摘要:甲型流感病毒作为引起人类和动物急性呼吸道传染病的一个主要病原体，在世界范围内广泛流行。研究表明，甲型流感病毒感染宿主后会诱导宿主的天然免疫应答。甲型流感病毒感染可引起Toll样受体 (Toll like receptors，TLRs) 和RIG-I样受体 (RIG-I like receptors，RLRs) 等宿主模式识别受体介导的抗病毒信号通路的活化，并在多种机制调控下诱导干扰素和其他细胞因子的表达，如Ⅰ型干扰素、Ⅲ型干扰素等，从而启动干扰素刺激基因 (Interferon stimulated genes，ISGs) 的转录及其抗病毒蛋白的表达，进而实现抗病毒作用。本文就甲型流感病毒感染与干扰素介导的天然免疫应答相关的信号通路和调控机制进行综述。

摘要:来源于灰盖鬼伞长度为1 092 bp的CiP目的基因与AOX1启动子一起整合进酵母染色体基因组中。重组蛋白CiP在酿酒酵母信号肽的引导下成功分泌到胞外，质谱鉴定为目的蛋白，成功在毕赤酵母中表达灰盖鬼伞过氧化物酶 (CiP)。将伴侣蛋白内质网氧化还原酶1 (Ero1)、二硫键异构酶 (PDI) 分别单独及同时转入CiP酵母受体菌中，研究它们对CiP在毕赤酵母中表达的影响。结果表明：在摇瓶中，相对于无分子伴侣的菌株，单独整合PDI及同时整合Ero1、PDI菌株的CiP酶活分别提高了2.43 和2.62倍，活力达到316 U/mL和340 U/mL。挑选同时整合Ero1、PDI伴侣蛋白的CiP菌株，5 L发酵罐进行高密度发酵，酶活最高达到3 379 U/mL，比摇瓶提高约10倍。本实验结果较目前已报道的1 200 U/mL已是最高水平。

摘要:本文对青霉素扩环酶 (Penicillin expandase，也称Deacetoxycephalosporin C synthase，DAOCS) 在高浓度青霉素G下的底物抑制现象进行初步评价与表征，筛选适合工业应用条件的高活力突变体。我们通过HPLC对已报道的几个DAOCS高活力突变体在青霉素G浓度5.6至500 mmol/L间的比活力进行定量测定，并与不同催化反应动力学模型的理论推测变化趋势比较，发现DAOCS野生型酶及高活力突变体H4、H5、H6与H7在高浓度青霉素G条件下均表现出明显的底物抑制现象，但是变化趋势不同。野生型酶与突变体H4的比活力先上升后下降，与竞争性抑制模型预测不符。突变体H5、H6与H7的比活力变化呈现更复杂的变化趋势。在所有测试的突变体中，H6的活性显著高于其他突变体酶。青霉素G对野生型DAOCS的底物抑制现象符合非竞争性抑制模型的预测。而部分突变体表现出复杂的底物抑制行为，表明其具有更复杂的作用机制。在高底物浓度下筛选具有较强催化活性的青霉素扩环酶突变体对于推动其在工业生产中的应用具有重要指导作用。

摘要:以淀粉为原料的同步糖化发酵是目前乙醇生产的主要途径之一。然而原料中含有的植酸不仅影响酒精发酵效率，而且也会导致环境中难以被植物吸收的磷含量的增加，加剧环境污染。将来源于大肠杆菌的植酸酶基因与酵母编码α-凝集素C端编码序列连接并置于α-因子分泌信号肽下游，构建植酸酶表面展示表达重组载体pMGK-AG-phy并转化工业酿酒酵母，成功获得了在细胞表面锚定表达植酸酶的重组菌PHY。重组酵母的植酸酶表达水平达到6.4 U/g (菌体湿重)，其最适温度为55 ℃，最适pH 4.0，在pH 3.5–4.5范围内具有较高的活性。以玉米粉为原料的同步糖化发酵实验表明，重组酵母PHY的生长速度高于出发菌株，同时酒精产量相较于出发菌株提高了3.7%。更为重要的是发酵后酒糟中植酸磷含量与对照相比降低了91%。构建的表面展示表达植酸酶的重组工业酿酒酵母能够有效降低植酸含量，提高了酒糟的利用价值，减少磷排放，对燃料酒精的环境友好生产具有重要的借鉴意义。

摘要:目前，对于构建高产丁醇大肠杆菌工程菌株的工作，主要是对丁醇通路和相关途径的基因进行理性改造。为进一步提升菌株的丁醇生产能力，需要发掘基因组上可影响丁醇生产能力的基因，但这很难通过已有认识或计算机模型进行预测。本工作以一株实验室前期构建的产丁醇大肠杆菌工程菌株为研究对象，利用Tn5转座子构建了一个含有1 196个菌株的突变文库。丙酮酸是丁醇的前体，并且在发酵终产物中，副产物丙酮酸的含量与丁醇的含量呈反相关，因此，可以利用丙酮酸的含量来间接反映丁醇的含量，而丙酮酸可用二硝基苯肼显色法进行快速测定，基于此，建立了96孔板——酶标仪快速筛选方法。利用该方法成功筛选到了比对照菌株丁醇产量提高了29%、49%、56%的3个突变体菌株。利用反向PCR及测序的方法，确定了其转座子插入位置分别为：pykA、tdk、cadC基因。这些基因可以作为进一步提高菌株丁醇产量的靶点，同时这种利用Tn5转座子筛选基因靶标的策略也为构建其他微生物细胞工厂提供了新思路。

摘要:水母雪莲是中国传统珍稀药材，其主要活性成分之一木犀草素具有预防和治疗癌症的功效。以水母雪莲绿色细胞系为试材，采用RT-PCR和RACE-PCR方法获得1个水母雪莲FNSII基因cDNA全长，命名为SmFNSII (GenBank登录号为KF170286)。序列分析结果表明：SmFNSII全长1 710 bp，包含34 bp的5?非编码区、125 bp的3?非编码区和1个长度为1 551 bp编码516个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析表明SmFNSII属于细胞色素P450 CYP93B亚家族单氧化酶。序列比对和系统进化分析表明，SmFNSII氨基酸序列与同科植物毛山柳菊的亲缘关系最近，相似性达87%以上。实时荧光定量PCR分析表明，SmFNSII在白色、绿色和红色细胞系均有表达，红色系中的表达量最高，白色系中表达量最低，此结果与高效液相色谱分析3种颜色细胞系中木犀草素含量结果一致。构建pET-SmFNSII原核表达重组质粒，并在大肠杆菌中诱导表达，诱导蛋白大小与预期一致。通过筛选FNSII基因表达水平高、高产木犀草素的水母雪莲细胞系和植株，可培育抗炎抗癌活性较高、具有高保健功能的雪莲生药新品种。

摘要:家蚕是鳞翅目完全变态昆虫，在其变态过程中伴随着巨大的形态变化，包括旧组织的解离和新组织的形成，在这过程中有多种组织蛋白酶参与。组织蛋白酶是一类细胞内蛋白酶，广泛存在于各个物种中，包括组织蛋白酶B、H、L等几个亚家族。对家蚕组织蛋白酶的研究将有利于阐明家蚕变态发育的详细过程。通过对家蚕基因组数据库进行筛选，共在家蚕中鉴定到13种组织蛋白酶，并对这13种组织蛋白酶的基本信息和表达模式进行了分析。另外，利用家蚕基因芯片数据和荧光定量PCR分析，鉴定编号为BGIBMGA004622的基因为卵巢特异表达的组织蛋白酶L亚家族基因。该基因全长1 209 bp，编码402个氨基酸。经过序列分析，该酶与其他物种的组织蛋白酶L具有较高的同源性，其活性位点高度保守，且与鳞翅目的组织蛋白酶L在进化上聚为一支。同时，对该基因进行克隆并原核表达，结果显示重组蛋白以包涵体的形式表达。定量PCR结果显示，该酶在蛹发育初期表达量逐渐升高，至蛹3 d达到最高值，推测其可能参与卵巢与卵母细胞的发育过程。

摘要:为研究从玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中克隆到的，与天蓝色链霉菌M 145中的一个重要负调控基因nsdA基因同源的nsdAmgh基因的功能，本文构建了nsdAmgh基因破坏型重组质粒pSRNA2500 (pKC1139::1.5 kb nsdAmgh::1.0 kb Kmr)，转化ET12567 (pUZ8002) 获得接合转移供体菌ET12567 (pUZ8002，pSRNA2500)，通过接合转移将重组质粒导入玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中。在高温和抗生素双重筛选压力下，筛选得到表型为AmsKmr 的nsdAmgh基因阻断突变株，通过PCR、Dot bloting和Southern blotting验证了突变株中的nsdAmgh 基因已被正确阻断。与出发菌株相比，突变株在摇瓶水平上对棉花黄萎病菌的抑制能力提高了一倍。

摘要:利用Gateway克隆技术构建重组抗瘤肽AIK的原核表达体系，建立表达及纯化重组AIK的最优条件，为深入研究和利用AIK奠定基础。首先，设计含AttB重组位点的引物，通过重叠PCR技术扩增出AttB-TEV-FLAG-AIK序列，利用BP重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK克隆到供体载体pDONR223中，构建入门载体，再通过LR重组反应，将目的序列转移到目的载体pDEST15中，构建GST-AIK融合蛋白原核表达质粒。随后，在BL21 (DE3) 工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化GST-AIK融合蛋白，再以rTEV酶切除GST，获得FLAG-AIK重组蛋白。最后以MTS法检测FLAG-AIK对白血病细胞HL-60的细胞毒性。菌液PCR验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽AIK的入门质粒和原核表达质粒。在BL21 (DE3) 工程菌中实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37 ℃下以0.1 mmol/L IPTG诱导工程菌 (OD600=1.0) 4 h，重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30% 以上。经GST亲和层析、rTEV酶切除GST标签及二次GST亲和层析获得纯度高于95%的FLAG-AIK蛋白。MTS法测得所制备的FLAG-AIK蛋白抑瘤活性与化学合成的AIK相当。总之，本课题应用Gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽AIK的原核表达质粒，实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达，经亲和层析获得了有生物活性的重组AIK多肽，为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。

摘要:近年来，用8型腺相关病毒携带1.3拷贝HBV (Hepatitis B virus) 基因组建立的HBV持续感染小鼠模型受到越来越多的关注。本研究比较了除AAV8之外的其他4种血清型重组腺相关病毒 (Recombinant adeno-associated virus，rAAV) 建立乙肝小鼠模型效果。首先，将携带1.3拷贝ayw亚型HBV基因组的1型、2型、5型、8型、9型腺相关病毒分别以1×1011 vg/只 (Viral genome，vg) 的剂量尾静脉注射C57BL/6J小鼠；利用 ELISA 方法监测小鼠血清中HBeAg和HBsAg表达水平；用定量PCR方法检测小鼠血清和肝脏中 HBV DNA 拷贝数；用免疫组化方法检测小鼠肝脏中HBcAg的表达；用HE染色检测小鼠肝脏病理变化。结果显示，在持续8周中，5组小鼠血清中都检测到HBeAg和HBsAg的表达，血清和肝脏中均检测到HBV DNA的存在。HBeAg、HBsAg、HBV DNA表达水平高低依次为AAV8>AAV9>AAV1>AAV5>AAV2。5组小鼠用免疫组化方法都检测到肝脏中HBcAg表达，HE染色病理检测均观察到不同程度的肝损伤。本研究扩大了能用于建立乙肝小鼠持续感染模型可选择的AAV载体种类，发现虽然AAV1、2、5、9的建模效果不如AAV8，但它们都可以介导建立持续感染的乙肝小鼠模型，建模效果依次为AAV8>AAV9>AAV1>AAV5>AAV2。其中AAV9介导的建模效果与AAV8载体最为接近，可以替代AAV8载体用于有效地建立HBV持续感染的小鼠模型。

摘要:在现代生物学和生物技术研究中，通过基因重组表达获得目标蛋白已成为常规技术。因其培养简单、操作方便、遗传背景清楚、克隆表达技术成熟，大肠杆菌表达系统通常是人们表达重组蛋白的首选。但是在常规温度下进行基因的重组表达，动、植物和常温微生物的基因产物多数在数小时内变性沉淀；还有一些重组蛋白对宿主具有细胞毒性，难以得到重组表达。因此，我们构建了1种新型T载体——pEXC-T；它结合TA克隆技术和低温诱导表达功能，具有表达水平高、操作方便、目标蛋白得到分子伴侣保护和低温保存等特点。采用构建和优化的pEXC载体，P1抗原蛋白、溶血素PLO两种不稳定性蛋白在pEXC中都实现了高效的可溶性表达。低温表达系统pEXC的建立和发展为蛋白质的结构与功能的研究，以及抗原和药用蛋白的制备提供了便利的途径。

摘要:海藻糖是相容性溶质的一种，因其具有多种生物学功能，在食品、化妆品、药品以及器官移植等方面均有很广泛应用。然而近几年生产海藻糖主要集中在使用酶催化的方法，虽然这种方法的转化效率高，但是却存在着副产物的问题，难以得到高纯度的海藻糖产品，严重制约了海藻糖的应用。本文通过基因工程技术在大肠杆菌Escherichia coli中构建了海藻糖高效合成新途径，通过全细胞催化合成海藻糖。利用PCR技术在哈氏噬纤维菌Cytophaga hutchinsonii中克隆获得海藻糖双功能合成酶基因 (tpsp)，采用E. coli pTac-HisA高效表达载体，实现海藻糖双功能合成酶基因 (tpsp) 高效表达，利用高效表达菌株进行全细胞催化，将葡萄糖高效转化为海藻糖。结果表明C. hutchinsonii海藻糖合成酶基因 (tpsp) 在E. coli中成功实现表达，该酶能够在胞内将葡萄糖高效转化为海藻糖，并将其转运到胞外，实现海藻糖的高效率合成，海藻糖的产量提高到1.2 g/L，相对转化率为21%。当将此高产菌株在发酵罐中进行转化时，海藻糖的产量达到13.3 g/L，葡萄糖的相对转化率达到48.6%。采用C. hutchinsonii海藻糖合成酶基因高效表达并且应用于海藻糖全细胞合成催化在国内外尚属首次报道，海藻糖的转化率及产率都已达到文献报道最高水平，本研究为开拓海藻糖生产新技术奠定了基础。

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