscopy，TEM) 研究MDP分子对于大肠杆菌和藤黄叠球菌的作用机理。研究结果表明，MDP-1和MDP-2均采取了典型的β-发夹结构，其分子表面具有明显的疏水斑片，其分子中碱性氨基酸突出于分子表面；经MDP分子处理后的大肠杆菌以及藤黄叠球菌均出现细胞壁或细胞膜结构被破坏，并出现膜壁分离以及细胞质内缩现象。我们认为，MDP-1和MDP-2分子中的碱性氨基酸有助于MDP结合细菌表面的带负电荷的基团，同时其分子表面的疏水斑片有助于其插入到细菌细胞膜内；其疏水斑片面积以及碱性氨基酸在分子表面的拓扑结构差异是MDP-1和MDP-2活性差异的主要原因；电镜实验结果表明MDP-1和MDP-2的主要靶标是细菌细胞壁以及细胞膜；上述研究为深入了解MDP分子的结构与功能的关系以及将来基于MDP分子的药物研发奠定了基础。

摘要:为了阐明Rboh基因家族在水稻免疫应答中的功能，首先利用生物信息学方法从水稻基因组数据库中检索到7个水稻Rboh基因，并对其进行系统发育学和组织特异性表达分析，发现OsRbohD只在穗和愈伤组织中表达，且OsRbohE和OsRbohF仅在愈伤组织中特异表达，而其他基因为组成型表达。利用Real-time PCR对分别在水杨酸SA、茉莉酸甲酯MeJA和水稻黄单胞菌PXO99致病菌株处理下的OsRboh基因家族的表达水平进行了分析，同时对处理后的叶片H2O2含量进行测定。结果表明，SA可以提高OsRbohA、OsRbohB、OsRbohC和OsRbohD的表达水平，MeJA可以提高OsRbohA、OsRbohB、OsRbohC和OsRbohG的表达水平，接种水稻黄单胞菌致病菌株PXO99可以提高OsRbohA和OsRbohB的表达水平。然而三者在诱导OsRboh基因家族成员的表达时序性和表达程度存在着差异。此外，3种不同处理都能导致不同程度的H2O2积累。结果显示，OsRboh基因家族各基因在水稻免疫应答中可能扮演不同角色，发挥不同作用。

摘要:为获得芸薹属白菜Brassica campestris与青花菜Brassica oleracea var. botrytis的种间体细胞杂交体，以青花菜和白菜的子叶与下胚轴为材料，分离制备原生质体，用40％聚乙二醇 (Polyethylene glycol，PEG) 进行原生质体融合。融合细胞在以0.3 mol/L 蔗糖、0.3 mol/L葡萄糖为渗透稳定剂，附加0.2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤 (6-BA) +0.1 mg/L 1-萘乙酸 (NAA) +0.1 mg/L激动素 (Kinetin，Kin) 的改良K8p培养基中液体浅层培养。将包埋于0.1％琼脂糖的8~10个细胞期的细胞在添加0.3 mol/L蔗糖和2 mg/L 6-BA+2 mg/L玉米素 (Zeatin，ZEA) +1 mg/L NAA+0.5 mg/L Kin的Kao培养基中诱导愈伤组织。愈伤组织转到MS+5 mg/L ZEA+2 mg/L IAA诱导不定芽。将长1～2 cm的不定芽转到1/2 MS+0.2 mg/L NAA诱导生根。将生根的植株转移到花盆，并对其杂种性质进行形态学、细胞学和分子生物学鉴定。结果表明，融合细胞培养2～7 d后发生第1次分裂，培养35 d后植板率为0.66％，不定芽再生率达3.7％。形态学观察显示，绝大多数再生植株的叶面积较大，株型和叶型为两种杂交亲本的中间型。染色体计数结果显示，再生植株染色体数目为2n=38。流式细胞仪测定DNA含量显示，再生植株DNA含量是亲本之和。随机扩增多态性DNA (Random amplified polymorphic DNA，RAPD) 和基因组原位杂交 (Genomic in situ hybridization，GISH) 分析结果证明再生植株具有双亲基因组。体细胞杂种花粉育性比较低，杂交、回交后其育性逐渐获得恢复。

摘要:旨在体外组装酵母菌表达的gp96 (Recombinant gp96，rgp96) 蛋白与B16.F10黑色素瘤抗原，大量制备新型gp96肿瘤疫苗，并研究其诱导的特异性抗肿瘤免疫应答。利用体外组装的rgp96-肿瘤抗原复合物免疫C57BL/6小鼠，并通过酶联免疫斑点实验、细胞因子染色、杀伤实验技术进行分析，结果显示与单纯rgp96或肿瘤抗原免疫组相比，体外组装的rgp96-肿瘤抗原复合物免疫能够显著抑制B16肿瘤的生长，而且能够明显提高肿瘤特异性T细胞活性。rgp96-肿瘤抗原复合物的抗肿瘤免疫活性与从肿瘤组织中提取的gp96接近。研究结果为大量制备新型gp96肿瘤疫苗提供了依据。

摘要:细胞外基对组织细胞起支持、保护、营养作用，对细胞的增殖、分化有重要影响，在细胞和组织工程中，应该充分考虑细胞外基质的作用。本研究首先脱去培养板中融合培养的原代小鼠心肌成纤维细胞和成骨细胞，获得两种体外形成的细胞外基质包被的培养板，其中成骨细胞细胞外基质中含有骨形成蛋白2。然后将MC3T3-E1成骨前体细胞接种在这种培养板中，发现成纤维细胞胞外基质包被的培养板中的细胞增殖活性最高，而成骨细胞胞外基质包被的培养板中细胞的碱性磷酸酶活性、骨形成蛋白2和骨桥蛋白的相对蛋白表达量最高，细胞外钙沉积量比其他组高1倍左右。结果表明：包被在培养板上的这两种细胞外基质有不同的生物活性，成纤维细胞胞外基质可促进成骨前体细胞增殖，成骨细胞胞外基质可促进成骨前体细胞骨向分化。

摘要:为了深入研究植物细胞培养生产次生代谢产物不稳定性的机制，以葡萄细胞作为模式体系，研究悬浮培养过程中花青素合成的不稳定性。除了用常规的花青素总含量来表征花青素的生物合成之外，还采用HPLC测定花青素不同组分的含量。结果表明，在长期的继代培养过程中，不仅花青素的含量而且花青素的组成也表现出明显的不稳定性。首次采用了不稳定系数 (δ) 和因素得分 (Factor scores) 来表征植物细胞培养过程中次生代谢生产的不稳定性。培养条件对花青素生物合成的影响实验结果表明，继代周期和接种量均能诱发次生代谢的不稳定性表达，其中接种量的影响相对更大。在考察的 (6.5 d，2.00 g)，(7 d，2.00 g)，(7.5 d，2.00 g)，(7 d，1.60 g) 和 (7 d，2.40 g) 五种不同的继代周期和接种量组合条件中，7 d继代周期和1.60 g接种量最有利于保持花青素的稳定生产。

摘要:为了建立聚乙二醇 (PEG) 巯基定点修饰溶葡球菌酶的方法，并检验假定连接区的突变与修饰对酶活的影响，对溶葡球菌酶的假定连接区进行了巯基聚乙二醇定点修饰研究。通过分析溶葡球菌酶的结构特征，选择两个结构域之间的氨基酸 (133-154aa) 进行定点突变引入半胱氨酸残基。使用单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺 (mPEG-MAL) 进行定点修饰，对修饰后的酶进行纯化并测定酶活性。结果表明定点突变的半胱氨酸残基PEG修饰效率高、产物单一，运用简便的Ni2+-NTA柱亲和层析法实现了一步分离，获得了高纯度的目标蛋白，但在连接区进行定点突变及PEG定点修饰后的酶活有不同程度的降低，表明假定连接区部分位点的PEG修饰会对溶葡球菌酶的催化活性产生一定影响。

摘要:为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达，采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列，将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中，以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理，电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115，经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选，获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白，发酵液经SDS-PAGE电泳分析，在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明，重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明，酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。

摘要:为了实现特异性识别斑马鱼卵黄蛋白原的噬菌体展示单链抗体的可溶性表达，将不能以可溶性蛋白形式表达的、只能以噬菌体展示形式特异性识别斑马鱼卵黄蛋白原的单链抗体F5的基因，克隆到pET 32a载体并转化入大肠杆菌ori DE3中。结果表明，通过诱导表达，可获得可溶性的并且仍特异性识别斑马鱼卵黄蛋白原的单链抗体32a-F5。噬菌体展示单链抗体不能可溶性表达是噬菌体展示技术应用中常见的问题，该方法提供了一种表达可溶性单链抗体的可行性方案。

摘要:考察了磺酸基离子交换层析介质 (SP Sepharose FF) 在分离表达人乳铁蛋白的重组牛乳过程中的污染机理及其再生策略。通过层析原料及流分中各组分含量的检测分析，发现牛乳中的脂类通过堵塞效应或疏水相互作用残留在层析柱上，造成层析运行压力升高；部分酪蛋白通过静电相互作用占据介质的配基位点，导致介质的交换容量降低；乳糖与介质之间无直接相互作用。连续层析运行次数的增加以及层析-再生时间间隔的延长，均能导致残留组分和介质之间的相互作用逐渐增强，最终影响介质的再生效率。使用NaOH进行及时清洗，可以有效地清除柱上残留的脂类和蛋白，恢复离子交换介质的层析性能和微观形态。

摘要:为了获得活性良好的重组人β-分泌酶 (β-secreatase, BACE1)，用于研究其与抑制剂的作用模式，构建了携带β-分泌酶proBACE1和BACE1编码序列的重组表达质粒pPIC9K-MetBACE22和pPIC9K-MetBACE46，通过电击法转入毕赤酵母GS115中，分别得到重组子9k-B22和9k-B46。重组菌株在诱导表达培养基中诱导外源基因表达，结果显示9k-B22的上清活性明显高于9k-B46的上清活性。9k-B22表达上清浓缩后经HisTrap亲和柱纯化得到的蛋白具有良好的BACE1活性, SDS-PAGE/高碘酸-希夫试剂染色发现其为糖蛋白，并且其糖基侧链可以被Endo Hf完全切除，得到50 kDa左右的两条蛋白带。肽质量指纹图谱鉴定发现，这两个蛋白分别与proBACE1和BACE1匹配。活性检测发现糖基化BACE1和去糖基化BACE1的活性均低于HEK-293细胞表达的商品BACE1，这说明糖基化及其类型对BACE1的活性非常重要。然而已知的BACE1抑制剂对三者的抑制率无显著差异，这说明糖基化并不影响与抑制剂的相互作用。经过一系列培养条件优化BACE1纯化产量提高到1 mg/L，这为发现并优化BACE1新型抑制剂的相关研究奠定了物质基础。

摘要:为了研究hSCGF-α对人脐带间充质干细胞 (Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs) 的作用，采用基因工程技术获得重组人干细胞生长因子-α (Recombinant human Stem Cell Growth Factor-α，rhSCGF-α)。针对SCGF基因的高GC含量，采用PCR两步法获得hSCGF-α基因，插入pET-28a(+) 载体质粒，构建重组质粒pET-28a-SCGF-α，转化大肠杆菌BL21(DE3) 获得表达菌株。低温20 ℃诱导24 h，目标重组蛋白人干细胞生长因子-α以可溶性表达为主。通过Ni2+-NTA柱纯化，获得目标重组蛋白，电泳谱带扫描分析蛋白纯度可达90％以上。以巨噬细胞/粒细胞(Granulocyte/macrophage，GM)集落形成实验鉴定重组蛋白的生物学活性，并协同重组人巨噬细胞/粒细胞集落刺激因子(Recombinant human GM-colony stimulating factor，rhGM-CSF) 研究其对人脐带间充质干细胞的影响。结果显示，纯化的重组蛋白rhSCGF-α具有生物学活性；hSCGF-α及rhGM-CSF对hUCMSCs均有刺激增殖活性，但协同作用效果最强。