摘要:随着高通量测序技术的快速发展，可以快速地通过基因组尺度的序列比较，来全面、系统地探讨工业生产菌株和实验室优良菌株的遗传基础，分析基因型-表型之间的关系；同时结合准确的基因组修饰技术，完成基于全基因组突变分析的逆向代谢工程。近年来，基于全基因组突变分析的逆向代谢工程已经成功地应用于微生物优良菌株选育，成为了研究的前沿和热点。综述了近几年逆向代谢工程发展的研究方法，突变型-表型相关性分析，逆向代谢工程的最新进展及其应用，并讨论其面临的问题及挑战。

摘要:羧酶体 (Carboxysome) 是高效的固碳微体，在CO2浓缩机制 (CO2-concentrating mechanism，CCM) 中发挥重要作用。在蓝藻及某些化能自养菌中，羧酶体作为类细胞器包裹1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶 (RubisCO) 和碳酸酐酶 (Carbonic anhydrase，CA)，它与无机碳转运蛋白共同在胞质中积累HCO3–，通过增加RubisCO周围的CO2浓度来提高固碳效率。随着羧酶体结构和功能的阐明，异源表达羧酶体已成功实现，并且已鉴定出编码羧酶体壳蛋白及内部组分的基因。首先简要介绍羧酶体的发现和种类，然后系统分析其结构及在CCM机制中的作用，并对其在代谢工程上的广阔应用前景进行了展望。

摘要:抗菌肽作为新一代抗生素的潜在应用价值使其备受关注，大量高纯度的抗菌肽是开展基础及临床实验的关键。天然来源的抗菌肽资源有限、纯化困难，化学合成抗菌肽成本高、活性不稳定，因此通过基因重组表达得到大量抗菌肽是低成本、高效益的方法。目前采用大肠杆菌表达系统获得抗菌肽已成为研究者的首选，通常以形成融合蛋白的方式表达，这不仅可避免抗菌肽对宿主的杀伤作用，也保护了抗菌肽免受蛋白酶降解。文章结合课题组的研究工作，综述了近年来抗菌肽在大肠杆菌中表达的融合载体、融合蛋白的裂解方法及表达条件优化的研究进展。

摘要:为了构建一种高效、通用的细胞永生化载体pTP-hTERT，通过人工合成、PCR、酶切连接等方法，对传统piggyBac (PB) 转座子系统进行改造。改造后的载体含有转座必需元件、PB转座酶 (PBase) 表达框、共表达筛选元件和人端粒逆转录酶 (hTERT) 基因表达框。其中筛选元件中绿色荧光蛋白 (EGFP)基因和嘌呤霉素抗性 (Puror) 基因以猪捷申病毒2A自我剪切肽相连，以实现共表达。为验证载体元件功能，使用该载体转染HEK 293细胞，并对筛选出的阳性细胞进行RT-PCR、Western blotting (WB)、热不对称PCR (Tail-PCR) 和细胞克隆亚甲蓝染色与统计分析。载体测序鉴定与细胞培养结果表明，通用型永生化载体 pTP-hTERT构建成功，转染HEK293细胞后能筛选出抗嘌呤霉素细胞单克隆；WB结果显示P2A可高效切割EGFP和Puror融合蛋白，证明筛选标记基因功能正常；Tail-PCR结果表明该载体以转座整合插入宿主基因组；亚甲蓝染色统计结果显示由pTP-hTERT引发的细胞阳性克隆数与对照组相比显著提高 (P<0.01)。PB转座子永生化载体pTP-hTERT的构建为永生化细胞系的建立提供了工具，同时也为其他真核载体的构建和改造提供了参考。

摘要:β-胡萝卜素属于类胡萝卜素家族的一员，在药品、保健品、化妆品和食品行业有广泛的应用。本研究通过用RBS文库对重组大肠杆菌CAR005中β-胡萝卜素合成途径的关键基因dxs、idi和crt操纵子进行调控来提高β-胡萝卜素合成能力。研究发现3个基因分别用RBS文库调控后，与起始菌株相比β-胡萝卜素产量最高分别有7%、11%和17%的提高，表明使用RBS文库调控比使用多个固定强度启动子调控能筛选到更有利于目标产品合成的基因表达强度。三基因组合调控后，β-胡萝卜素产量相对于CAR005菌株提高了35%。同时发现，单基因文库筛选到的最优强度对于组合调控来说，未必是最优强度。本研究为利用基因表达调控优化目标产物合成途径提供了一种新的方案。

摘要:β-胡萝卜素在食品、药品和化妆品领域有广泛用途。为获得生产β-胡萝卜素的微生物细胞工厂，本研究首先在酿酒酵母BY4742中过表达甲羟戊酸 (MVA) 途径的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 (HMGR) 基因及二萜化合物合成的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 (GGPS) 基因，来提高牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸 (GGPP) 的供给。在酿酒酵母底盘菌BY4742-T2的基础上整合来源于成团泛菌和红法夫酵母的β-胡萝卜素合成基因，比较酿酒酵母工程菌生产β-胡萝卜素的差别。结果表明提高酿酒酵母中HMGR和GGPS酶基因的表达能将工程菌中β-胡萝卜素的产量提高26.0倍。另外，来源于真核生物红法夫酵母的合成基因相比成团泛菌，更有利于酿酒酵母生产β-胡萝卜素。最终获得的酿酒酵母工程菌BW02能生产1.56 mg/g干细胞重的β-胡萝卜素，为进一步获得高产β-胡萝卜素细胞工厂提供基础。

摘要:耐热的木聚糖酶具有用于造纸、麻类脱胶和饲料生产等工业领域的巨大潜力，为了提高11家族碱性木聚糖酶Xyn11A-LC的热稳定性，通过理性设计在N-末端引入了芳香族氨基酸 (T9Y和D14F)。测定野生型和突变体的性质表明，突变体的最适反应温度和热稳定性均获得了提高。突变体的最适反应温度比野生型提高了5 ℃。野生型在65 ℃的Tris/HCl缓冲液 (pH 8.0) 中的半衰期为22 min，而突变体在此条件下的半衰期为106 min。圆二色光谱测定结果显示野生型和突变体的Tm分别为55.3 ℃和67.9 ℃。因此，通过在N-末端引入芳香族氨基酸可以提高11家族木聚糖酶的热稳定性和在高温下的活性。

摘要:水母雪莲为中国传统名贵中药，具有散寒除湿、活血通经、抗炎、镇痛等功效，其主要药用成分为类黄酮化合物。以水母雪莲白色系愈伤组织和经低温、高糖、强光诱导得到的红色系为材料，比较不同细胞系中类黄酮活性成分、结构基因和转录因子表达的差异。结果表明，红色系中总黄酮含量为白色系的3.60倍；重要的药用成分为芦丁，其含量达到干重的0.25%，是白色系的2.40倍；红色系中花青苷含量极高，矢车菊素3-O-己糖苷和矢车菊素3-O-琥珀酰己糖苷的含量分别达到干重的0.12%和0.19%；红色系中CHS、F3'H、FNS、FLS、DFR和ANS基因的表达均明显高于白色系；红色系中转录因子MYB、bHLH和WD40的表达也均明显高于白色系，其中MYB的表达量为白色系的19.70倍，说明红色系中转录因子的高水平表达增强了结构基因的表达，进而提高了类黄酮的合成。红色系中bHLH和WD40表达水平相似，而与MYB的表达水平相差很大，推测可能在水母雪莲中bHLH和WD40两种转录因子形成二元复合体后，和MYB共同调控类黄酮合成途径中结构基因的表达。

摘要:为了提高药用植物广藿香的次生物质广藿香醇含量，采用秋水仙素人工诱导染色体加倍技术，进行了广藿香毛状根多倍体诱导及其植株再生、倍性鉴定和挥发油组分广藿香醇含量的测定。结果表明，广藿香毛状根多倍体诱导的最佳条件为0.05 %秋水仙素处理36 h，其多倍体诱导率可达40%以上；经秋水仙素加倍的广藿香毛状根在MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中培养60 d后可获得毛状根多倍体再生植株。与对照 (二倍体植株) 相比，广藿香毛状根多倍体再生植株根系更发达、茎更粗、节间变短、叶片的长度、宽度和厚度均较二倍体明显增大。根尖细胞染色体压片观察证实，所获得的广藿香毛状根多倍体再生植株为四倍体，其根尖细胞染色体数约为128；同时，其叶片的气孔保卫细胞体积及其叶绿体数目均约为对照的两倍；但其气孔密度则随着倍性增加而下降，二倍体植株叶片的气孔密度约为四倍体植株叶片的1.67倍。GC-MS测定结果表明，广藿香毛状根多倍体再生植株的广藿香挥发油组分广藿香醇的含量为4.25 mg/g 干重，约为二倍体植株的2.30倍。该结果证实毛状根多倍体化可提高药用植物广藿香的广藿香醇含量。

摘要:旨在利用细胞穿膜肽TAT的穿膜作用和细胞珠蛋白 (Cytoglobin, Cygb) 的抗衰老、抗纤维化的功能，将二者通过基因工程的手段融合在一起，以期获得能够穿透细胞屏障的Cygb。通过两次重叠PCR技术获得了TAT-Cygb DNA，将其插入原核表达载体pET22b质粒中，转化至大肠杆菌BL-21, 筛选出可表达TAT-Cygb融合蛋白的大肠杆菌工程菌株。经乳糖诱导表达TAT-Cygb，CM阳离子交换层析 (CM Sepharose Fast Flow Protocol) 获得纯度高达95%的TAT-Cygb融合蛋白，分子量约23 kDa。生物活性实验显示，TAT-Cygb过氧化物酶比活力达到(422.30±0.36) U/mg。TAT-Cygb预处理的Hacat细胞可免受H2O2氧化应激的损伤 (RGR=100%)，同时TAT-Cygb可治疗已被H2O2氧化损伤的细胞 (RGR=98%)，与Cygb处理组相比具有显著差异 (RGR=79%)。该研究首次成功利用大肠杆菌表达系统表达了可穿透细胞膜的、有生物活性的TAT-Cygb融合蛋白，为继续开展Cygb在抗衰老、抗纤维化和抗癌领域的研究奠定了基础。

摘要:为建立一种适用于生物制药工业和基因治疗领域的基因表达调控系统，构建枯草芽胞杆菌生物素连接酶 (BS-BirA) 与转录激活结构域的融合蛋白，以其表达载体为调控载体；在弱化的CMV启动子上游连接BS-BirA特异的操纵子序列，获得响应载体，从而得到响应于生物素的真核基因表达调控系统BS-Biotin-On。以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 为报告基因对该系统进行考察，结果表明，与现有的类似调控系统相比，该系统具有良好的诱导率；可通过调节培养体系中生物素的浓度，实现对目的基因表达水平快速、较高效的调节。上述结果表明，BS-Biotin-On系统可能为外源基因的调控表达提供新的选择。

摘要:基因克隆作为一种常规技术被广泛应用于DNA及蛋白质的研究。在传统的基因克隆中，一般利用限制性内切酶对DNA片段进行消化，然后使用DNA连接酶完成连接，因此这种方法受到插入片段和载体酶切位点的限制。一些ligase-free 克隆技术虽然克服了酶切位点的限制，但费时费力，成本较高。为了弥补其他ligase-free技术的不足，文中介绍了一种新的利用核酸外切酶Ⅲ进行ligase-free克隆的方法，反应时间仅需要30 min，提高了克隆效率并有效降低经济成本，有利于大规模基因克隆的应用。

摘要:影响类弹性蛋白多肽 (ELPs) 自组装成微球的因素较多，目前尚缺乏系统研究。以类弹性蛋白多肽[KV8F]n为对象，利用动态光散射仪测定了不同条件下其自组装成微球的粒径。结果表明：随着分子量的增加ELPs形成的微球粒径也随之增大，粒径的均一度减小；当盐浓度低于0.4 mol/L时，盐浓度的增加，微球粒径相应增加，而盐浓度高于0.4 mol/L则呈减少的趋势，但粒径均大于1.1 μm；而当ELPs末端融合木聚糖酶和1,3-丙二醇氧化还原酶后，其自组装形成的微球粒径急剧减小，约为游离ELPs的1/10，分别为151.0 nm和 174.2 nm。导致这种现象的原因可能是酶分子和ELPs通过静电引力相互作用后，酶分子的空间位阻妨碍了ELPs分子的聚集。

摘要:基于重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法建立特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法。优化设计合成溶葡球菌酶序列，构建重组表达载体pQE30-Lys，转化至大肠杆菌M15并诱导表达，镍柱纯化得到目的蛋白。利用重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法特异定量检测金黄色葡萄球菌并与平板计数对比。成功表达了重组溶葡球菌酶，并建立了特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法，与平板计数具有显著线性关系。本研究建立的将重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法相结合的检测方法操作快捷简单，具有良好的应用前景。

摘要:蛋白激酶D (Protein kinase D, PKD) 是一种新的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族和甘油二酯 (Diacylglycerol, DAG) 受体，参与细胞内多种生理生化过程。为获得高纯度的PKD1的催化结构域 (PKD1-cat) 用于晶体学结构的研究，将带有GST标签的PKD1-cat基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中，构建了重组质粒。将重组质粒转化到含穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞中，转座后获得了含目的基因GST-PKD1-cat的重组Bacmid。重组Bacmid DNA转染Sf9昆虫细胞后，获得重组杆状病毒并扩毒。将毒种以5 PFU/cell的感染复数感染悬浮培养的T.ni昆虫细胞，SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物。结果显示，表达产物在分子量约68 kDa处有一特异条带可与GST单克隆抗体发生反应。经谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化和 PreScission Protease 切除GST标签后，得到了纯度很高的分子量约42 kDa的目的蛋白PKD1-cat。体外PKD激酶活性实验结果显示，随着PKD1-cat浓度的增加，激酶活性增高。这些结果显示截短的重组PKD1-cat有很高的催化活性和纯度，为采用核磁共振或晶体学方法解析PKD1-cat的三维结构奠定了基础。

摘要:赖氨酸脱羧酶 (Lysine decarboxylase, LDC) 是抗老年痴呆药——石杉碱甲生物合成的第一个酶。为了研究蛇足石杉中LDC的特性和功能，以其总RNA为模板，通过RT-PCR扩增得到2个赖氨酸脱羧酶基因LDC1和LDC2，克隆至pMD?19-T中测序发现，两基因同源性为95.3%，分别编码212和202个氨基酸。将两基因引入pET-32a(+)构建重组表达质粒pET-32a(+)/LDC1和pET-32a(+)/LDC2，分别转入BL21(ED3)中进行诱导表达，在30 ℃条件下获得可溶性表达产物Trx-LDC1和Trx-LDC2；采用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白，建立酶促反应体系分析其脱羧酶活性，薄层层析 (TLC) 检测表明重组融合蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2均能催化赖氨酸脱羧生成尸胺。利用生物信息学软件分析发现LDC1和LDC2理化性质存在差异，但预测的二级结构和三维结构基本一致。

摘要:为研究不同生理环境对蛛丝蛋白组装及成丝的影响，首次以MiSp序列为对象，研究其NTR1SR2CT重组模块在不同种类 (浓度) 盐离子条件下的聚集和成纤维特性及其在成纤维过程中二级结构的变化。基于大腹园蛛MiSp全长序列构建NTR1SR2CT模块，并在大肠杆菌Escherichia coli BL21中成功表达。借助8 mol/L尿素裂解包涵体进行变性纯化得到NTR1SR2CT重组蛋白。NTR1SR2CT重组蛋白二级结构主要为无规则卷曲 (Random coil) 或α螺旋 (Helix)，在自然成丝及冻干过程中部分random coil或helix转变为β折叠 (β-sheet)，甲醇能促进该转变过程。另外，钾离子和磷酸根离子有利于NTR1SR2CT重组蛋白聚集从而促进丝纤维的形成。研究结果为成丝机理研究奠定了基础，同时也为工业化生产高品质的蛛丝纤维提供了条件。

摘要:利用L-谷氨酸氧化酶 (LGOX)，对酶法转化L-谷氨酸生产a-酮戊二酸 (a-KG) 的工艺条件进行了研究。首先对野生菌链霉菌Streptomyces sp. FMME066进行亚硝基胍诱变，获得一株遗传性状稳定的突变株Streptomyces sp. FMME067；突变株在最优培养基 (g/L)：果糖10，蛋白胨7.5，KH2PO4 1，CaCl2 0.05条件下，LGOX酶活为0.14 U/mL。LGOX的生化特征为最适pH 8.5、温度35 ℃，Mn2+是激活剂。对LGOX转化L-谷氨酸生产a-KG的条件进行优化，在最优条件下转化24 h，a-KG产量为38.1 g/L，转化率为81.4%。研究结果为开发LGOX酶法转化生产a-KG的工业化奠定了坚实的基础。

摘要:

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