摘要:基元模式分析是应用最广泛的代谢途径分析方法。基元模式分析的研究对象从代谢网络发展到信号传导网络；研究尺度从细胞到生物反应器，甚至生态系统；数学描述从稳态分解到动态解析；研究领域从微生物代谢到人类疾病。以下综述了基元模式分析的算法和软件开发现状，以及其在代谢途径与鲁棒性、代谢通量分解、稳态代谢通量分析、动态模型与生物过程模拟、网络结构与调控、菌株设计和信号传导网络等方面的应用。开发新的算法解决组合爆炸问题，探索基元模式与代谢调控的关系以及提高菌株设计算法效率是今后基元模式的重要发展方向。

摘要:通过在细胞和胚胎水平对猪Von Hippel-Lindau (VHL) 基因进行了基因敲低研究，以便为建立VHL疾病模型猪奠定基础。研究首先通过3￠RACE和5￠RACE克隆得到猪VHL基因cDNA 全长序列 (2 725 bp)，Real-time PCR结果表明VHL基因广泛表达于猪的各种组织器官，其中在肾上腺、肝脏、胰腺、心脏和睾丸等组织器官高量表达。进一步在猪iPS细胞中对5条干扰片段进行筛选，获得2条高效的干扰片段，干扰效率分别达到72％ (P=0.0012) 和64％ (P＜0.01)。以稳定干扰VHL基因的猪胎儿成纤维细胞为核供体，构建克隆胚胎，结果表明，克隆胚胎的发育能力与对照组相比没有明显差异，而且在克隆囊胚中VHL基因的干扰效率达到71％ (P＜0.01)。综上所述，文中获得了猪VHL基因全长序列并获得该基因稳定敲低的猪细胞和胚胎，从而为VHL疾病模型猪的构建奠定了良好的基础。

摘要:具有鲁棒性的基因回路构建是合成生物学的基础工作。基于群体感应的自杀基因回路转化大肠杆菌后赋予宿主菌在一定菌群密度时启动自杀的特性。为了使基因回路更具鲁棒性，在转化后以不同浓度的IPTG为诱导剂，观察宿主菌的表型特征以及在自杀过程中突变菌产生的规律，并通过基因测序确定变异位点。结果表明：IPTG浓度与细菌自杀率呈正相关，自杀强度愈大，突变菌株出现得越早，蔓延的速度也越快。基因测序结果表明，在基因回路质粒上，luxR基因中间有转座子插入，从而破坏了群体感应系统。实验也表明：仅需该突变，就足以使宿主菌逃避自杀。结果为下一步优化基因回路设计，实现细菌密度的连续振荡提供了思路。

摘要:旨在用蛋白质组学方法揭示枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis 168将顺丙烯磷酸转化成磷霉素的机理。B. subtilis 168能够将顺丙烯磷酸不对称转化成磷霉素。气相色谱分析发现在转化培养基发酵液中的磷霉素的含量达816.6 μg/mL，转化率为36.05％。将分别培养在含有底物和不含底物的培养基中的B. subtilis 168的胞质蛋白进行双向凝胶电泳。对两种条件下的电泳图谱进行比较，发现有98个差异表达蛋白。其中在有底物存在时，表达量下调的点有20个，表达量上调的点52个，底物特异性表达的点有26个。对差异表达蛋白进行质谱鉴定，共鉴定到80个蛋白点，其中下调的点17个，上调的点45个，底物特异性表达的点18个。这些蛋白分别参与胁迫反应、氧化还原反应、物质转运、核苷酸代谢、糖代谢、氨基酸和蛋白质代谢等。根据上述对B. subtilis 168蛋白质组学分析结果，推测菌株是通过两步将顺丙烯磷酸转化成磷霉素的。第一步是水化反应，第二步是脱氢反应。

摘要:芳樟醇是一种重要单萜，广泛应用于食品、医药、日化等工业领域。然而芳樟醇在植物中含量低且难提取，限制了其大规模生产。目前通常以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae作为单萜生物合成宿主，其内源类异戊二烯合成途径提供合成单萜物质的前体——香叶基二磷酸 (GPP)。由于该途径代谢通量较低，导致GPP供应不足，极大地降低了异源单萜的合成效率。为了调节该途径的代谢通量，构建酿酒酵母整合表达载体pRS305-tHMG1和游离表达载体pYLIS-IDI1，并分别转入酿酒酵母CEN.PK2-1C中，获得酿酒酵母工程菌LS01和LS02。同时将载体pYLIS-IDI1转入酿酒酵母工程菌LS01中，构建酿酒酵母工程菌LS03。GC-MS检测结果显示，通过提高异戊二烯二磷酸异构酶 (IDI1) 和羟甲基戊二酸单酰辅酶A (HMG-CoA) 还原酶活性区域 (tHMG1) 的表达水平，最终使芳樟醇产量提高1.3倍至 (127.71±7.68) mg/L。结果表明，通过调控类异戊二烯合成途径，强化GPP合成前体供给，可以显著提高酿酒酵母中芳樟醇的产量。

摘要:启动子是基因表达调控的重要元件。在代谢工程和合成生物学研究中，经常需要利用不同强度的启动子对代谢途径进行精细调控，来实现代谢平衡，降低中间产物积累，提高目标产物合成。然而目前可获得的启动子难以满足以上要求，而且不同来源的启动子通用性差，缺乏标准化。针对这些问题，设计了1条88个碱基对的启动子，包含典型的?35区、?10区以及核糖体结合区。同时，在转录起始位点上游6个碱基、?35与?10区间隔区14个碱基对中引入简并序列，构建了合成启动子文库。利用合成启动子控制红色荧光蛋白mCherry的表达强度，经过两轮筛选，从5 000多个克隆中获得了720个不同强度的启动子。随机挑选35条不同强度的启动子进行测序分析，结果表明不同强度的启动子具有碱基偏好性。对于强启动子，?13位点嘌呤碱基出现频率高，转录起始区除?4位点外，嘧啶碱基出现的频率高于嘌呤碱基，而?10区与?35区间14个位点的嘌呤碱基与嘧啶碱基出现频率大致相当。最后选取5条不同强度启动子应用于顺,顺-粘康酸合成途径调控优化，结果显示不同强度的启动子可以调节目标产物顺,顺-粘康酸的合成和中间产物儿茶酚的积累。

摘要:染料脱色过氧化物酶 (DyP-type 过氧化物酶) 是含有亚铁血红素，能降解各种有毒染料的一类蛋白。为了研究运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4 (ATCC 31821) 中一种新的DyP-type过氧化物酶的特点和功能，以Z. mobilis基因组DNA为模板，通过PCR扩增目的基因，克隆到大肠杆菌表达载体pET-21b(+) 中。通过ZmDyP与其他DyP-type过氧化物酶的比对，发现它们存在着共同保守氨基酸D149、R239、T254、F256和GXXDG结构基序，说明ZmDyP是Dyp-type过氧化物酶家族的一个新成员。经IPTG诱导大肠杆菌中pET21b(+)-ZmDyP表达，并将表达的酶进行金属螯合层析纯化。SDS-PAGE分析表明，纯酶分子量为36 kDa，而活性染色显示分子量为108 kDa，表明该酶在活性状态下可能是一个三聚体。光谱扫描显示ZmDyP有一个典型的亚铁血红素吸收峰，说明它是含有亚铁血红素的蛋白。对ZmDyP性质进行了研究，发现以2,2-二氨-双 (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸) ABTS为底物，ZmDyP表现出更高的转化效率。这些研究结果丰富了DyP-type过氧化物酶家族信息，并且为ZmDyP的结构功能和反应机制研究奠定了基础。

摘要:WRKY是调控植物生长发育和逆境胁迫反应等生命活动的一个转录因子大家族。然而，有关药用植物长春花CrWRKY转录因子的种类和功能却知之甚少。从26 009个长春花蛋白中鉴定出47个CrWRKY转录因子。依据WRKY结构域和系统进化，将CrWRKY分为G1、G2和G3三大类群。表达谱数据分析表明，长春花CrWRKY基因的表达具有器官特异性。47个CrWRKY基因的表达谱可分为3种表达模式：第1类型主要在花、甲基茉莉酸甲酯 (MeJA) 或酵母提取物 (YE) 处理的原生质体中高表达；第2类型主要在茎和毛状根中高表达；第3类型在根、茎、叶、幼苗和MeJA处理的毛状根中高表达。进一步用实时定量PCR检测了16个代表性CrWRKY基因在不同器官、MeJA处理原生质体和毛状根中的表达模式，检测结果与上述数字基因表达谱数据基本一致。约1/3以上CrWRKY基因的表达受MeJA和YE的调控，暗示它们可能参与萜类吲哚生物碱的合成和逆境胁迫反应。为进一步解析长春花WRKY转录因子的功能和萜类吲哚生物碱合成调控的网络奠定了基础。

摘要:金黄色葡萄球菌肠毒素C2 (Staphylococcal enterotoxin C2，SEC2) 作为一种超级抗原蛋白，极微量即可有效激活机体免疫系统，这一特性可应用于对肿瘤和感染性疾病的辅助治疗。为了增强SEC2的超抗原活性，应用over-lap PCR方法将SEC2中的102~106位GKVTG氨基酸残基分别突变为WWH、WWT和WWP，获得3种突变体ST-1、ST-2和ST-3。三种突变体刺激小鼠淋巴细胞增殖活性和肿瘤细胞生长抑制活性与野生型SEC2相比均有显著提高。ST-1和ST-3的致热活性与野生型SEC2相当，而ST-2的致热活性明显高于野生型SEC2。此外，三种突变体体外刺激淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平也显著提高，这可能是导致突变体具有较高肿瘤细胞生长抑制活性的原因。进一步实验发现，三种突变体刺激下，小鼠脾淋巴细胞mVβ8.2基因的转录水平较野生型SEC2显著增加，暗示突变体对TCR mVβ8.2分子亲和力的提高，可能是其超抗原活性增强的主要原因。

摘要:为研制抗血吸虫疫苗提供实验依据，探讨了抗血吸虫SjGST-32核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫的免疫增强效应及免疫应答特征。将日本血吸虫DNA疫苗VR1012-SjGST-32与重组蛋白疫苗rSjGST-32分别在第0、2和4周免疫小鼠，在第6周攻击感染日本血吸虫尾蚴，攻击感染45 d后剖杀小鼠，计算减虫率、检卵率以及检测肝脏病理变化，观察免疫保护效果；检测小鼠血清中特异性IgG抗体滴度，T细胞增殖反应和抗原特异性CD4+IFN-γ+、CD4+IL-4+和CD4+IL-10+的数量，探讨免疫应答特征。结果显示，DNA初免-蛋白加强的联合免疫组的保护作用优于单独免疫组，显著提高了减虫率 (42.3％) 和减卵率 (59.6％)，并且能够显著减轻血吸虫虫卵对肝脏的病理损害；进一步发现，DNA疫苗和蛋白疫苗联合应用增强了机体T淋巴细胞增殖反应、抗体IgG滴度以及抗原特异性CD4+IFN-γ+的产生。这些研究为新型血吸虫疫苗的优化设计和合理应用提供了依据。

摘要:为探讨Ⅱ型抗癌晶体蛋白 (Parasporin-2) 上与抗肝癌作用相关的关键氨基酸，利用5-BU对Parasporin-2活性区编码DNA(P2Y) 进行PCR诱变，之后在大肠杆菌中表达，产物纯化后经MTT法检测其对肝癌细胞系和正常肝细胞系的作用。获得的9个突变体其抗肝癌活性差异极大，其中P2M1和P2M8对两种肝癌细胞系SMMC7721和Bel7402均有较强的细胞毒杀作用而不影响正常肝细胞系Chang-liver。比较了P2M1、P2M8和P2Y的二级结构与三级结构，发现二级结构上的变化如β折叠变长或α螺旋增加影响着Ⅱ型抗癌晶体蛋白的抗肝癌活性。基于突变体间氨基酸序列比对、突变体与受体间分子对接以及模拟突变等研究的结果表明，位点52、56、58和208上的氨基酸残基特别是芳香族氨基酸在Parasporin-2与受体间的互作中可能起着重要作用。

摘要:为了提高黄粉虫抗菌肽基因tmAMP1m在大肠杆菌中的表达量，研究了培养温度、诱导时间及IPTG浓度等不同条件对HIS-TmAMP1m融合蛋白表达量和活性的影响。通过Tricine-SDS-PAGE分析确定最佳表达条件，同时，通过琼脂孔穴扩散法检测其抑菌活性。结果表明，含有重组质粒的大肠杆菌在37 ℃，使用终浓度为0.1 mmol/L IPTG培养4 h时，融合蛋白表达量较高，可占细菌总蛋白40％以上，抗菌活性最好。用Ni2+亲和层析纯化获得较纯的融合蛋白，Western blotting分析表明其能与His单克隆抗体起特异性反应。诱导表达的融合蛋白对宿主菌生长产生一定程度抑制。融合蛋白经100 ℃煮沸10 h，在?20 ℃反复冻融10次，与强酸强碱缓冲液、不同的有机溶剂和蛋白酶混合后都具有极强的稳定性，仍然表现出良好的抗菌活性。此外，最小抑菌浓度 (MIC) 测定结果表明，融合蛋白对5种菌具有良好的抗菌活性。研究结果为昆虫抗菌肽推广应用和进一步研究奠定了基础。

摘要:薯蓣皂苷元是甾体激素类药物重要的生产原料，在制药工业中有广泛应用。传统的生产方法是黄姜酸解法，污染严重。为寻找更清洁高效的生产方式，从本实验室保藏的菌株中筛选出一株赤霉菌Gibberella intermedia WX12 (层出镰孢菌Fusarium proliferatum的有性阶段)，能将黄姜中的皂苷转化为薯蓣皂苷元。采用统计学实验设计方法对其转化培养基进行研究，优化的转化培养基配方为 (g/L)：葡萄糖20.6；酵母膏5.0；氯化钠1；磷酸二氢钾3；硫酸锌1.5；黄姜酶解物3。采用以上优化参数，薯蓣皂苷元的得率提高到 (31±0.3) mg/g干黄姜，较优化前提高了3倍。这是目前关于赤霉菌转化黄姜中皂苷的首次报道。

摘要:为了利用大肠杆菌高效生产重组磷脂酶，克隆了液化沙雷氏菌磷脂酶A1的编码基因pla，分别使用pET-28a(+) 和pET-20b(+) 载体，实现了磷脂酶A1在大肠杆菌BL21(DE3) 中的功能表达。重组菌利用载体pET-28a(+) 在原始信号肽的介导下胞外PLA1酶活达40.8 U/mL，占总酶活的91％。重组菌转接至优化后的发酵诱导培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖0.8 g/L，乳糖5 g/L，25 mmol/L Na2HPO4，25 mmol/L KH2PO4和1 mmol/L MgSO4；菌体生长6 h后，添加7.5 g/L的甘氨酸，37 ℃恒温发酵24 h，重组菌胞外PLA1酶活达到128.7 U/mL。

摘要:采用响应面法对海洋微生物长孢葡萄穗霉菌FG216发酵产生纤溶化合物FGFC1 (Fungi fibrinolytic compound 1) 培养条件进行优化。在单因素试验结果的基础上通过Design-Expert软件对培养时间、诱导物添加量、培养温度进行3因素响应面试验设计，以FGFC1产出量为响应值优化菌株FG216的培养条件，并验证响应面预测值与实测值的一致性。结果表明，在培养时间为9 d、诱导物添加量为0.5％、培养温度为28 ℃的最优培养条件下FGFC1产量可达1 978.33 mg/L，实测值与响应面预测值拟合良好，说明通过响应面试验设计对FG216培养条件的优化是有效的。

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