摘要:以细菌为基础的生物技术在蓬勃发展的同时也不断受到噬菌体感染的威胁，噬菌体感染已成为微生物发酵过程中的一个顽疾，其实质是噬菌体与细菌之间复杂的共进化关系。在漫长的进化过程中，噬菌体已经形成了多种针对细菌抗性系统的逃逸机制。合理的工厂设计、菌株的轮换策略和传统的基因工程方法能在一定程度上降低噬菌体感染的风险，但仍然无法避免。基于CRISPR-Cas系统的防治策略仅需噬菌体的序列信息就可以理性设计噬菌体抗性菌株，且可以通过叠加效应不断增强菌种抗性，从而避免噬菌体的逃逸；群体感应信号分子则可以从整体水平上调节细菌的噬菌体抗性。这些新发现为噬菌体感染问题的解决带了新的希望，而噬菌体基因组编辑技术和合成生物学的快速发展则将进一步加深人们对噬菌体感染防治领域的认识。

摘要:为了开发丙酮酸高产菌株，以大肠杆菌MG1655为出发菌株，通过基因敲除阻断副产物途径构建了产丙酮酸大肠杆菌工程菌KLPP。进一步利用pUT Mini-Tn5载体进行转座子随机突变，构建了含有7 197个单克隆的突变体文库。使用基于丙酮酸的二硝基苯肼显色法，建立了96孔板-酶标仪快速筛选方法，经过两轮的筛选，成功筛选到了6个突变体菌株，比KLPP丙酮酸产量提高了38%、31%、19%、28%、44%和14%。利用全基因组重测序确定了其转座子插入的位置，进而确定了可能影响丙酮酸产量的基因位点，为后续菌株改造工作奠定了基础。

摘要:手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体，如何实现手性胺类化合物的不对称合成是目前人们普遍关注的一个焦点问题。ω-转氨酶 (ω-Transaminase，ω-TA) 是一类能直接合成对映体手性胺的天然生物催化剂。相比于 (S)-ω-TA，(R)-ω-TA的研究较少，但其需求量随着手性胺类药物的发展日趋增大。提高具有潜在应用价值的 (R)-ω-TA的热稳定性，将有利于手性胺的制备。本文利用PyMOL软件和YASARA软件预测来源于土曲霉Aspergillus terreus的 (R)-ω-TA中具有高温度因子 (B-factor) 的Loop区域，通过定点突变对Loop区域表面不稳定氨基酸逐步进行删除获得突变酶。结果表明，突变酶R131del和突变酶P132-E133del半失活温度分别为41.1 ℃和39.4 ℃，比野生酶提高了2.6 ℃和0.9 ℃；在40 ℃下的半衰期分别为15.0 min和10.0 min，为野生酶的2.2倍和1.5倍。此外，在400 K和10 ns的分子模拟条件下，突变酶R131del在Loop区域的均方根涨落 (Root mean square fluctuation，RMSF) 比野生型低，突变酶P132-E133del在Loop区域增加了4个氢键。本研究通过删除 (R)-ω-转氨酶Loop区域表面不稳定氨基酸提高了该蛋白的热稳定性，同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。

摘要:活性污泥 (简称污泥) 是废水处理产生的副产物，量大而且难以处理。本研究通过对污泥的高温热裂解处理，获得可用于培养微生物的营养物质。实验发现污泥热裂解液可以取代培养嗜盐单胞菌Halomonas CJN的氮磷源、酵母膏和微量元素，来生产生物可降解塑料聚-3-羟基丁酸酯 (PHB)。进一步发现厌氧发酵污泥热裂解液产生的乙酸可以取代葡萄糖来作为碳源支持微生物的生长。这样，可以实现利用污泥热裂解液来生产生物塑料PHB。通过进一步在Halomonas CJN中构建附加PHB合成路径，可以实现完全用污泥热裂解液来高效生产PHB，粗略估计使PHB的制造成本从30 000元/t下降到20 000元/t，实现污泥变废为宝的目标。

摘要:为丰富产紫杉醇植物内生真菌资源库，从曼地亚红豆杉Taxus media茎中分离得到一株产紫杉醇的内生真菌TMS-26。通过对TMS-26的发酵提取物进行高效液相色谱分析，发现其具有与紫杉醇标准品 (4.545 min)相近的色谱特征峰。进一步通过液质联用仪检测发现，内生真菌TMS-26的发酵提取物中具有与紫杉醇标准品((M+Na)+=876) 相近的质谱特征峰，表明内生真菌TMS-26能够产生紫杉醇。同时通过传统形态学分类鉴定方法和18S rDNA序列分析、Internal-transcribed spacer (ITS) 序列分析等现代分子生物学分类鉴定方法，最终将内生真菌TMS-26鉴定为曲霉属烟曲霉Aspergillus fumigatus，并命名为“烟曲霉TMS-26”。

摘要:整合素作为一种跨膜糖蛋白，与生物体的生理和病理等多个过程密切相关。为了探究其在家蚕中扮演的角色，通过PCR及RACE技术克隆得到了家蚕整合素β家族成员Bmintegrin β1，通过结构域预测网站对其结构域进行了预测，并构建进化树对其进化关系进行分析，此外通过原核表达系统及蛋白纯化方法获得其重组蛋白，使用重组蛋白免疫小鼠获得其多克隆抗体，并采用半定量PCR及Western blotting方法检测Bmintegrin β1的时空表达。文中得到家蚕整合素Bmintegrin β1的3种剪切形式，且这3种剪切体具有长为2 502 bp的开放阅读框架，编码833个氨基酸。根据预测该蛋白含有Integrin-B-tail、跨膜区等一系列整合素家族保守的结构域。进化树结果表明该蛋白与同为鳞翅目成员的烟夜蛾和黑脉金斑蝶的整合素蛋白最为接近。此外我们通过原核表达系统及亲和层析技术获得了高纯度的Bmintegrin β1蛋白，进一步制得多克隆抗体。并通过免疫印迹反应证明该抗血清能特异识别Bmintegrin β1重组蛋白。之后通过半定量PCR及免疫印迹检测，结果显示该蛋白在家蚕的各组织以及血细胞各时期均有较高表达且在血液中表达量最高。总之，这项研究为家蚕整合素家族的研究提供了基础。

摘要:通过生物信息学分析，在本实验室分离得到的1株羽毛高效降解菌微白黄链霉菌Fea-10基因组中发现基因gm2886 (GenBank Accession Number: KY368946) 可能编码一新的角蛋白酶，通过在该基因5'端和3'端分别连接红霉素抗性基因启动子 (PermE) 和组氨酸标签编码序列并构建在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pSET152上，接合转入密旋链霉菌Streptomyces pactum ACT12，从而实现了异源表达，蛋白纯化后对其酶学性质进行了研究。实验结果表明，带有组氨酸标签编码序列的gm2886在密旋链霉菌ACT12中可以表达分泌得到1个大小约为36 kDa的蛋白。多种底物检测表明异源表达得到的重组蛋白GM2886-His6具有蛋白酶活性，可以降解水不溶性的天青角蛋白和羽毛粉；其最适温度和pH分别为50 ℃和pH 10.0。PMSF可抑制GM2886-His6的酶活，而EDTA不能，说明该酶为丝氨酸蛋白酶。本研究为从分子水平上解析羽毛高效降解菌Fea-10的活性机理，从而进一步开发其应用潜力提供了基础，同时可为该类蛋白酶的研究提供借鉴。

摘要:构建编码NMDAR1蛋白膜外片段的原核表达重组质粒，在大肠杆菌中诱导表达、纯化并鉴定其免疫反应原性。根据人NMDAR1基因序列，利用Phyre 2软件预测蛋白的三级结构并分析其结构域。设计引物用RT-PCR方法扩增编码NMDAR1膜外蛋白不同结构域的核酸片段，并插入原核表达载体pCold-SUMO构建重组质粒。转化DH5α感受态细胞，菌落PCR鉴定，阳性单克隆进行测序验证。鉴定正确的重组体转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导目的蛋白的表达和纯化，Ni-NTA柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白，酶切切除融合蛋白6His-SUMO标签，用AKTA Purifier进行凝胶过滤层析，收集纯化蛋白。利用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，并用Western blotting进行免疫反应性鉴定。克隆获得NMDAR1膜外部分的三段DNA序列，分别是NR1-M1 (编码19–393 aa)、NR1-S1 (编码394–544 aa) 和NR1-S2 (编码663–800 aa)。其中NR1-S1和NR1-S2片段之间以G (甘氨酸) 和T (苏氨酸) 作为接头连接成为复合片段。经菌落PCR筛选和测序鉴定，成功构建了重组质粒pCold-SUMO-M1和pCold-SUMO-S1-GT-S2。SDS-PAGE鉴定结果表明重组质粒在大肠杆菌中经诱导可表达可溶性NR1-M1及NR1-S1-GT-S2蛋白。对表达产物进行亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的目标蛋白。Western blotting证实纯化的目的蛋白能与相应抗体发生特异性结合反应。本研究成功构建了NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的原核表达系统，并获得了具有免疫反应性的NR1-M1及NR1-S1-GT-S2纯化蛋白。该蛋白有望用于NMDAR1蛋白的功能研究及自身抗体的检测。

摘要:脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶 (3-Deoxy-D-manno-octulosonate 8-phosphate synthase，KDO8PS) 是一种参与细胞壁八碳糖 (KDO) 合成代谢的关键酶之一。为了解该酶催化特性和功能，本实验采用逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 方法首次分离得到毛竹PeKDO8PS基因。序列分析表明该基因CDS区全长876 bp，编码291个氨基酸。通过IPTG诱导，含有该基因的原核表达载体在大肠杆菌中获得了大量可溶性活性蛋白表达；经Ni-NTA亲和层析和分子筛层析 (SEC) 方法进行酶蛋白的两步分离纯化，得到纯度大于90%以上的高纯度酶；SEC结果发现，纯化后目的蛋白KDO8PS在溶液中主要以二聚体形式存在。戊二醛交联实验证实该酶具有形成二聚体/四聚体的可能性，进一步通过超速离心 (AUC) 分析，发现水溶液中KDO8PS在高浓度时二聚体会聚合转化形成四聚体。推测形成二聚体/四聚体可能是保持酶稳定性的一种机制。通过测定毛竹KDO8PS酶学性质，发现该酶催化反应的pH值范围在4.0?9.0，最适pH值为8.0；热稳定性范围 25?65 ℃，最适作用温度为55 ℃；各种二价金属阳离子在低浓度下均对酶活性存在不同程度的抑制作用，其中以Fe3+对酶活性的抑制作用最强，而低浓度EDTA可通过螯合作用消除金属离子的抑制作用。以上研究结果为植物KDO8PS蛋白结构与功能及其在新型抗生素领域中的工业化应用提供了重要理论基础。

摘要:谷胱甘肽 (Glutathione，GSH) 是具有多种生理功能的非蛋白质类巯基化合物，已广泛应用于药品、食品等行业，且市场需求量逐年增加。遗传工程育种是提高细胞内GSH含量的重要策略，但在遗传操作过程中使用到的营养缺陷型遗传标记可能会影响菌株的正常生长，且不利于高密度发酵的进行。为回复工程菌株的营养缺陷型，利用gRNA转录表达框和靶基因同源DNA片段直接共转化酵母细胞，由细胞内表达的Ⅱ型CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9) 介导的基因组编辑技术将营养缺陷型GSH工程菌株W303-1b/FGP回复为原养型菌株。结果显示，与营养缺陷型菌株相比，原养型菌株生长周期缩短，且可以利用简单的合成培养基进行培养，方便菌株的大规模培养。

摘要:菌蜕 (Bacterial ghosts) 是一种只含有细菌内、外膜结构的细菌空壳，可作为新型疫苗和传递载体。本研究通过3种方式制备禽致病性大肠杆菌 (Avian pathogenicity Escherichia coli，APEC) 分离株DE17的菌蜕，评价不同的菌蜕制备方法。结果表明，利用噬菌体PhiX174的裂解基因E构建的溶菌质粒pBV220-E制备DE17菌蜕，对DE17菌株裂解率可达99.9%，扫描电镜观测结果表明，在DE17两端或中部形成可见的跨膜孔道，呈现典型的菌蜕结构。利用合成的细胞穿透肽MAP (KLALKLALKALKAALKLA) 作用于DE17制备菌蜕，结果表明，10 μmol/L的MAP可实现对OD600=0.1的DE17完全灭活，扫描电镜虽未看到明显的跨膜孔道，但细菌的膜结构呈现沟壑状，而构建的可表达MAP的溶菌质粒pBV220-MAP并不能实现对DE17的裂解作用。本研究通过比较分析不同APEC菌蜕的制备方式，为进一步研究菌蜕疫苗和提高菌蜕疫苗的生物安全性提供参考。

摘要:碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺，与传统的高温碱煮相比，具有保护纤维、降低能耗和化学污染的优势，因此获得高表达的碱性果胶酶基因工程菌，低成本生产碱性果胶酶对于纺织工业节能减排具有重要的意义。前期研究工作已经将来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的碱性果胶酶基因pel经过密码子优化后在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中成功表达。本研究为了提高其表达量，首先利用启动子和信号肽都优化的载体pHBM905BDM进行表达，摇瓶酶活从68 U/mL增加到100 U/mL，qPCR检测转录水平提高了27%。再利用果胶底物平板筛选水解圈大的转化子进行摇瓶发酵获得菌株GS115-pHBM905BDM-pels4，摇瓶酶活为536 U/mL。随后构建重组质粒pPIC9K-pels，电转化菌株GS115-pHBM905BDM-pels4，利用抗生素G418平板进行筛选，在含4 mg/mL的G418抗性平板上得到菌株GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1，摇瓶酶活为770 U/mL，qPCR测定含7个拷贝目的基因。最后将该菌株在5 L的发酵罐中进行高密度发酵，果胶酶酶活提高至2 271 U/mL。该碱性果胶酶酶活已达到目前酵母表达的最高水平，说明其具有很好的应用于纺织工业的潜力。

摘要:以大肠杆菌BL21(DE3) 为表达宿主，构建两株分别表达L-苏氨酸脱氨酶 (LTD，基因来源大肠杆菌) 和共表达亮氨酸脱氢酶 (LDH，来源蜡样芽孢杆菌)/葡萄糖脱氢酶 (GDH，来源枯草芽孢杆菌) 的重组大肠杆菌，在此基础上，构建了一种以L-苏氨酸和D-葡萄糖为底物联产L-2-氨基丁酸 (L-ABA) 和D-葡萄糖酸的全细胞转化系统。通过转化条件 (温度、pH、细胞通透性和菌体量) 优化，并采用分批补料策略，164 g/L L-苏氨酸和248 g/L D-葡萄糖最终转化得到141.6 g/L的L-ABA和269.4 g/L的D-葡萄糖酸，时空得率分别达到7.1 g/(L?h) 和13.5 g/(L?h)，得率超过99%。本研究使用价格低廉的大宗化学品高效率生产出有较高附加值的产物，全细胞转化系统无需额外添加昂贵的辅酶，更适用于工业化生产。

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