摘要:高产特定产品的人工细胞工厂的构建需要对野生菌株进行大量的基因工程改造，近年来随着大量基因组尺度代谢网络模型的构建，人们提出了多种基于代谢网络分析预测基因改造靶点以使某一目标化合物合成最优的方法。这些方法利用基因组尺度代谢网络模型中的反应计量关系约束和反应不可逆性约束等，通过约束优化的方法预测可使产物合成最大化的改造靶点，避免了传统的通过相关途径的直观分析确定靶点的方法的局限性和主观性，为细胞工厂的理性设计提供了新的思路。以下结合作者的实际研究经验，对这些菌种优化方法的原理、优缺点及适用性等进行详细介绍，并讨论了目前存在的主要问题和未来的研究方向，为人们针对不同目标产品选择合适的方法及预测结果的可靠性评估提供了指导。

摘要:蛋白质泛素化是以泛素单体和泛素链作为信号分子，共价修饰细胞内其他蛋白质的一种翻译后修饰形式。不同蛋白质底物、同一底物的不同氨基酸修饰位点以及同一位点上泛素链连接方式的不同均可导致细胞效应的差异。蛋白质泛素化在真核细胞内广泛存在，除了介导蛋白质的26S蛋白酶体降解途径之外，还广泛参与了基因转录、蛋白质翻译、信号传导、细胞周期控制以及生长发育等几乎所有的生命活动过程。泛素链的形成及其修饰过程的任何失调均可导致生物体内环境的紊乱，从而产生严重的疾病。文中结合实验室研究，综述了泛素的发现历史、基因特点、晶体结构，特别是泛素链的组装过程、结构、功能以及与人类相关疾病关系的新进展，可为这些疾病的治疗靶点和药物靶标的研究提供思路。

摘要:谷氨酸脱羧酶 (Glutamate decarboxylase，GAD) 是用于催化L-谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyrate，GABA) 的唯一酶，提高GAD的催化活力或热稳定性，有利于GABA的高效制备和生产。以热稳定性和活性为筛选目标，通过研究短乳杆菌GAD1407三维模拟结构的拉氏图，确定不稳定氨基酸残基位点K413，采用定点突变的方法构建该位点的突变体，并测定野生型酶和突变酶的热稳定性和活力。结果表明突变酶K413A和突变酶K413I分别在热稳定性和酶活力上获得了提高，突变酶K413A在50 ℃的半衰期为105 min，是野生酶的2.1倍；突变酶K413I热稳定性没有明显的提高，但其酶活力却得到了有效提高，约为野生型的1.6倍。因此，通过拉氏图提供的结构信息可为利用理性设计提高GAD活性和热稳定性提供指导。

摘要:从嗜高温放线菌Thermobifida fusca中分离得到的苯基丙酮单加氧酶主要催化芳香族化合物的Baeyer-Villiger氧化反应。对该酶的结构和功能进行研究时，发现位于底物结合口袋的Met446位点突变可以赋予突变酶催化C–H键活化的新功能，氧化吲哚合成靛蓝和靛玉红，但产量仅为1.89 mg/L。为了获得合成靛蓝和靛玉红的全细胞催化剂，直接补加吲哚并不能提高细胞合成效率，补加吲哚的前体物质L-色氨酸可以使细胞合成靛蓝和靛玉红的能力提高4.5倍，达到8.43 mg/L。为了进一步提高细胞的生物合成效率，通过代谢工程改造大肠杆菌的糖代谢途径，阻断葡萄糖异构酶基因pgi，使磷酸戊糖途径代替糖酵解途径成为葡萄糖的主要代谢通路，从而为细胞提供更多氧化吲哚所需的辅因子NADPH，导致细胞合成靛蓝和靛玉红的效率进一步提高3倍，达到25 mg/L。通过组合蛋白质工程和代谢工程设计全细胞催化剂不仅可以高效地合成靛蓝和靛玉红，而且设计理念为相关全细胞催化剂的开发提供了一种新的策略。

摘要:1,2,4-丁三醇 (BT) 是一种在工业中有多种用途的重要的非天然化合物。文中通过将外源基因xdh和mdlC导入大肠杆菌BW25113表达，并敲除了xylA、xylB、yagE、yjhH、yiaE和ycdW等木糖和中间产物代谢旁路基因，构建了能够将D-木糖转化为BT的重组菌株。为优化BT合成途径，针对BT合成途径中的限速步骤——3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸的脱羧反应，进行了新酶的筛选和评价，获得了可显著提高反应效率的新的2-酮酸脱羧酶——KivD，并构建了表达该酶的重组菌株BW-025。在此基础上，通过初步条件优化，将BT产量提高至2.38 g/L；进一步调节途径中各个酶的表达量，探究了它们对BW-025合成BT的影响，最终获得了BT产量较BW-025提高了48.62%的重组菌株BW-074。

摘要:家蚕的丝腺是其丝蛋白合成和分泌的器官，根据其形态和功能的不同分为前部、中部和后部丝腺，前部丝腺不具有合成丝蛋白的能力，是丝蛋白构象发生转变的场所。剪切力在丝蛋白构象转变中起到重要的作用，其在家蚕前部丝腺主要由前部丝腺逐渐变细的管腔结构和富含几丁质及表皮蛋白的坚硬的内壁提供。鉴定家蚕前部丝腺新的几丁质结合蛋白，并调查其在家蚕幼虫不同组织的表达特征。通过几丁质亲和层析的方法在前部丝腺筛选并鉴定到一个新的具有几丁质结合功能的表皮蛋白Bm11721，其编码基因编号为BGIBMGA011721 (GenBank Accession No. NM-001173285.1)。利用原核表达系统成功表达了该蛋白，通过Ni-NTA亲和层析的方法获得了Bm11721的重组蛋白并制备了多克隆抗体。组织表达分析发现无论是转录水平还是蛋白水平Bm11721均只在前部丝腺特异表达，且Bm11721蛋白在5龄期的前部丝腺中恒定表达。免疫荧光定位结果显示Bm11721蛋白定位在前部丝腺的内膜中，推测其可能与前部丝腺的机械硬度有关，为丝蛋白的构象转变提供剪切力。

摘要:氨基甲酸乙酯 (Ethyl carbamate，EC) 作为一种潜在致癌物质普遍存在于传统发酵食品中。利用酸性脲酶消除EC前体物质尿素是一种具有潜在重要应用价值的策略。本研究在前期成功实现食品级耐乙醇酸性脲酶高效表达制备的基础上，系统研究了重组酸性脲酶对尿素和EC的水解过程。重组酸性脲酶对模拟体系以及黄酒体系中的尿素具有很好的降解能力 (60 mg/L的尿素在25 h内完全被降解)，表明该重组酸性脲酶适用于黄酒中尿素的消除。虽然重组酸性脲酶也具有降解EC的催化活性，但在黄酒中添加重组酸性脲酶对EC的浓度无明显影响。进一步研究发现重组酸性脲酶对尿素和EC的Km值分别为0.714 7 mmol/L和41.32 mmol/L，研究结果为应用定向进化策略改造重组酸性脲酶实现同时水解尿素和EC提供了理论依据。

摘要:聚合物胶束作为药物载体具有良好的稳定性和生物相容性，提高疏水性药物溶解性等优势，是一类很有应用潜力的药物传输系统。本研究以合成的共价键连D-甘露糖的双亲性聚合物分子 (PGMA-Mannose) 为药物载体，包载抗癌药物阿霉素 (DOX) 制备具有甘露糖受体靶向性和pH敏感药物释放特性的新型载药聚合物胶束。利用激光共聚焦显微镜和MTT细胞毒性评价方法对载药胶束的细胞内吞摄取和毒性进行评价。实验结果表明，载药胶束能特异性识别人乳腺癌细胞MDA-MB-231表面过度表达的甘露糖受体，被癌细胞大量摄取并在细胞溶酶体酸性环境内释放药物，而载药胶束在表面甘露糖受体低表达的HEK293细胞中只有少量摄取。与原药DOX相比，该载药胶束对癌细胞的毒性显著提高，而对正常细胞的毒性较低。因此，该PGMA-Mannose聚合物胶束有望成为一种新型的靶向药物输送系统应用于癌症的治疗。

摘要:重组F1-V融合蛋白 (rF1-V) 是目前在进行临床研究的鼠疫亚单位疫苗的主要成分。本研究摸索了rF1-V的可溶表达条件，并对条件进行了优化和放大，确定的中试发酵工艺为：在重组菌对数生长期中期加入50 μmol/L IPTG，25 ℃诱导表达5 h。通过硫酸铵分级沉淀、离子交换、疏水相互作用层析和凝胶过滤四步纯化，最终得到纯度为99%、回收率大于20%且各项检测指标合格的蛋白。在此基础上，将蛋白使用氢氧化铝佐剂进行吸附，在小鼠体内进行了免疫原性研究。ELISA测定两次皮下免疫后血清的抗体滴度。比较融合蛋白免疫组 (rF1-V) 与单一抗原免疫组 (rF1、rV) 以及联合抗原免疫组 (rF1+rV) 之间体液免疫反应的差异。结果显示：20 μg rF1-V免疫剂量组诱导的抗F1抗体滴度明显高于其他组，抗V抗体滴度与其他组相比没有显著差异。表明本工艺制备的rF1-V抗原有望作为鼠疫亚单位疫苗的主要组分。

摘要:流感病毒属于正黏病毒科，为有包膜包裹的单股负链RNA病毒。它的8个基因片段编码至少16种病毒蛋白，其中3个蛋白组成流感病毒的聚合酶复合体。流感病毒聚合酶碱性蛋白1 (PB1) 是该复合体的组分之一，在病毒的转录、复制及重配中发挥重要的作用。为研究其功能，构建His-PB1 (aa 550–755) 融合蛋白原核表达质粒，IPTG诱导融合蛋白表达，通过镍柱亲和将其纯化，然后作为抗原免疫家兔。对抗血清进行间接ELISA检测，表明抗体效价可达1∶100 000。兔源PB1蛋白抗血清经亲和纯化后，用于免疫印迹检测流感病毒WSN毒株PB1蛋白以及外源转染的FLAG-PB1蛋白，结果表明该PB1抗体具有良好的特异性，同时也能特异性识别其他亚型的A型流感病毒的PB1蛋白，为进一步研究流感病毒PB1蛋白的功能奠定了基础。

摘要:目前常用的基因修饰方法是在Red同源重组介导下，电转线性PCR片段替换染色体上指定序列。因PCR过程错误掺入，该方法常常会在同源序列部位产生一些突变。为了避免此类突变，我们建立了一种新的无痕删除方法。首先将含有抗性标记 (两侧带有I-Sec I识别位点) 的线性DNA电转到Red重组感受态细胞内，用抗性基因替换基因组上指定序列；然后，将携带融合同源臂 (两侧带有I-Sec I位点) 的供体质粒导入上述细胞，诱导表达I-Sec I内切酶切割供体质粒释放同源片段，同时切除染色体上抗性基因产生双链断裂，通过分子间同源重组实现无痕删除。我们应用该方法连续删除了大肠杆菌DH1基因组上11个非必需区，使基因组减小10.59%。PCR测序证明所有删减区域同源臂未发生突变，基因组重测序证明指定区域被删除。删减菌的生长变化不大，但耐酸能力有所改变，并对番茄红素合成有不同影响。

摘要:为获得高抗菌活性聚乙二醇 (PEG) 定点修饰的溶葡萄球菌酶 (Lysn)，根据该酶的高级结构，在它的催化域和结合域上优选8个位点 (Q9、N13、N40、T172、N174、G197、V240和T244)，将其分别突变成半胱氨酸，纯化后的溶葡萄球菌酶突变体经DTT处理后与20 kDa的单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺 (mPEG-MAL)进行定点修饰反应，RP-HPLC分析显示PEG修饰率大于70%，修饰产物经MacroCap SP阳离子交换层析纯化后，PEG化溶葡萄球菌酶的纯度大于95%。比浊法和最小抑菌浓度 (MIC) 实验表明20K-PEG-LysnV240C和20K-PEG-LysnT244C的抗菌活性维持在原来的50%左右。研究结果为溶葡萄球菌酶全身给药治疗金黄色葡萄球菌感染奠定基础。

摘要:蛋白质水解是一种重要的翻译后修饰，它在许多生化过程 (如细胞凋亡和肿瘤细胞转移等) 中起着极其重要的作用。鉴定蛋白质水解位点可以进一步加深我们对这些生化过程的认识。尽管蛋白质氨基端标记方法和蛋白质组学在复杂生物体系中鉴定获得了许多蛋白质的水解位点，但这种方法存在固有的缺陷。羧基端标记方法是另一种可行的鉴定蛋白质水解位点的方法。本文优化了蛋白质羧基端生物酶标记方法，提高了亲和标记效率，从而可以更好地利用正向分离方法对蛋白质羧基端多肽进行分离并用质谱鉴定。我们用优化后的羧基端标记方法来标记大肠杆菌Escherichia coli复杂蛋白样品后鉴定到了120多个蛋白质羧基端多肽和内切多肽。在其所鉴定的蛋白质水解位点中，我们发现了许多已知和未知的位点，这些新的水解位点有可能在正常生化过程的调控中发挥着重要的作用。该研究提供了一个可以与蛋白质氨基端组学互为补充、可在复杂体系中鉴定蛋白质水解的方法。

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