摘要:生物修复技术被认为是氯代烃类污染物处理处置的最有效途径之一，而甲烷氧化菌在该领域表现出较大的应用潜力。近期研究发现，突破了仅能利用单碳化合物的局限，兼性甲烷氧化菌能够利用多种底物降解氯代烃，这一独特的新陈代谢特性，使其在污染物生物处置领域逐渐受到关注。结合本课题组研究成果，对甲烷氧化菌降解氯代烃进行了全面总结，主要包括：分析了不同菌株 (纯菌株和混合菌株) 对不同氯代烃的降解效果；比较了不同类型甲烷单加氧酶在不同底物体系中的活性表达和催化特性；总结了模型菌株甲基弯菌Methylosinus trichosporium OB3b降解氯代烃的动力学特性；概述了兼性甲烷氧化菌株降解氯代烃的特性及其应用潜力；最后讨论了甲烷氧化菌降解氯代烃存在的问题及未来发展方向。

摘要:从海栖热袍菌扩增出编码乳酸脱氢酶的基因并将其插入热激载体pHsh构建表达质粒，在大肠杆菌Escherichia coli中进行表达产生极耐热性乳酸脱氢酶Tm-LDH。基因表达产物通过热处理，可以一步获得接近电泳纯的重组酶。酶学性质研究表明，Tm-LDH的最适反应温度为95 ℃，最适pH 7.0；纯酶在90 ℃的半衰期为2 h，在pH 5.5–8.0之间最稳定；SDS-PAGE结果显示分子量为33 kDa，与理论推算值相吻合。以丙酮酸和NADH为底物时，相对于丙酮酸的Km值1.7 mmol/L，Vmax为3.8×104 U/mg；相对于NADH的Km值7.2 mmol/L，Vmax值为1.1×105 U/mg。Tm-LDH基因在T7载体中未能实现高效表达，但是在热激载体pHsh中得到了可溶性超量表达，表达水平达到340 mg/L。该酶在65 ℃反应条件下，活性达到最高活性的50％，并能保持活性不变，这使该酶能够与常温酶匹配，在辅酶NAD再生体系的建立中具有广泛的用途。

摘要:链霉菌能够产生多种抗生素，具有重要的研究与应用价值。代谢物组学能够定性和定量测定胞内外主要低分子量代谢产物。相对于其他组学，代谢物组学在监控胞内代谢状态、指导物种理性改造方面具有独特优势。本文旨在建立一种快速、准确的链霉菌胞内代谢物分析方法。以模式菌株天蓝色链霉菌为研究对象，基于GC-MS分析平台优化了代谢物组学样品制备流程中的细胞淬灭时间、菌体分离方法、代谢物提取及代谢物衍生化条件，并利用该方法对天蓝色链霉菌不同生长时期各代谢途径的相对活性进行了初步分析。采用“低温淬灭 (–40 ℃，4 min) -快速过滤分离-反复冻融 (45 s/3 min) -衍生化 (40 ℃，90 min)”的流程能够鉴定出中心代谢途径 (糖酵解、戊糖磷酸途径和TCA循环)、氨基酸代谢途径、脂肪酸代谢途径、核酸代谢途径及部分次级代谢途径中的103种主要代谢物。利用该流程测定发现天蓝色链霉菌细胞生长周期中存在显著的代谢时序差异，并且发现氨基酸与脂肪酸代谢在衔接初级代谢与次级代谢生物合成中具有重要作用。本研究建立的测定方法能够有效地用于天蓝色链霉胞内代谢物分析，该方法将有助于深入刻画链霉菌细胞代谢过程，为菌株代谢工程改造增加次级代谢产物产量提供理性指导。

摘要:PopW是克隆于青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum ZJ3721中的一种新的编码harpin蛋白的基因，原核表达的PopW蛋白能够诱导烟草对TMV的抗性、促进烟草生长、提高烟草品质。将popW基因连接到植物表达载体pBI121上，构建成重组转基因载体pB-popW，通过冻融法转化根癌土壤杆菌EHA105，获得阳性转化子。再采用叶盘法转化三生烟Nicotiana tobacum cv. Xanthi nc.，经卡那霉素抗性筛选、PCR检测、RT-PCR分析获得21个株系的T3代阳性植株。PCR及RT-PCR检测结果表明popW基因已经整合到烟草基因组中，并在转录水平正常表达。GUS染色进一步证明popW基因在翻译水平上进行了表达，且不同株系之间表达存在差异。对烟草花叶病毒 (TMV) 的抗病性测定结果表明，转基因烟草对TMV的抗病性增强，防效最高达54.25%。转基因烟草在生长上也具有一定优势，生长15 d的根长最高为野生型的1.7倍，移栽后60 d的株高、鲜重、干重最高分别为野生型烟草的1.4、1.7和1.8倍。

摘要:为了提高烟草的烟碱含量，采用发根农杆菌遗传转化和人工染色体加倍技术，进行了烟草毛状根及其多倍体诱导、植株再生及其烟碱含量测定。结果表明，发根农杆菌ATCC15834感染烟草叶片外植体8 d后产生白色毛状根，15 d后所有叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源激素的 MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C 基因以及冠瘿碱合成酶基因已在烟草毛状根基因组中整合并得到表达。烟草毛状根多倍体诱导的最适条件为0.1%的秋水仙素溶液处理36 h，其多倍体诱导率为64.71%。经秋水仙素加倍的烟草毛状根多倍体植株再生的最适宜培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。与对照 (二倍体非转化植株) 相比，烟草二倍体毛状根再生植株的顶端优势减弱，腋芽增多，叶片变窄；而烟草毛状根多倍体再生植株茎更粗，节间变短，叶色更深，叶片的宽度和厚度均较对照明显增大。根尖细胞染色体压片观察证实，所获得的烟草毛状根多倍体再生植株为四倍体，其根尖细胞染色体数约为4n=96。盆栽实验表明, 烟草二倍体毛状根植株和多倍体毛状根再生植株比对照植株延迟约 21 d开花。GC-MS检测表明，烟草毛状根多倍体再生植株的烟碱含量比对照及二倍体毛状根再生植株显著提高，分别约为对照及二倍体毛状根再生植株的6.90倍和4.57倍。

摘要:旨在利用毕赤酵母分泌表达gp96-scFv抗体，纯化后得到能特异性结合gp96抗原的小分子抗体片段(scFv)。根据gp96-scFv抗体基因序列，合成gp96-scFv抗体基因序列，将gp96-scFv抗体序列克隆到毕赤酵母表达质粒pPICZα-A，线性化的重组表达载体电转化到毕赤酵母X33，甲醇诱导目的蛋白表达，通过亲和层析法纯化目的蛋白，并以SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。通过Western blotting、Immunofluorescence、ELISA、FACS方法对gp96-scFv抗体的生物活性进行了检测。结果成功地构建了分泌表达抗gp96蛋白scFv抗体的毕赤酵母菌，每升毕赤酵母菌培养上清经纯化可获约50 mg gp96-scFv抗体，所获抗体其分子量大约为15 kDa，具有与gp96抗原特异性结合的活性。本研究通过毕赤酵母菌成功表达了gp96-scFv抗体，生物活性Western blotting、Immunofluorescence、ELISA、FACS分析表明该抗体能特异性结合gp96。

摘要:毛囊来源的神经嵴干细胞 (Epidermal Neural Crest Stem Cell, EPI-NCSC) 由于取材方便，具有多种分化潜能，是一种具有良好应用前景的组织工程种子细胞。目前，在神经损伤修复领域中，EPI-NCSC主要被应用于脊髓损伤的修复。为了探讨 EPI-NCSC对周围神经缺损的修复作用，对原代培养的GFP-SD大鼠来源的EPI-NCSC的体外性质进行了考察，并以其为种子细胞，将其等量与细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)混合后，预置入聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(Poly lactic acid co glycolic acid copolymer, PLGA)导管中，同时，以等量的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(Dulbecco's Modified Eagle's medium, DMEM)代替EPI-NCSC作为对照，以用于修复大鼠坐骨神经10 mm距离的缺失。噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色分析结果显示，EPI-NCSC在PLGA膜上的初期粘附率为89.7%。在第1、3、5、7天细胞相对增殖率分别为89.3%、87.6%、85.6%和96.6%。细胞周期与DNA倍体分析表明，与PLGA共培养的EPI-NCSC与单独培养的EPI-NCSC相比较，二者的细胞周期变化趋势相同，增殖指数变化趋势也相同。在神经导管移植4周，术部实现了组织学水平的修复。大鼠手术一侧后肢感觉功能有所恢复，坐骨神经指数有所提高。研究结果表明，在PLGA导管中预置EPI-NCSC，有望实现较好的周围神经缺损的修复效果。

摘要:MagaininⅡ是非洲爪蟾皮肤分泌的一种抗菌肽，在低浓度下即能够对细菌、真菌、原虫、肿瘤等都具有杀伤作用，并且与同是来源于非洲爪蟾皮肤的另一种抗菌肽PGLa在杀菌、抗肿瘤等方面具有很好的协同效应。文中分别按照大肠杆菌和毕赤酵母的密码子利用频率，对抗菌肽magaininⅡ以及杂合抗菌肽magainin Ⅱ-PGLa，进行了密码子优化。构建了高效表达抗菌肽magaininⅡ的原核表达载体，经过蛋白酶切割获得纯化的抗菌肽magaininⅡ。同时进一步构建了杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa的分泌型毕赤酵母表达载体，实现了杂合抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达。本研究为magaininⅡ和magaininⅡ-PGLa的生产与应用奠定了基础。

摘要:重组杆状病毒感染昆虫细胞是表达外源蛋白常用的一种方法。为有效鉴定转染的细胞中是否产生了重组病毒粒子，对质粒pFastBacI进行改造，构建了极早期基因ie1启动子控制的绿色荧光蛋白egfp基因表达盒，以及多角体基因启动子控制的外源DNA的一个通用型双表达载体；通过酶切、连接的方式，将家蚕二分浓核病毒ns1基因连接到多角体启动子下游；在转座酶的介导下，该供体质粒上部分序列可转座到穿梭载体Bm-Bacmid上，进而构建可同时表达egfp和ns1基因的重组杆粒。将构建的该重组杆粒DNA转染BmN细胞，通过观察可视化的绿色荧光信号，可迅速判定转染后的细胞中重组病毒粒子产生的情况，收集转染后的细胞培养上清，将其感染BmN细胞，对感染4 d后的细胞总蛋白进行Western blotting分析，结果表明能杂交到一条36 kDa大小的特异蛋白，表明NS1蛋白成功获得了表达，进而为深入研究ns1基因的功能奠定了基础。

摘要:PAC1是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP)的特异受体，属于B族G蛋白偶联受体，介导PACAP的神经递质、神经调质、神经保护、抗神经损伤及调控神经再生等功能，PAC1高表达和神经损伤、肿瘤等生理病理过程密切相关。为了深入了解PAC1的功能，构建PAC1可调控表达的细胞系，通过优化的四环素控制表达系统实现PAC1在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞的强力霉素(doxycycline，Dox)依赖的可控表达。首先通过双酶切将编码PAC1和增强型黄色荧光蛋白(EYFP, enhanced yellow fluorescent protein)的融和基因PAC1-EYFP克隆到pTRE-Tight载体上，获得重组载体pTRE-PAC1-EYFP；基因测序鉴定正确后将新型的四环素调节元件载体pTet-on advanced和反应元件载体pTRE-PAC1-EYFP分别转入CHO细胞中，G418和潮霉素(Hygromycin)双抗筛选阳性克隆PAC1-Tet-CHO，使用梯度浓度四环素类似物强力霉素Dox 诱导PAC1-EYFP表达，48 h后检测受体表达水平，并通过MTT法检测不同PAC1表达水平的细胞增殖活性。荧光检测和Western印迹结果显示，成功获得了具有良好诱导性的Dox依赖的PAC1可控表达的细胞系，这些细胞株在传10代后仍能稳定地可控表达PAC1。MTT结果显示PAC1表达水平越高，细胞增殖活性越强。成功所构建的Dox依赖的PAC1可控表达细胞系，为PAC1的生物学功能的深入研究奠定了基础。

摘要:鼠脑驱动蛋白是一类利用ATP水解释放的能量在微管系统上高连续性运动的常规驱动蛋白。了解ATP水解的化学能如何转化为机械动能是驱动蛋白研究中的重大课题。为此，鼠脑驱动蛋白单体 (rK354) 的晶体通过浸泡的方式引入ATP的结构类似物AMPPNP。rK354-AMPPNP复合物和rK354-ADP复合物结构的比较，揭示了开关区域Ⅱ的Glu237起连接ATP的γ-磷酸和驱动蛋白微管结合区的枢纽作用。

摘要:成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21) 作为近期发现的新型代谢调节因子，因其具有独立于胰岛素调节糖脂代谢、增加胰岛素敏感性等作用，有望成为治疗糖尿病的新型药物。包涵体形式表达外源蛋白表达量及纯度高，但是以pET载体表达时，FGF-21以包涵体形式表达，且复性率及产率低，蛋白活性降低[1]。针对这一瓶颈问题，用SUMO载体首次以包涵体形式表达带有SUMO标签的hFGF-21，通过优化培养条件，并应用中空纤维柱膜过滤技术对菌体进行富集，对包涵体进行洗涤、变性及复性，经过亲和层析、凝胶过滤层析的纯化方法，得到了成熟的hFGF-21，在保证蛋白活性的同时增加了蛋白的产量及纯度。通过检测HepG2细胞葡萄糖吸收及2型糖尿病db/db小鼠短期及长期血糖变化鉴定其降糖生物学活性。结果表明，以包涵体形式表达hFGF-21 (ihFGF-21) 的表达量是可溶形式表达的hFGF-21 (shFGF-21) 的3倍，最终ihFGF-21的收率为20 mg/L，而shFGF-21的收率仅为6 mg/L。ihFGF-21的纯度可达到95%以上，而shFGF-21仅能达到90%左右；在细胞水平和动物水平上两者的降糖生物学活性一致。在保证hFGF-21生物学活性的前提下，与传统包涵体途径提取目的蛋白的方法相比，应用中空纤维柱膜过滤技术使hFGF-21的生产周期缩短了约1/3左右。综上所述，此法为FGF-21中试及工业化生产提供了高效、经济的策略。

摘要:染色体整合表达可获得稳定遗传的基因工程菌，是工业酿酒酵母育种的重要手段。pAUR135整合载体是抗生素标记基因可循环使用的载体，添加特定的同源臂后可构建在酵母染色体上稳定遗传的菌株。目前对酵母菌的分子育种常需要对多个基因进行过表达，利用pAUR135载体可将不同基因分别整合在不同染色体或相同染色体的不同位点，这种组合整合表达方法可对不同基因的表达强度比例进行调节，构建表型优化的工业酿酒酵母菌株。本研究以木糖代谢途径基因为例，构建了3个pAUR135整合载体，将3个木糖代谢基因依次整合到工业酿酒酵母染色体的不同位点，获得了染色体组合整合表达的代谢工程菌株。与将这3个基因整合在同一个位点的对照重组菌株相比，染色体组合整合的重组菌株木糖利用率提高了24.4%–35.5%。多基因染色体组合整合方法从新的角度对工业酵母进行代谢工程改造，所获得的工程菌株不带有任何外来基因和选择标记，可以保持性状的稳定，是工业酿酒酵母分子育种的新方法。

摘要:黄杆菌肝素酶Ⅱ (HepⅡ) 是一类可特异性切割肝素、乙酰肝素类分子内连接键的酶。文中对黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌的诱导时机、诱导剂添加量、诱导温度、诱导时间等诱导产酶条件进行优化。经过优化最佳摇瓶发酵产酶条件为：37 ℃ 培养重组菌至对数生长前期，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.3 g/L，20 ℃下诱导10 h，酶活达到最高，为570 U/L。在此基础上通过发酵罐高密度培养手段将菌体浓度OD600进一步提高到98，酶活大幅度提高到9 436 U/L，该研究结果为HepⅡ的工业化生产与应用奠定了良好的基础。

摘要:为开发一种适合龟裂链霉菌13C代谢通量分析的合成培养基，以龟裂链霉菌模式菌株M4018为研究对象，比较其在各种有机氮源和无机氮源的生长和土霉素合成特性。首次筛选到以硝酸钾为主要氮源的合成培养基，通过响应面分析法进一步优化，将土霉素合成能力由75.2 mg/L提高到145.6 mg/L。并应用到100%的1-13C葡萄糖标记实验，首次从同位素标记代谢流分析上证实了龟裂链霉菌中不存在2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸裂解途径 (Entner-Doudoroff pathway, ED)，为龟裂链霉菌13C代谢通量分析提供了重要基础。

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