摘要:CRISPR/Cas9 (Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)是最近发现的一种新型的基因组定点编辑技术。CRISPR即成簇的、有规律的、间隔短回文重复序列，是人们在研究大肠杆菌编码的碱性磷酸酶基因时发现的，它原本是存在于细菌和古细菌基因组中含有多个短重复序列的基因位点，能够为自身提供一种特异性免疫保护机制，抵御外来病毒、质粒等遗传元件的入侵。CRISPR系统主要依赖crRNA (CRISPR RNA) 和tracrRNA (Trans-activating chimeric RNA) 结合并导向Cas (CRISPR-associated system) 蛋白来对外源DNA进行序列特异性降解。目前已经发现了3种类型的CRISPR/Cas系统：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅱ型系统组分较为简单，主要依赖的是Cas9核心蛋白，在RNA的介导下，Cas9蛋白能够识别靶序列进行切割造成DNA的双链断裂 (Double-strand breaks，DSB)。在此基础上，人们可以对基因组的特定位点进行基因打靶、基因定点插入、基因修复等各种遗传操作。这种新的基因组定点编辑技术比类转录激活因子效应物核酸酶 (Transcription activator-like effector nuclease，TALEN) 和锌指核酸酶 (Zinc-finger nuclease，ZFN) 技术设计更加简单、更容易操作，势必会有更广泛的应用。目前，利用该技术已在多个物种的细胞和个体水平上实现了遗传操作。文中将从CRISPR/Cas9的来源、结构、作用机理方面介绍其研究进展，为开展这一领域的研究工作提供参考。

摘要:枯草芽胞杆菌作为一般认为安全 (GRAS，Generally recognized as safe) 菌株，被广泛应用于饲料、食品、生物防治等领域，同时，枯草芽胞杆菌作为表达宿主在工业酶的应用中扮演重要角色。然而，低效的芽胞形成率与感受态效率极大限制了枯草芽胞杆菌的应用潜力。尽管已有大量关于芽胞形成与感受态形成的分子遗传机制的研究报道，但是通过遗传改造提高枯草芽胞杆菌芽胞形成率与感受态效率的研究报道并不多。可能的原因是芽胞形成与感受态形成作为枯草芽胞杆菌生长后期两个主要的发育事件，受胞内复杂的遗传调控机制操纵，且两个遗传通路之间存在相互调控关系，对遗传改造工作形成挑战。随着基因工程与代谢工程研究的不断发展，积累了大量关于细胞生长、代谢与发育等方面的遗传信息，通过综合这些遗传信息构建细胞遗传调控网络，用于指导生产实践，已经成为当前研究的热点之一。基于此，本文简要概述了枯草芽胞杆菌芽胞形成和感受态形成的遗传通路，初步探讨了芽胞形成与感受态形成之间的遗传调控网络，及细胞在生长后期的遗传决定机制，并讨论了该遗传调控网络对枯草芽孢杆菌及其近缘种应用研究的指导作用。

摘要:开花是植物从营养生长转换为生殖生长的生理发育过程，受光周期、温度、激素、年龄等多个因素诱导，在植物生长和物种进化中处于核心地位。综合不断更新的开花分子遗传结果，将植物响应各种内源和外源信号启动开花的途径归纳为：经典的光周期途径、春化途径、自主途径、赤霉素途径和较新的年龄途径共5条。旨在描绘出这些不同途径间既独立又相互影响的复杂网络关系，为进一步探索和阐述更多植物的开花分子机理提供借鉴与参考。

摘要:血管生成素样蛋白 (Angiopoietin-like proteins, Angptls) 是与脂类、葡萄糖、能量代谢和血管生成密切相关的蛋白质家族，现已发现8个成员，因其在代谢调控和动物辅助选育方面发挥有重要作用而备受研究人员的关注。以下综述了该蛋白家族的结构、介导的信号通路、上游调控基因及代谢网络等方面，并结合课题组研究工作对其应用于动物育种领域的现状和问题进行了分析，对前景作了展望。

摘要:我国鸭甲型肝炎病毒 (DHAV) 的快速变异及广泛流行给养鸭业造成了较大的经济损失，为研究鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗 (DHAV-SH和DHAV-FS株) 的制备和评价方法，首先对我国多个鸭场进行血清型流行病学分析，从201株DHAV-1、38株DHAV-3中筛选出6株毒力较强的DHAV，验证了DHAV-1和DHAV-3为我国流行优势株，并对6株DHAV进行ELD50和LD50测定，筛选疫苗候选株后经传代确定疫苗毒种，选取F5代鸭胚胚体研磨液作为疫苗毒种，经甲醛灭活后制成3批水包油包水 (W/O/W) 型乳剂二价灭活疫苗实验室制品。通过安全性试验、抗体中和试验、攻毒保护及免疫交叉保护试验发现：疫苗安全性良好，雏鸭免疫后第7天可以检测到DHAV中和抗体，第14?21天的攻毒保护率为90%?100%，免疫持续期可达5周以上，DHAV-SH和DHAV-FS之间的交叉保护为20%?30%。研究表明本试验研制的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗实验室制品安全且高效，为我国DHAV预防和控制提供了一种新方法和新产品。

摘要:构建分枝杆菌表达载体pMTac并在分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12中加强表达甾醇降解过程中的关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶 (KSDD) 以提高雄甾-1,4-二烯-3,17-二铜 (ADD) 的产量。将pMF41的启动子pACE替换成tac启动子构建载体pMTac，在分枝杆菌中分别表达报告基因绿色荧光蛋白 (GFP) 和关键酶KSDD，通过GFP亮度和KSDD酶活验证tac启动子在M. neoaurum JC-12中的效果，并发酵验证加强表达KSDD对产物ADD的影响。荧光显微照片表明两个载体均能在M. neoaurum JC-12表达GFP，但tac启动子的效果比pACE强。酶活测定结果为重组菌M. neoaurum JC-12/pMTac-ksdd破碎细胞上清液中KSDD酶活比原始菌提高了6.53倍，比M. neoaurum JC-12/pMF41-ksdd提高了4.36倍。摇瓶发酵显示重组菌M. neoaurum JC-12/pMTac-ksdd ADD的产量比原始菌提高了22.2%，由4.86 g/L提高到5.94 g/L，而AD的产量由0.92 g/L减少到0.17 g/L，降低了81.5%；与M. neoaurum JC-12/pMF41-ksdd比，ADD产量提高了12.7%，AD降低了71.2%。以20 g/L植物甾醇为底物，5 L发酵罐中重组菌M. neoaurum JC-12/pMTac-ksdd的ADD产量达到 10.28 g/L。结果表明，构建的新型表达载体pMTac适用于在M. neoaurum JC-12中加强表达关键酶KSDD，而且在M. neoaurum JC-12中过量表达KSDD有助于ADD产量的提高，为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。

摘要:为构建一种能够特异性检测镉离子的大肠杆菌荧光报告菌株，本研究通过对检测元件模式和荧光蛋白的筛选后，以蓝色荧光蛋白mTagBFP2基因作为报告基因，使用双启动子模式，构建融合报告载Pmer::merR-m-Pmer::mTagBFP2-pMD19-T。然后将报告载体转化至E. coli MC4100菌中，构建特异性检测镉离子的微生物传感器，并对此微生物传感器进行了最佳培养基、起始诱导浓度和时间、最适检测范围等相关参数的确定，以及对特异性进行了测定。研究表明，此微生物传感器检测镉离子背景信号低，选定起始菌液浓度为OD600=0.1，于IHMM培养基中诱导2 h为最佳检测条件，检测镉离子线性浓度范围为0.1?75 μmol/L，并且只对Cd2+响应，特异性较高。因此，本研究成功构建了能够特异性检测镉离子的生物传感器，为重金属微生物传感器的优化研究工作提供了有用方案。

摘要:microRNAs (miRNAs) 是一类长约22 nt的非编码RNA，通过与其靶基因3′端非翻译区 (3′-UTR) 的结合来调节各项生命活动。克隆表达家蚕Bmyan基因，验证其是否是bmo-miR-7的靶基因对于深入研究家蚕变态发育机制有重要意义。基于同源性检索和PCR扩增，克隆了家蚕Bmyan基因CDS全长，编码476个氨基酸。序列分析表明，家蚕YAN蛋白的氨基酸序列保守，含SAM-PNT和ETs结构域。芯片数据、RT-PCR和定量PCR的检测结果表明，Bmyan在五龄3 d的家蚕头部、体壁、卵巢中高量表达，在其余组织中低量表达或不表达。在幼虫期，Bmyan表达水平相对较低，但在上蔟期和蛹期前4 d高量表达。通过3′ RACE克隆了Bmyan基因的3′-UTR。RNAhybrid在线软件预测了其3?-UTR上bmo-miR-7的两个靶位点。构建了含有Bmyan基因3′-UTR和荧光素酶报告基因的转染载体，将该载体与bmo-miR-7的mimics序列共转染到家蚕胚胎细胞系BmE中，通过测定荧光素酶的活性，证明了Bmyan基因是bmo-miR-7的靶基因。本研究为进一步揭示bmo-miR-7和Bmyan在家蚕体内的生物学功能奠定了基础。

摘要:金黄色葡萄球菌是导致医院院内感染的主要病原。由于金黄色葡萄球菌极易产生抗药性，因此疫苗免疫是预防该细菌感染的主要手段。作为一个粘附分子，凝集因子B (ClfB) 的作用是使金黄色葡萄球菌能够在宿主黏膜定植，是预防该菌感染的一个重要的靶分子。本研究成功地在大肠杆菌中表达了可溶的ClfB N1-N3结构域蛋白 (Truncated-ClfB)，并且利用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤技术对其进行了纯化。用纯化后的Truncated-ClfB免疫新西兰大白兔，收集三免后的血清检测其抗体水平并且利用流式细胞术检测抗血清的调理吞噬活性。检测结果表明，三免后的兔源Truncated-ClfB抗血清抗体效价高达1: 640 000；与免疫前兔源血清相比，兔源Truncated-ClfB抗血清能够显著增加多形核白细胞 (Polymorphonuclear leukocytes, PMN) 对金黄色葡萄球菌的吞噬效率 (P<0.01)。结果表明Truncated-ClfB有希望作为金黄色葡萄球菌疫苗的候选抗原。

摘要:豹蛙抗瘤酶 (Onconase，ranpirnase，ONC) 对体内外多种肿瘤有很强的杀伤作用，是当前全球重点研究的100种新药之一，为获得高表达与高活性的重组豹蛙抗瘤酶 (Recombination onconase，rONC)，根据成熟ONC的cDNA序列和毕赤酵母密码子偏好性设计基因并提高其GC含量，分泌信号肽采用酵母α交配因子的pre肽，分别构建表达载体pPIC9/ONC、pPIC9K/ONC和pPICZα-A/ONC，并转染毕赤酵母X-33、GS115和SMD1168，筛选阳性克隆并进行诱导表达。在摇瓶规模筛选最佳载体-宿主组合及优化培养条件之后，进行10 L规模最优培养基的筛选，发酵产物经双水相萃取偶联G50凝胶层析分离纯化。结果表明，pPICZα-A /X-33/ONC组合表达量优于其他组合，且在pH 5.5、23 ℃条件下诱导7 d，最高表达量达到13 mg/L；在10 L规模条件下，rONC于pH 5.5的低盐基础培养基 (Lower basic salt medium，LBSM)、甲醇浓度0.25%条件下诱导7 d，最高表达量为180 mg/L；纯化后的rONC纯度≥95%，收率高于90%；生物活性检测发现，rONC在体外能杀伤多种癌细胞。初步建立了rONC的高效表达与纯化体系，为后续的功能和作用机理研究奠定了一定基础。

摘要:针对少量且复杂蛋白质组样品，开发一种耗时短、操作简便的分离方法。以人的脑海马组织蛋白样品为研究对象，采用反相C18固相萃取小柱，采用不同乙腈浓度对酶切后样品进行梯度洗脱，与反相高效液相色谱法对比分离效果。通过比较不同乙腈梯度洗脱方案所鉴定到的谱图数、非冗余多肽数、蛋白数和各洗脱组分间重复率分析，确定一种样品量少、简单易行、分离效果好的实验方案。虽然反相C18固相萃取小柱法鉴定蛋白总数占高效液相色谱法的85.5%，但其操作简单，耗时少。通过4种不同乙腈浓度方案比较，确定乙腈洗脱浓度优化为5%、15%、20%和90%时，分离30 μg人的海马多肽混合物可以得到较优的分离效果。其蛋白鉴定数为反相液相色谱法的67.0%，且重复性良好。该结果证实反相C18固相萃取小柱分离效果比反相高效液相色谱法稍差，但此方法可以分离少量复杂蛋白质组样品。该方法分离样品充分，操作易行，耗时短，是进行蛋白质组学分析中少量样品的一个简便预处理方法。

摘要:利用圆二色谱 (Circular dichroism，CD) 和流式细胞术 (Flow cytometry，FCM) 分析干扰素 (Interferon，IFN)-α的构象与其抗病毒活性之间的关系。以重组人IFN-α (rIFN-α2b和rIFN-α2a) 为材料，变温CD谱分析表明，在65 ℃以下，两种IFN-α的二级结构相对稳定，当温度高于65 ℃以后，两者的二级结构发生不可逆的改变。FCM分析构象变化前后IFN-α的抗病毒活性发现，构象的改变一定程度上减弱了其抗病毒活性。rIFN-α2b和rIFN-α2a具有相似的变化趋势。以上结果表明，IFN-α的构象是影响其抗病毒活性的重要因素之一，同时也验证了CD结合FCM是分析蛋白质药物构象与其细胞水平上生物学活性相关性的较好组合。

摘要:本研究旨在建立一种基于特征多肽的胶原定量检测方法，通过序列比对的方法筛选胶原蛋白特征多肽，利用胰蛋白酶将牛Ⅰ型胶原蛋白标准品进行酶解，采用液质联用技术 (HPLC-MS) 对特征多肽进行检测，建立特征多肽丰度与胶原蛋白浓度对应关系并用于实际样品分析。结果表明，牛Ⅰ型胶原蛋白中检测出6种特征多肽，其中多肽GEAGPSGPAGPTGAR由于其丰度高且二级质谱稳定适合作为定量检测的特征多肽，多肽信号强度与蛋白浓度 (0.1?3.0 mg/mL) 呈良好线性关系。将所建方法用于实际样品分析，牛跟腱胶原蛋白含量为90.2%，胶原海绵中胶原蛋白含量为93.4%，检测结果与基于氨基酸组成分析的结果一致。该研究表明基于HPLC-MS的特征多肽分析方法进行胶原蛋白定量检测具有可行性，该方法在含胶原蛋白医疗器械等生物制品质量控制方面具有应用前景。

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