摘要:工业生物技术是解决人类目前面临的资源、能源及环境危机的有效手段。本期专刊结合第七届中国工业生物技术发展高峰论坛，报道了我国工业生物技术领域专家学者在生物信息学、微生物细胞工厂的模拟设计与构建、工业发酵工程、工业酶的改造与应用、高通量筛选方法等领域取得的最新研究进展。

摘要:随着元基因组数据的不断增多，建立一个包含高品质的元基因组样本 (也称为“微生物群落”) 数据的集成化的分析平台成为可能，使得微生物群落样本能够被有效分析、比较与搜索，从中发现更加深入的生物学意义。然而，一方面目前大部分元基因组数据库仅仅提供了简单的数据存储，缺乏良好的样本注释或者仅仅提供了很少的分析功能。另一方面，用于计算微生物群落数据相似性的方法所能够接受的样本数据量非常有限。长期以来，科学家们一直在寻找有效的方法计算海量微生物群落之间的相似性，从而研究样本之间的相似度并发现元基因组数据信息的相关性。Meta-Mesh是一个全新的在线元基因组分析系统，它包括元基因组数据库和分析平台，可以对元基因组样本进行系统、有效地分析，并实现样本的群落结构比较和精确搜索。其中，元基因组数据库已经从公共领域和内部实验室收集了超过7 000个高品质、带有有效注释的样本。同时，Meta-Mesh的分析平台提供了多种在线分析工具，可以对元基因组样本进行群落的结构分析与注释，多角度比较，并能通过快速索引策略和群落结构相似性算法在数据库中高效搜索近似的样本。Meta-Mesh通过“人体微生物群落样本的数据库搜索识别”以及“基于相似度矩阵的样本的聚类”等一系列的元基因组研究案例证明了其分析方面的性能。作为一个在线的元基因组数据库和分析系统，Meta-Mesh将服务于元基因组样本的快速分析、识别、比对、搜索等相关领域。

摘要:动力学模型分析有利于理解生物系统的调控机制，从而为高效细胞工厂的理性设计提供指导。基于以往发表的相关途径动力学模型和测量的酶动力学数据，开发了大肠杆菌苏氨酸合成途径的动力学模型。模型包含从天冬氨酸至苏氨酸的合成途径及葡萄糖开始的为合成途径提供前体以及能量的代谢途径。与以往模型不同的是新模型中考虑了能量和还原力的平衡，从而使模型模拟的系统自身成为一个不需要从外界提供能量和还原力的自洽系统。模型稳态分析的结果表明PTS、G6PDH和HDH等反应对苏氨酸合成反应的通量控制系数较大，通过过表达这些反应的酶可以有效增加苏氨酸合成反应的通量。

摘要:利用合成生物技术生产7-脱氢胆甾醇的挑战性在于获得合成功能模块与底盘细胞的适配关系。从更换不同调控强度的启动子和不同改造的酵母底盘两方面，对二者的适配性进行研究，以增加7-脱氢胆甾醇产量：过表达酵母固醇合成途径中的内源基因tHMGR和ERG1，敲除非必需基因ERG6和ERG5以抑制酵母固醇向麦角固醇的转化，得到改造后的酵母底盘SyBE_000956；利用由强到弱依次为TDH3p、PGK1p和TDH1p的启动子，引入人源C-24还原酶基因DHCR24，构建3种强度的外源功能模块，并分别导入3种底盘中，得到9种人工合成细胞。结果表明，TDH3p调控的功能模块与底盘细胞SyBE_000956具备较好的适配性，实现7-脱氢胆甾醇产量的提高。为后续的适配性研究提供了理性设计的依据。

摘要:丝状真菌被广泛地用于包括纤维素酶在内的工业酶生产过程。在液体深层发酵中，丝状真菌菌丝形态直接影响发酵液的流变特性，进而与目标酶蛋白产量存在着重要的关联。目前，针对丝状真菌工业酶液体发酵菌丝形态的研究依然是从传统的发酵工程学角度出发，对与发酵水平紧密相关的形态、粘度等性状相关基因的认识远远不够。为了挖掘深层发酵中对丝状真菌发酵产酶性能具有重要影响的形态发育相关基因，以粗糙脉孢菌Neurospora crassa单基因突变体库中的95株形态突变株为研究对象，在结晶纤维素为碳源的条件下进行筛选，探寻与野生型菌株蛋白产量有显著差异的突变株。同时，对这些突变株的内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活、 β-葡萄糖苷酶酶活、发酵液粘度和菌丝干重进行了测定，并观察了发酵液中突变株的菌丝形态。实验结果表明，与野生型菌株相比，突变株SZY32、SZY35、SZY39和SZY43发酵液中蛋白浓度显著降低，突变株SZY11、SZY63、SZY69和SZY87发酵液中蛋白浓度显著性提高。值得注意的是，突变株SZY11和SZY43发酵液菌丝体主要形态为菌球状，其发酵液粘度分别降低75%和50%，突变株SZY87在发酵液中呈长丝状，发酵液粘度显著升高至少2倍。这些与产酶水平相关的形态、粘度基因的获得将有助于丝状真菌纤维素酶等工业酶高产工程菌株的理性构建。

摘要:2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸 (2-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP) 途径是大肠杆菌Escherichia coli唯一的萜类前体合成途径，研究表明它比甲羟戊酸(Mevalonate, MVA)途径具有更高的理论产率。但目前有关MEP途径的调控所知非常有限，故单独强化MEP途径对萜类异源合成产量的提高效果并不理想。研究中通过引入外源MEP途径基因强化E. coli萜类合成的遗传改造策略和发酵过程补糖控制优化，尝试更有效地释放MEP途径的潜力，建立青蒿素前体——紫槐二烯的高密度发酵过程。研究结果表明共表达阿维链霉菌Streptomyces avermitilis dxs2基因和枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis idi基因可使紫槐二烯的摇瓶发酵产量比野生菌株提高12.2倍。随后针对该菌株建立了高密度发酵过程，发现稳定期的中前期 (24?72 h) 是产物合成的关键期，通过稳定期补糖速率的调整，明显改善了产物合成速度，使紫槐二烯的产量从2.5 g/L提高到了4.85 g/L，但不影响产物积累的周期。考虑到72 h后菌体老化可能会影响产物合成，进一步采取了调整对数期的补糖速率控制菌体生长的策略，使紫槐二烯的产量达到6.1 g/L。研究结果为基于MEP途径的萜类异源合成工程菌构建及其发酵工艺的建立奠定了基础。

摘要:氧化葡萄糖杆菌Gluconobacter oxydans可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并进一步氧化成2-酮基-葡萄糖酸(2KGA)和5-酮基-葡萄糖酸(5KGA)，其中5KGA在催化剂的作用下能够转化为L(+)-酒石酸。为了提高5-酮基-葡萄糖酸产量，以仅生成5KGA的氧化葡萄糖杆菌Gluconobacter oxydans HGI-1为出发菌株，研究不同碳源(蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、葡萄糖)和有机氮源(酵母浸粉、鱼粉、玉米浆、黄豆饼粉、棉籽饼粉)对5KGA产量的影响。500 mL摇瓶试验结果表明，当葡萄糖浓度为100 g/L时，5KGA产量最高为98.20 g/L；当有机氮源为酵母浸粉、鱼粉和玉米浆，其添加量的蛋白含量为1.60%时，5KGA产量分别为100.20 g/L、109.10 g/L和99.83 g/L，其中，使用鱼粉的5KGA产量最高，使用玉米浆的5KGA产量比酵母浸粉略低。出于经济考虑，文中选择玉米浆作有机氮源，并在5 L发酵罐中进行分批发酵放大试验，5KGA的产量为93.80 g/L，最大生成速率为3.48 g/(L?h)，平均生成速率为1.56 g/(L?h)。结果表明，葡萄糖和玉米浆分别为Gluconobacter oxydans HGI-1规模化生产5KGA的最适碳源和氮源，可利用葡萄糖几乎全部(85.93%)转化为5KGA。

摘要:近年来随着生物技术的发展，生物酶制剂的生产水平不断提高，促进了酶制剂在生物制浆、生物漂白、废纸生物脱墨、酶法纸浆改善性能及树脂生物控制等方面的应用，体现了酶技术在减轻制浆造纸工业环境污染、改善纸浆抄造性能等方面的潜力。文中重点介绍在不同制浆造纸原料及工艺中酶的选用、复配和应用技术及原理，以及酶制剂的应用效率及其对制浆造纸中节能减排和绿色环保的意义。

摘要:酶转化法是功能性稀少糖生产的重要途径，但单一稀少糖转化酶的转化率普遍较低。文中提出构建双酶偶联转化系统提高转化效率的思路，即利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶 (D-psicose 3-epimerase, DPE) 和L-鼠李糖异构酶 (L-rhamnose isomerase, L-RhI) 双酶偶联反应，催化D-果糖生成D-阿洛酮糖和D-阿洛糖等功能性稀少糖。DPE和L-RhI加酶量的比例为1∶10，其中DPE的浓度为0.05 mg/mL；转化反应的最佳温度为60 ℃，最适pH为9.0。当D-果糖浓度为2%时，反应10 h达到平衡，此时D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的产量分别为5.12和2.04 g/L。利用文中提出的双酶偶联系统可以将果葡糖浆等富含果糖的低附加值原料转化为含有功能性稀少糖的高附加值混合糖液。

摘要:通过改造来源于软化类芽胞杆菌Paenibacillus macerans的环糊精糖基转移酶 (Cyclodextrin glycosyltransferase, CGT酶) 的+1亚位点提高其对麦芽糊精的底物特异性，并进一步提高以麦芽糊精为糖基供体催化合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸 (AA-2G) 的效率。首先对+1亚位点附近的3个氨基酸残基Leu194、Ala230和His233分别进行定点饱和突变，得到3个优势突变体L194N (亮氨酸→天冬酰胺)，A230D (丙氨酸→天冬氨酸)，H233E (组氨酸→谷氨酸)，然后以这3个优势突变体为模板进一步进行两点和三点复合突变，获得7个复合突变体。研究结果表明，突变体L194N/A230D/H233E以麦芽糊精为底物合成AA-2G的产量最高，达到1.95 g/L，比野生型CGT酶提高了62.5%。对获得的突变体进行动力学分析，发现高浓度的底物L-AA对突变型CGT酶催化的酶促反应具有抑制作用。确定了突变体酶促反应的最适温度、pH和反应时间。模拟突变体的三维结构并进行分析，突变体底物特异性的改善可能与CGT酶第194位、230位和233位的氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关。

摘要:前期获得了一个对底物美西律具有一定活性的单胺氧化酶突变体A-1 (F210V/L213C)。为进一步提高其酶活性，利用MegaWHOP PCR构建了库容约为104的随机突变库。筛选后获得了一个最优突变酶ep-1，比活力为A-1的189%。选择性测定结果表明，酶的对映体选择性有较大提高，E值由101提高到282；动力学常数测定揭示，酶催化效率有较大提高，kcat/Km由0.001 51 mmol/(L?s)提高到0.002 89 mmol/(L?s)。和A-1酶相比，在所测定的11种胺类底物中，ep-1对其他7种底物的比活力有较明显提高，对其他4种底物的比活力变化不大。序列分析表明，ep-1的突变为T162A。分子动力学模拟结果提示，该突变主要通过修正通道氨基酸的二级结构和扩大活性口袋来发挥作用。

摘要:新型普鲁兰酶的研究对于普鲁兰酶制剂的国产化、打破国外垄断具有非常重要的意义。从我国云南腾冲地区轮马热泉的淤泥中分离获得了一株耐热普鲁兰酶产生菌LM 18-11，经16S rDNA序列系统进化树分析，确定该菌为厌氧芽胞杆菌Anoxybacillus属种，并从中克隆获得了耐热普鲁兰酶的编码基因，该酶在55 ℃?60 ℃、pH 5.6?6.4的范围内具有最大的反应活性。此外，该酶具有较好的热稳定性，在60 ℃下处理48 h，仍可保持50%以上的活力；动力学分析该酶的Vmax和Km分别为750 U/mg和1.47 mg/mL，是目前文献报道中比活力最高的耐热普鲁兰酶。同时还对该酶进行了晶体结构分析，结果显示该酶具有a-淀粉酶家族中典型的结构，在N端具有一个特殊的底物结合域，该结构域的缺失导致比活力和底物结合力都有相应降低，Vmax和Km分别为324 U/mg和1.95 mg/mL。同时，将该普鲁兰酶编码基因导入枯草芽胞杆菌中，在P43启动子的控制下，普鲁兰酶基因获得了高效表达，胞外酶活可达42 U/mL，相比初始菌种，表达活力提高40倍以上。研究表明该普鲁兰酶具有很好的应用前景。

摘要:立体选择性水解2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯 (CNDE) 是化学-酶法合成重大疾病治疗药物普瑞巴林的关键步骤。分离纯化了能够高效水解S-型CNDE的摩氏摩根菌ZJB-09203胞内酯水解酶，并进行酶学性质研究。采用硫酸铵分级沉淀、Phenyl Sepharose 6 FF疏水柱层析、DEAE Sephadex A-50 阴离子交换和羟基磷灰石Bio-Scale CHT层析，纯化得到电泳纯的酯水解酶。SDS-PAGE和凝胶过滤HPLC分析确定该酶为单亚基蛋白，分子量为68 kDa。不同碳链长度p-硝基苯酚酯特异性酶解结果表明，该酶为酯酶，酶促合成普瑞巴林手性中间体(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的最适 pH 为9.0，最适温度为45 ℃，且在 pH 7.0?9.0和40 ℃条件下具有良好的稳定性。Ca2+、Cu2+、Mn2+对酶活有一定的促进作用，Co2+、Fe3+、Ni2+及EDTA对酶活有较强的抑制作用。此外，考察了该酯酶水解p-硝基苯酚酯的动力学参数，及CNDE浓度对转化率的影响。首次报道了能够立体选择性水解CNDE的酯酶，相关酶学性质研究将为该酶催化合成普瑞巴林手性中间体的工业化应用提供重要依据。

摘要:基于液滴微流控芯片的检测和筛选系统，因其具有通量高、成本低等显著特点，近年来备受关注。该系统生成的微液滴 (皮升体积) 具有直径均一、大小可控、互不交融 (单分散性) 等特性，它作为微反应器可以进行微生物及其代谢物包埋实验和高通量检测。因此，研究微液滴的相关特性及其应用具有重要意义。文中在液滴微流控芯片系统搭建的基础上，对重要氨基酸 (谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸) 分别进行了微液滴包埋实验，研究了包埋微液滴的重要特性参数 (如稳定性、扩散性等) ，探索了包埋微液滴对氨基酸检测分选的应用。实验表明，文中搭建的液滴微流控芯片系统可以稳定、均一地生成微液滴，微液滴大小可根据需要控制在20?50 μm之间，微液滴间无交叉污染，包埋氨基酸的微液滴的检测筛选速度大约为每分钟600个。这个研究为高通量分析和筛选产氨基酸的微生物奠定了基础。

摘要:结合酮康唑抗性筛选法，采用亚硝基胍和低能氮离子注入复合诱变方法筛选得到一株高效生物转化去氢表雄酮 (DHEA) 为3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮 (7α,15α-diOH-DHEA) 的菌株亚麻刺盘孢Colletotrichum lini ST-1，该突变株在底物DHEA投料浓度为10 g/L时产物摩尔得率达到34.2%，较出发菌株提高了46.2%。在此基础上进行培养基组分的优化，采用Plackett-Burman实验设计考察转化培养基中各组分对产物摩尔得率的影响，有效筛选出葡萄糖、酵母粉和MgSO4·7H2O浓度对产物摩尔得率影响显著，继而采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域，并利用中心组合响应面设计实验对3个显著性因素的最佳水平进行研究，得到最适转化培养基组分为 (g/L) ：葡萄糖26.34；酵母粉12.15；玉米浆3.00；FeSO4·7H2O 0.015；MgSO4·7H2O 0.14；KH2PO4 0.90。采用该优化培养基，菌株C. lini ST-1的产物摩尔得率达到49.3%，较优化前提高了44.2%。

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