摘要:无细胞蛋白表达体系是一种以细胞抽提物为基础的体外合成蛋白质表达技术，具有遗传背景简单、反应操控简便等特点，已成为研究生物反应系统的重要技术手段。在研究人员的不断努力下，反应体系从原核扩展到真核蛋白质合成体系，而且目标蛋白表达量从毫克级提高到数克级每升，成本不断降低，反应规模可达到百公升级。近年来，无细胞蛋白表达系统在复杂蛋白、毒性蛋白和膜蛋白表达方面的优势逐渐体现，展示了其在生物制药领域的重要应用潜力。总之，无细胞技术已经成为异源蛋白质高效合成和生物制药领域中有巨大潜力的新策略。

摘要:转座子是基因组中能发生移动和自主复制的DNA片段，随着人们在分子水平上对转座子结构和功能认识的不断深化，许多转座子已被改造为遗传分析的工具应用于基因功能分析、基因转化和基因治疗。然而，天然转座子的转座能力不高是转座子的开发和利用的主要障碍，近几年来，科学家们运用生物信息学和蛋白质工程相结合的方法来构建活性的转座酶，通过氨基酸优化的方法获得自然界不存在的超活性的转座酶，显著地提高了转座子的转座效率，应用于植物转基因和基因标签技术；另一方面，通过蛋白质融合技术构建转座酶嵌合体，改造转座子插入特性，实现其插入位点的人工调控，应用于基因治疗。

摘要:去分化脂肪 (Dedifferentiated fat，DFAT) 细胞是由人体内含量最丰富的成熟脂肪细胞经体外天花板法培养去分化而来。研究发现：DFAT细胞具有均一性高、对供者年龄要求较低等脂肪来源干细胞 (Adipose-derived stem cells, ASCs) 和骨髓间充质干细胞 (Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 所不具有的优势。此外，它还具有体内外成脂、成软骨、成骨、成肌、成神经等多向分化能力以及免疫调节能力。作为具有潜力的组织工程及同种异体干细胞移植的优秀种子细胞，DFAT细胞在治疗骨缺损、神经性疾病、局部缺血性心脏病及肾脏疾病等方面均具有较好的应用前景，对其开展深入的研究具有重要的理论和实践意义。文中从免疫学性质、多向分化能力及临床应用潜力等方面对DFAT细胞的研究进展作一综述。

摘要:为探讨不同转染试剂 (LipofectamineTM LTX & PLUSTM、Lipofectamine2000和纳米化聚酰胺-胺型树枝状聚合物 (PAMAM-D)) 和睾丸注射方法 (睾丸网注射、曲精细管注射和间质注射) 对转基因小鼠生产效率的影响，将pEGFP-C1质粒分别与不同转染试剂混合后，按照不同的注射方法注入小鼠睾丸内，30 d后检测小鼠精子密度、活力、精子阳性率以及配种后仔鼠转基因阳性率。结果3种转染试剂对小鼠繁殖性能影响由小到大依次为LipofectamineTM LTX & PLUSTM、Lipofectamine 2000和PAMAM-D。转染后LipofectamineTM LTX & PLUSTM、Lipofectamine 2000和PAMAM-D组精子的GFP阳性率分别为35.65%±0.69%、12.86%±0.35%和10.04%±0.20%。配种后仔鼠的PCR阳性率分别为29.17%、13.70%和5.88%。三种不同注射方法对小鼠睾丸都造成损伤由小到大依次为睾丸网注射、曲精细管注射和睾丸间质注射，3者的阳性精子比例分别为35.13%±1.727%、15.13%±1.457%和0%，配种后仔鼠的PCR阳性率分别为33.3%、12.5%和0%。结果表明，LipofectamineTM LTX & PLUSTM和睾丸网注射对小鼠睾丸的损伤最小，并能获得较高的转染效率。

摘要:为了研究BAMBI在猪前体脂肪细胞分化过程中的作用，构建了BAMBI慢病毒干扰载体，包装并感染猪前体脂肪细胞，采用油红O染色、油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化情况，采用Real-time qPCR、Western blotting检测成脂标志基因mRNA以及蛋白水平表达的变化情况。结果表明，BAMBI慢病毒干扰载体感染前体脂肪细胞后显著降低了BAMBI的表达，shRNA2干扰效率最高，达到了60%以上，干扰BAMBI后能增加猪脂肪细胞的脂质积累，增加了成脂标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ (Peroxisome proliferator-activated receptorγ, PPAＲγ) 和脂肪酸结合蛋白2 (Adipocyte protein 2, ap2) 的表达。此外，干扰BAMBI后ERK1/2的磷酸化水平减少了。这些结果表明，BAMBI可能通过促进ERK1/2的磷酸化抑制脂肪细胞分化。

摘要:为了在乳酸乳球菌中分泌表达具有生物活性的猪IL-18蛋白，并检测其生物活性，故通过分离猪外周血单核淋巴细胞 (PBMC），以其为模板，采用RT-PCR方法扩增猪白细胞介素18(pIL-18)基因，将目的基因与乳酸乳球菌表达载体pAMJ399进行连接，并电转化至乳酸乳球菌MG1363中，通过SDS-PAGE和Western blotting分析检测目的蛋白的表达，并通过脾淋巴细胞增殖试验和细胞病变抑制法对pIL-18的生物活性进行检测。Western blotting分析检测结果与生物活性检测结果显示，在重组菌pAMJ399-pIL18/MG1363的上清和菌体沉淀中19 kDa处均出现pIL-18的特异蛋白反应带，且分泌表达的pIL-18蛋白能明显促进猪脾淋巴细胞的增殖，并对病毒增殖有明显的抑制作用。以上结果表明pIL-18可在乳酸乳球菌分泌表达，且表达产物具有良好的生物活性。

摘要:3-脱氢莽草酸是芳香族氨基酸合成代谢途径中的一种重要中间产物。除可作为一种高效的抗氧化剂，还可用于合成己二酸、香草醛等一些重要的化工产品，具有重要的应用价值。相关研究证明具有去酪氨酸反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroFFBR以及转酮醇酶基因tktA可以有效影响3-脱氢莽草酸的过量合成。通过增加aroFFBR和tktA串联过量表达的拷贝数，可使工程菌株在摇瓶发酵条件下3-脱氢莽草酸产量提高2.93倍。通过同源重组无痕基因敲除技术依次敲除出发菌大肠杆菌Escherichia coli AB2834的乳酸、乙酸、乙醇等副产物合成途径中的重要基因ldhA、ackA-pta和adhE，可使工程菌株的3-脱氢莽草酸产量进一步提高，达到了1.83 g/L，是初始出发菌株大肠杆菌E. coli AB2834产量的6.7倍。利用5 L发酵罐进行分批补料发酵，62 h后工程菌株3-脱氢莽草酸产量达到了25.48 g/L。本研究可为构建有应用前景的3-脱氢莽草酸生产菌株提供重要参考。

摘要:利用Red重组系统对野生大肠杆菌Escherichia coli磷酸烯醇式丙酮酸?糖磷酸转移酶系统(Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase system, PTS) 进行修饰改造，敲除PTS 系统中关键组分EⅡCBGlc的编码基因 (ptsG)，磷酸组氨酸搬运蛋白HPr的编码基因 (ptsI)，同时敲入来源于运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis的葡萄糖易化体 (Glucose facilitator) 编码基因 (glf)，构建重组大肠杆菌，比较测定并系统评价了基因敲除和敲入对细胞的生长、葡萄糖代谢和乙酸积累的影响。敲除基因ptsG和ptsI造成大肠杆菌PTS系统部分功能缺失，细胞生长受到一定限制，敲入glf基因后，重组大肠杆菌能够利用Glf-Glk (葡萄糖易化体-葡萄糖激酶) 途径，消耗ATP将葡萄糖进行磷酸化并转运进入细胞。通过该途径转运葡萄糖能够提高葡萄糖利用效率，降低副产物乙酸生成，同时能够使更多的碳代谢流进入后续相关合成途径，预期能够提高相关产物产量。

摘要:为了探讨植物激素对三裂叶野葛毛状根生长和异黄酮化合物含量的影响，采用不同浓度的6-苄氨基腺嘌呤 (6-Benzylaminopurine, 6-BA) 或6-BA和萘乙酸 (α-Naphthaleneacetic, NAA) 结合处理三裂叶野葛毛状根，观察其对毛状根生长的影响，然后利用分光光度计测定毛状根中异黄酮化合物含量及抗氧化酶活性。结果表明：6-BA抑制三裂叶野葛毛状根的生长，降低三裂叶野葛毛状根的生物量, 且随着6-BA浓度的增加，其抑制效果愈明显;同时降低其总异黄酮化合物的含量。与对照相比，不同浓度6-BA和NAA 2.0 mg/L结合抑制毛状根的生长，降低毛状根中总异黄酮化合物含量。6-BA和NAA结合能显著提高毛状根可溶性蛋白质含量和过氧化物酶活性，但降低其超氧化物歧化酶活性；单独6-BA处理的毛状根培养至30 d时，可以检测到典型的DNA ladder带，而6-BA和NAA结合处理的毛状根培养至20 d时就可以检测到DNA ladder带，表明6-BA 或6-BA和NAA结合都可以促进细胞程序性死亡的发生，且NAA具有协同作用。

摘要:为在小鼠细胞中表达并研究T-bet功能，首先构建了含有报告基因Thy1.1的小鼠T-bet逆转录病毒载体，并将构建的载体质粒转染病毒包装细胞系包装成重组病毒，再利用重组病毒分别感染NIH-3T3和D9细胞系检测其感染能力。之后，使用该重组病毒感染T-bet敲除小鼠的CD4+ T淋巴细胞，流式细胞术检测T-bet及其下游靶基因Ifng的表达情况。经验证，重组的逆转录病毒感染T-bet敲除小鼠T淋巴细胞后可以在细胞中表达T-bet，并进一步引起下游靶基因Ifng的表达上调，证明本研究中外源表达的转录因子T-bet具有正常功能。综上所述，本实验成功构建了含有报告基因的小鼠T-bet重组逆转录病毒载体，为进一步在小鼠细胞中研究T-bet功能奠定了基础。

摘要:鲎C因子是鲎血细胞中一种对内毒素具有高亲和力的丝氨酸蛋白酶，被内毒素激活后可水解人工合成的三肽底物，因而能替代传统的鲎试剂用于内毒素检测。通过RT-PCR从东方鲎血细胞中扩增出鲎C因子基因 (factor C) 序列，利用Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒表达系统在家蚕幼虫中表达该蛋白，并对其进行活性测定。结果显示：被感染的家蚕血清稀释后能检测到Factor C活性，稀释500倍的血清可以用于内毒素检测，且其灵敏度能达到0.2 EU/mL，有望开发新型的、低成本的内毒素检测试剂。

摘要:文中探讨了稳定同位素代谢标记 (SILAC) 定量技术在哺乳动物模型上的应用，建立了可用于疾病模型比较蛋白质组学研究的定量内标。用含1% 13C6-Lysine的SILAC鼠粮饲养C57BL/6雌性小鼠，记为F0代，通过与雄性小鼠交配繁殖出F1代，相同方法繁殖出F2代标记小鼠。分离F2代小鼠的大脑、肺脏、心脏、胃、小肠、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉组织，提取各组织的全蛋白，进行蛋白酶Lys-C酶切，利用高效液相色谱串联质谱联用技术 (LC-MS/MS) 进行鉴定和定量分析。对蛋白质定量结果进行高斯拟合确定均值及标准差，得出不同脏器和小鼠整体的标记效率，肝脏的标记效率最高，为96.34%±0.90%；大脑标记效率最低，为92.62%±1.98%，小鼠整体标记效率为95.80%±0.64%，符合SILAC标记效率不低于95%的国际标准。成功地将SILAC方法从微生物和细胞系水平拓展到哺乳动物模型，这为基于动物模型研究疾病发生、发展机制提供了有力工具。

摘要:对丹参悬浮培养细胞原生质体制备条件进行了研究，并利用FDA染色和钙离子荧光探针Fluo-3/AM装载对制备得到的原生质体的活力和功能进行了检测。丹参悬浮培养细胞原生质体的制备条件为：悬浮培养细胞酶解的适宜酶液组合为纤维素酶1.5%、果胶酶0.3%，离析酶0.5%；适宜的甘露醇浓度为0.4 mol/L；酶解时间为12 h；在600 r/min转速下离心5 min收集，纯化得到原生质体，其产量为1.1×106/g FW，FDA检测显示其活力为95%以上，荧光探针Fluo-3/AM可成功装载到原生质体中。

摘要:白藜芦醇是一种天然植保素，且具有特殊的药理和保健功能，芪合酶 (Stilbene synthase，STS) 是该化合物生物合成的关键酶和限速酶。白藜芦醇存在于有限几种植物且含量差异很大，虎杖中白藜芦醇含量比葡萄、花生高1 000倍以上，推测不同STS的催化能力有可能是白藜芦醇含量差异的原因之一。为验证上述推测，文中通过overlap PCR技术从葡萄叶片基因组DNA中克隆得到葡萄STS基因，连同前期工作中获得的虎杖STS基因 (PcPKS5)，进行了原核表达分析。诱导表达产物经过Ni2+亲和柱纯化和PD-10柱脱盐后，均得到分子量约43 kDa的可溶性纯化蛋白。酶促产物分析结果表明，两种酶催化产物均为白藜芦醇。酶动力学分析表明，虎杖STS催化效率 (Kcat/Km) 是葡萄STS的2.4倍。文中从植物类型Ⅲ聚酮化合物合酶 (Polyketide synthase, PKS) 超家族催化活性位点和保守位点角度分析了造成上述两种酶活性产生差异可能存在的原因。

摘要:抗凝血酶Ⅲ (AT Ⅲ)是人体内最重要的抗凝血物质，利用转基因技术生产重组人抗凝血酶Ⅲ (rhAT Ⅲ)受到了越来越多的关注，如何有效地将rhAT Ⅲ从转基因羊奶中分离纯化出来是实现其产业化的关键所在。本研究建立了基于等电点沉淀和肝素亲和层析的纯化工艺，实现了rhAT Ⅲ的高效、快速纯化。先用等电点沉淀法，快速去除了占总蛋白50%左右的酪蛋白；然后用肝素亲和层析纯化rhAT Ⅲ，并系统考察了pH值和温度对rhAT Ⅲ稳定性的影响，以及pH值和操作条件 (洗脱梯度、流速和上样量) 对rhAT Ⅲ分离效果的影响。在优化的条件下，rhAT Ⅲ纯度达到99%以上，蛋白收率达到90%，活性收率约为50%。所建立的纯化工艺简单、快速，rhAT Ⅲ收率高，为今后工艺放大提供了重要的依据和参考。

摘要:异养细胞种子/光自养培养方法是一种可异养培养的能源微藻培养的有效方法，但已有文献尚未从工艺优化角度考察其发展潜力。为了获得较高细胞密度的用于光自养培养的种子和提高光自养培养的细胞密度与油脂产率，对异养细胞种子/光自养培养的培养基和培养条件进行了优化。结果表明，采用优化后的培养基，椭圆小球藻在摇瓶中异养培养的最高藻细胞密度可达11.04 g/L，比在原始培养基条件下提高了28.0%，在5 L发酵罐中异养培养的藻细胞密度达到73.89 g/L；在2 L柱式光生物反应器中光自养培养的藻细胞密度、油脂含量和油脂产率分别达1.62 g/L、36.34%和6.1 mg/(L·h)，油脂成分主要为含C16-C18碳链的脂肪酸，是制备生物柴油的理想原料。经过优化，异养细胞种子/光自养培养这一方法能够显著地提高椭圆小球藻产油脂的能力，这进一步表明异养细胞种子/光自养培养方法有望成为可异养的能源微藻的高效培养方式。

摘要:

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