摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway技术、三段T-DNA法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；MicroRNA前体PCR置换法适用于构建小分子RNA表达载体；重组融合PCR法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法 (Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson等温拼接法；Golden Gate拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础上，结合自己工作的体会和经验分析这7种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。

摘要:对羟基苯甲酸 (4-Hydroxybenzoate, 4HBA) 是用途广泛的有机原料，现行的生产工艺是以石油成分合成而得，在环境污染不断恶化、人类生存已经面临威胁之际，开发利用可再生资源的生产工艺已成为全球当务之急。本综述在简要介绍从石油成分合成4HBA之后，主要阐述利用植物和微生物从可再生资源合成4HBA的研究进展。莽草酸途径是生物合成芳香族化合物的重要途径，从该途径的最终产物分支酸到4HBA有两条途径。一条是分支酸裂解酶直接催化分支酸生成4HBA (莽草酸-分支酸路线)。另外一条途径是在植物细胞内引入荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens的对羟基肉桂酸-CoA裂解酶打通从苯丙素合成4HBA的通路 (植物苯丙素路线)。最后介绍了一个天然合成积累4HBA的微泡菌Microbulbifer，并对其深入研究进行了展望。

摘要:近年来，基因组范围的高效编辑技术发展迅速，对工业微生物基因组的改造效率不断提升，彻底改变了以“一次操作、一个抗性基因、一个修饰位点”为特征的传统遗传操作模式，实现了基因组上多重位点的同步编辑，精确高效且无需抗生素辅助的插入替换或删除，以及大片段基因组DNA的剪切-粘贴等。这些技术的应用，能够高效构建优良性能的生产菌株，必将推动传统发酵产业的革新，促进以新能源和新材料为基础的新型工业生物技术的发展。本文针对这些新技术的原理和特点，结合一些典型应用实例，进行分析和总结，希望能为工业微生物的改造与构建提供参考与借鉴。

摘要:通过在小梅山猪骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 中过表达缝隙连接蛋白43基因 (Cx43)，探究Cx43对小梅山猪BMSCs增殖及凋亡的影响，为构建转基因动物模型奠定基础。利用分子技术构建Cx43真核表达载体pEGFP-Cx43，Nucleofector TM法转染P3代BMSCs，检测细胞转染效率，经RT-PCR、免疫荧光和Western blotting鉴定Cx43的表达，流式细胞技术分析BMSCs的增殖能力和凋亡情况。酶切鉴定和测序结果表明，pEGFP-Cx43真核表达载体构建成功，转染BMSCs后，EGFP阳性细胞约占60%。转基因BMSCs中Cx43蛋白表达显著增加，细胞增殖能力显著提高、凋亡率显著下降。结果表明，在小梅山猪BMSCs中过表达Cx43不仅能促进细胞增殖而且抑制其凋亡，为下一步在体研究奠定了基础。

摘要:Baeyer-Villiger单加氧酶是一种重要的生物催化剂，可用于合成一系列有价值的酯和内酯化合物。通过序列比对和晶体结构分析推测连接NADPH结构域和FAD结构域的一段非保守Hinge可能在酶对底物识别和催化氧化过程中扮演着重要角色。在以环己酮单加氧酶为模型的研究中发现，对该Hinge结构进行同源序列替换得到的突变体几乎完全丧失了催化活性，证明了其整体水平的重要性。丙氨酸扫描突变揭示其中一些位点对酶的功能有显著影响：K153位点的改变使酶的活性下降，立体选择性却更优化；L143位点的改变对酶的活性影响较小，却降低了立体选择性；L144位点的改变则同时大幅度削弱酶的活性和立体选择性。将同样的方法运用在苯丙酮单加氧酶中，我们得到了相似的结论，证明这些位点的重要功能在Baeyer-Villiger单加氧酶家族中有一定的普遍性。这一研究增进了对Baeyer-Villiger单加氧酶的结构与功能关系的认识，有助于底物结合口袋的精确描述和Baeyer-Villiger单加氧酶催化图景的进一步细化，对未来相关的理性设计和定向改造研究提供了借鉴。

摘要:紫杉二烯是紫杉醇合成途径中的前体物质。紫杉醇是红豆杉的一种重要的次级代谢产物，是一种重要的新型抗癌药物。然而，紫杉醇在植物中含量低且难提取，限制了高效应用。利用基因工程手段，借助担子菌类真菌灰盖鬼伞具有的内源类异戊二烯合成途径，构建含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸 (Geranylgeranyl diphosphate, GGPP) 合酶和紫杉二烯合酶的融合基因表达载体pBgGGTS和独立表达盒表达载体pBgGGgTS，并分别转入灰盖鬼伞LT2菌株中，经过选择性筛选、PCR鉴定、Southern blotting杂交验证，分别获得了5株融合表达的灰盖鬼伞工程菌和5株独立表达盒的灰盖鬼伞工程菌株。各随机挑选了1株工程菌株，分别提取菌丝体和发酵液分析。GC-MS分析表明，两种工程菌株与原出发菌株的菌丝提取物无明显差异峰，而与出发菌株的发酵液提取物相比，两种转基因灰盖鬼伞的发酵液中均出现了明显的差异峰，采用GC-MS特征质量离子分析方法判定为紫杉二烯，分别为44 ng/L (转化pBgGGgTS) 和30 ng/L (转化pBgGGTS)。结果表明，通过在灰盖鬼伞融合基因或各自独立表达的形式共表达ggpps和ts基因，可以生物合成紫杉二烯。

摘要:利用细菌人工染色体技术将串联的HIV-1 gp160、gag和protease基因以及表达元件插入1型单纯疱疹病毒 (Herpes simplex virus type 1, HSV-1) 内部反向重复序列区，以获得携带HIV-1抗原的单纯疱疹病毒载体疫苗。首先将HIV-1 gp160 (B型和C型)、gag和protease基因串联克隆入pcDNA3获得重组质粒pcDNA/gBgp和pcDNA/gCgp，重组质粒转染293FT细胞，Western blotting检测HIV抗原表达。继而将pcDNA/gBgp和pcDNA/gCgp中包括HIV-1抗原基因和表达元件的表达框克隆入pKO5/BN获得重组穿梭质粒pKO5/BN/gBgp和pKO5/BN/gCgp，穿梭质粒电转含BAC-HSV的大肠杆菌，筛选重组菌，提取重组DNA并转染Vero细胞，挑取病毒蚀斑纯化重组病毒，Southern blotting鉴定重组病毒DNA，Western blotting检测重组病毒感染细胞中HIV抗原表达，并分析病毒的增殖特性。结果表明，Western blotting在pcDNA/gBgp和pcDNA/gCgp转染的293FT细胞中检测到表达的gp160和gag蛋白。pKO5/BN/gBgp和pKO5/BN/gCgp分别电转获得重组菌，并从重组DNA转染的Vero细胞中纯化获得重组HSV，Southern blotting 检测表明重组HSV基因组发生特异性重组，重组病毒感染细胞中检测到gp120和gp41，且重组HSV保留了在哺乳动物细胞中的复制能力。本研究获得携载HIV-1 gp160、gag和protease基因的重组HSV，并保留了在哺乳动物细胞中的复制能力，可作为HIV-1复制型病毒载体疫苗。

摘要:干细胞通过诱导培养，在体外能够分化为卵母细胞样细胞 (Oocyte-like cell, OLC)，将其置于体内环境能够有效地改善OLC的质量和发育能力。通过检测猪卵泡液中激素和Bmp 15蛋白的含量，选取了中等卵泡的卵泡液对人羊水干细胞进行体外诱导培养，10 d后，经实时定量PCR检测发现，早期生殖细胞样细胞团高表达生殖基因oct4和重新甲基化转移酶基因dnmt3b。将这些细胞团用猪卵泡膜包裹后形成移植物，移植到小鼠肾被膜下。1个月后取出移植物，发现移植物内的细胞在形态上，不仅与正常的卵母细胞极为相似，而且还表达生殖细胞和卵母细胞特异标记基因 (oct4、nanog、stella、ifitm3、dazl、nanos3、bmp15和gdf9)。证明技术体系能够有效改善OLC的形成和发育能力。

摘要:通过改良硫氧还蛋白融合表达体系，原核表达cathelicidin家族抗菌肽Lf-CATH2。首先在Lf-CATH2基因上游加入凝血酶位点，并去除pET32α载体的凝血酶序列和S标签序列，构建优化的Lf-CATH2-pET32α-TS载体，于大肠杆菌中表达。产物融合蛋白经凝血酶切割释放Lf-CATH2，纯化后进行抗菌活性检测。结果表明改良的硫氧还蛋白融合表达体系显著提高酶切效率达37%，Lf-CATH2在新体系中获得了可溶性高表达，且保留了抗菌活性。因此该新型硫氧还蛋白融合表达体系，有望为cathelicidin家族及其他阳离子活性肽提供更好的原核表达载体工具。

摘要:为大量制备β-NGF，构建了一种稳定、高效表达重组人神经生长因子 (Recombinant human nerve growth factor, rh-β-NGF) 的真核表达载体及含该重组载体的HEK293细胞株。首先，构建重组质粒pCMV-β-NGF-IRES-dhfr并转染至HEK293细胞系，用MTX加压筛选和有限稀释法进行选择，获得高效表达rh-β-NGF的单克隆重组细胞株；随后逐步降低血清培养，最终使细胞株完全适应无血清培养基并稳定表达rh-β-NGF；SDS-PAGE分析该表达产物，可见相对分子质量约13 kDa的条带，纯度大于50％，经质谱法测定得到其肽图谱与理论序列完全匹配，接着利用离子交换层析和分子筛层析纯化rh-β-NGF；最后进行重组细胞株表达效率和表达稳定性检测，表明重组细胞株可稳定、高效表达rh-β-NGF，其分泌效率大于20 pg/(cell?d)，并能诱导PC12细胞的分化，具有良好的生物学活性。

摘要:肌质网型钙离子ATP酶 (Sacro/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, Serca) 负责将细胞中多余的Ca2+转运并存储于内质网中，从而维持细胞内适宜的Ca2+环境。家蚕Serca创造的细胞内及细胞外Ca2+平衡对家蚕正常生命活动的维持具有重要作用。由于Serca分子量较大并具有10次跨膜结构，很难在大肠杆菌表达系统中表达。为了获得具有生物学活性的重组Serca蛋白，利用pFastBac Dual载体构建了用于表达egfp和serca的双元杆状病毒表达载体，转染细胞后获得重组病毒，将重组病毒感染细胞后，成功地在细胞中表达了EGFP和Serca。通过荧光观察及Western blotting分析表明，感染后细胞中Serca和EGFP表达模式一致，从感染后48 h开始表达，在感染后96 h表达量最大。对获得的重组蛋白进行酶活分析，发现感染后48 h至120 h的细胞Serca酶活显著提高。表明具有生物学活性的Serca在此系统中成功获得表达，为深入研究Serca蛋白的功能奠定了基础。

摘要:为了有效改善发酵体系中的溶氧水平，提高小白链霉菌Streptomyces albulus PD-1发酵生产ε-聚赖氨酸的能力，文中通过对氧载体的种类、最佳添加浓度以及添加时间进行筛选，最终确定在0 h添加0.5% (V/V) 的正十二烷促进ε-聚赖氨酸生产效果最佳。在5 L发酵罐0 h添加0.5%的正十二烷进行批次补料发酵，ε-聚赖氨酸的产量和菌体干重分别可以达到 (30.8±0.46) g/L和 (33.8±0.29) g/L，较之对照组分别提高了31.6%和20.7%。ε-聚赖氨酸的产量和菌体干重的提高归因于0.5%正十二烷的添加促进发酵液中溶氧水平从23.8%提高到32%，同时发酵液中的一种主要副产物 (聚二氨基丙酸) 的含量下降31%。实验结果表明，正十二烷的添加可以提高S. albulus PD-1发酵液中的溶氧水平，抑制副产物的生成，促进ε-聚赖氨酸的合成。

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