摘要:兽医生物技术是生物技术在兽医领域的应用，虽然起步相对滞后，但近十年来发展比较迅速。本专刊通过4个栏目，即综述、新技术、新方法和其他，介绍了新发和再发动物传染病的诊断、疫苗等领域的研究进展。

摘要:疫苗接种是预防传染病的一种重要策略。然而，目前许多疫苗在生产过程中存在抗原产量偏低的问题，由此导致疫苗的生产成本较高、有效抗原含量低和免疫效果差等问题。为此，研究人员尝试了不同策略来提高病毒疫苗抗原的产量，以改进疫苗的质量并降低生产成本。文中总结了近年来提高疫苗中病毒抗原产量的主要方法，包括改造病毒基因、改善病毒对细胞的适应性、优化抗原表达体系、改进疫苗生产工艺等方面。并分析了不同策略的优点和存在的问题，提出了提高疫苗抗原产量的一些设想。

摘要:尝试利用CRISPR-Cas9系统敲除山羊基因组中β-乳球蛋白 (BLG) 基因，以实现在BLG基因座敲入人乳铁蛋白 (hLF) 基因，并进一步探讨了不同浓度RAD51蛋白激活剂 (RS-1) 对同源重组效率的影响。首先针对山羊BLG的第一外显子设计并构建了sgRNA和Cas9共表达载体pCas9-sgBLG，将该载体转染至山羊耳成纤维细胞，利用PCR和T7EN1法验证了其基因组编辑活性；然后进一步构建了BLG基因打靶载体pBHA-hLF-NIE (包含NEO/EGFP)；将该打靶载体与pCas9-sgBLG载体共转染至山羊耳成纤维细胞，分别用0、5、10和20 μmol/L RS-1处理细胞，分析了绿色荧光蛋白的表达效率；同时用800 μg/mL G418对不同浓度RS-1处理后的细胞进行筛选，挑取EGFP阳性细胞克隆，进一步通过PCR和测序鉴定hLF定点敲入的阳性细胞克隆。结果显示：设计的sgRNA编辑山羊BLG位点的效率为25%?31%；报告基因的表达效率提示RS-1可以促进基因敲入效率的提高，其效率与RS-1浓度呈正相关，20 μmol/L RS-1处理组的效率是对照组的3.5倍；利用G418筛选hLF敲入阳性细胞克隆后，当RS-1浓度为0?10 μmol/L时，hLF敲入效率随着RS-1浓度增加而升高，在10 μmol/L时阳性克隆率最高为32.61%，然而在20 μmol/L时敲入阳性克隆率下降至22.22%，且衰老细胞克隆增多。以上结果表明，利用CRISPR-Cas9系统可以实现在山羊耳成纤维细胞中敲除BLG基因和敲入hLF基因，且适宜浓度的RS-1可以显著提升基因敲入效率，本试验为高效利用CRISPR-Cas9系统获得基因敲入的细胞提供了参考依据。

摘要:猪瘟 (Classical swine fever，CSF) 是严重危害养猪业的一种烈性传染病，常造成巨大的经济损失，是世界动物卫生组织要求必须申报的动物疫病之一。猪瘟的病原是猪瘟病毒 (Classical swine fever virus，CSFV)，CSFV的结构蛋白由衣壳蛋白 (C) 和囊膜糖蛋白 (Erns、E1、E2) 构成。E2蛋白是CSFV主要的保护性抗原，可以诱导机体产生中和抗体，从而抵抗CSFV的感染。此前，本团队制备了一株针对CSFV E2蛋白的鼠源单克隆抗体HQ06。文中将HQ06抗体重链和轻链可变区基因与猪源恒定区基因嵌合后克隆至真核表达载体，利用中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞制备一株针对CSFV E2蛋白的嵌合猪源化单克隆抗体cHQ06。应用ELISA、Western blotting试验证实了cHQ06与CSFV E2蛋白具有良好的反应性；中和试验结果表明cHQ06可以中和CSFV。综上所述，本研究应用CHO细胞稳定表达了具有良好反应性和中和活性的针对CSFV E2蛋白的嵌合猪源化单克隆抗体cHQ06，为研究CSFV E2蛋白结构、功能以及开发新型的CSFV诊断和治疗制剂奠定基础。

摘要:为研究本实验室制备的一株抗蓝舌病病毒8型 (BTV-8) VP2蛋白的单克隆抗体 (MAb) 3G11识别的B细胞抗原表位，利用噬菌体肽库展示技术对3G11识别的抗原表位进行筛选并鉴定。经过4轮淘选后挑取蓝斑测序，测序结果经分析后获得KLLAT序列，与BTV-8 VP2蛋白氨基酸序列比对后获得共同的短肽序列为283LL284；合成4种短肽序列：KLLAA、KALAT、KLAAT和KLLAT，与3G11细胞上清和腹水分别进行间接ELISA鉴定，结果表明，短肽KLLAA和KLLAT与3G11细胞上清及腹水具有较强的结合能力；与24种BTV标准阳性血清反应结果表明，这两种短肽都可与BTV-8阳性血清发生特异性反应；序列分析结果可见，该表位的氨基酸序列283LL284在不同来源的BTV-8毒株间保守，确定283LL284为MAb3G11识别抗原表位的关键氨基酸。本研究为建立8型BTV特异性的免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究奠定了基础。

摘要:H9亚型禽流感在全球范围内广泛流行，控制其传播需监测H9亚型禽流感病毒的感染情况及疫苗的免疫效果。为了建立便于检测且灵敏特异的H9亚型禽流感抗体间接ELISA方法，本实验利用不同亚型之间变异较大的H9亚型禽流感病毒HA蛋白的头部球状区作为包被抗原，确定了最佳复合封闭液和抗体稀释液，提高了其特异性。结果显示建立的ELISA方法灵敏度高于血凝抑制试验 (HI)，且与H3N2、H5N2、H7N9亚型流感病毒及新城疫病毒 (NDV)、鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)、鸡传染性法氏囊病毒 (IBDV) 和产蛋下降综合征病毒 (EDSV) 的阳性血清均无交叉反应。另外，利用该方法及HI试验对200份临床鸡血清样本进行检测，两种检测方法的符合率达97%，且存在较高的相关性 (R2=0.981 1)。

摘要:最近，新发现的猪丁型冠状病毒 (Porcine deltacoronavirus，PDCoV) 可导致仔猪腹泻，亟待建立有效准确的核酸及血清学检测方法并调查猪场的PDCoV感染情况。本研究采用针对病毒M基因的探针荧光定量RT-PCR检测方法，对2014?2015年间收集的河南、湖南、浙江、江西、安徽、河北、黑龙江、江苏、山东和上海等10个省市收集的共254份腹泻仔猪小肠匀浆或粪便样本进行检测，共检出11份PDCoV阳性样本，总阳性率为4.33%。采用在昆虫细胞表达纯化的PDCoV囊膜S1蛋白为包被抗原，建立间接酶联免疫吸附试验 (ELISA) 方法，检测2015?2016年间收集的来自江苏、湖南、浙江等7个省份的609份具有腹泻症状的猪血清样品，抗PDCoV S1抗体检出率为44.17% (269/609)。上述建立的两种方法分别针对病毒的RNA或抗体对PDCoV进行特异性检测，可以应用于PDCoV流行情况的监控。

摘要:为了获得猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) nsp4的抗体，根据HP-PRRSV TA-12株 (GenBank Accession No. HQ416720) 的nsp4基因序列，设计并合成一对引物。用RT-PCR扩增后克隆到原核表达载体pET-28a(+) 中，构建重组质粒pET28a-nsp4，转化至Trasseta(DE3)，经IPTG诱导重组蛋白获得了高效可溶性表达，大小约为26 kDa。经镍离子亲和柱 (Ni+-NTA) 纯化获得了高纯度重组蛋白，将纯化的nsp4蛋白免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。ELISA检测抗体效价可达106，Western blotting和IFA检测结果表明所制备的多克隆抗体具有良好的免疫反应特异性，能够识别PRRSV感染宿主细胞中的nsp4蛋白。本研究成功制备了针对nsp4的多克隆抗体，为进一步研究nsp4的功能及PRRSV致病机制奠定了基础。

摘要:旨在建立蓝舌病病毒4型 (BTV-4) 特异性抗体ELISA检测方法，为蓝舌病的免疫学诊断提供新的技术。利用制备的两株抗4型BTV VP2蛋白的单克隆抗体4A-1G7和4B-1B6，建立BTV-4特异性竞争ELISA抗体检测方法。利用该方法同时对50份羊和牛BTV阴性血清进行检测，分别确定两种方法阻断率临界值为49%和40%。利用标准阳性血清检测的试验结果表明，该方法的敏感性、特异性和重复性符合OIE通用标准。同时，4A-1G7和4B-1B6两种竞争ELISA方法联合作用，可以检测感染4、18和20型BTV的血清。研究结果为建立以上各型BTV的检测方法提供了基础。

摘要:为了解引起猪腹泻疫病的病毒性病原种类及感染现状，本研究首先针对7种报道较少但可引起猪腹泻的病毒性病原建立了多重RT-PCR检测方法，包括猪捷申病毒 (PTV)、猪萨佩罗病毒 (PSV)、猪丁型冠状病毒 (PDCoV)、猪嵴病毒 (PKV)、猪札幌病毒 (PSaV)、猪星状病毒 (PAstV)和猪环曲病毒 (PToV)。利用该方法对419份临床腹泻粪便样品进行筛检，结果显示PKV检出率最高，阳性率达26.98%–45.79%；PKV和其他病原混合感染率达9.52%–18.54%。基于PKV的高检出率及其在腹泻病中扮演重要角色，本试验进一步选取3个PKV阳性样品进行全基因组序列测定及遗传进化分析。测序结果表明，这3个阳性样品感染的PKV均归属于猪嵴病毒属，且与其他动物嵴病毒遗传距离较远，分别标记为CM-PKV、JS-PKV和PD-PKV；它们的全基因组同源性为88.1%–89.1%；CM-PKV与2013年报道的中国株JS-02a-CHN/2013同源性最高，而JS-PKV和PD-PKV则与2008年报道的匈牙利株K-30-HUN/2008/HUN同源性最高。这说明上海不同地区猪群中存在的PKV有明显的遗传差异，这种差异与病毒致病力的关系还有待深入研究。本研究为深入了解PKV的流行情况及探讨其在猪腹泻疫情中的作用提供了参考。

摘要:层粘连蛋白 (Laminin) 是细胞外基质的重要成分，对细胞生长、分化、运动、组织修复和再生等发挥重要调节作用。Laminin包括有A1-5、B1-4和C1-3共12个编码基因，以不同的表达模式发挥功能。其中Laminin A5作为可以支持多能细胞生长的重要基因，得到广泛研究。但是，在所有猪相关数据库中，均未能查到Laminin A5的信息。文中通过生物信息学分析，首次确认了猪Laminin A5的存在，并进行了克隆和测序验证。为揭示Laminin基因家族在猪诱导多能干细胞 (iPSCs) 中的表达特性，检测了Laminin在猪各组织、体细胞和iPS细胞中的不同表达模式。发现Laminin B1基因在猪多能干细胞中存在特异性可变剪接体 (LAMB1-a)，且该可变剪切体的表达量与猪多能干细胞的重编程程度呈正相关。为进一步揭示和利用Laminin作为细胞外基质，用于猪多能干细胞的获取和培养优化奠定了基础。

摘要:旋毛虫plancitoxin-1-like (Ts-Pt) 是旋毛虫125种DNaseⅡ家族蛋白中唯一具有典型DNaseⅡ活性区域HKD基序的核酸酶，且普遍认为，组氨酸位点是DNaseⅡ的活性氨基酸位点。为研究Ts-Pt活性位点突变体蛋白的核酸酶活性，利用重叠PCR方法获得Ts-Pt活性位点突变体片段，以pET-28a(+)为载体构建重组表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达。重组Ts-Pt突变体蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用琼脂糖凝胶电泳法和核酸酶酶谱分析重组Ts-Pt突变体蛋白的核酸酶活性。成功构建含Ts-Pt突变体重组质粒的基因工程菌，SDS-PAGE和亲和层析纯化结果显示，重组Ts-Pt突变体蛋白呈包涵体表达。重组蛋白经复性后并没有表现出核酸酶活性，但核酸酶酶谱分析结果显示，包涵体表达的重组Ts-Pt突变体蛋白表现出降解DNA的能力。同时，N端和C端活性位点H及HCK和DHSK突变并不影响Ts-Pt的核酸酶活性，研究结果为进一步研究庞大的DNaseⅡ家族蛋白在旋毛虫发育和感染方面的作用提供一定的参考。

摘要:猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 能抑制宿主Ⅰ型干扰素及其诱导的细胞抗病毒免疫应答，但是PEDV抑制Ⅰ型干扰素应答的分子机制尚不明了，尤其是PEDV非结构蛋白 (Nonstructural proteins，nsps) 在Ⅰ型干扰素应答中的调控作用研究不多。为研究PEDV非结构蛋白1 (nsp1) 对细胞Ⅰ型干扰素应答的影响，构建了真核表达载体pCAGGS-nsp1，采用Western blotting和间接免疫荧光试验确定nsp1在细胞中的表达。通过报告基因法、ELISA以及病毒复制抑制试验评估nsp1对Ⅰ型IFN的影响。结果显示，nsp1在转染细胞和病毒感染细胞中均高效表达；双荧光报告基因试验结果表明，nsp1能显著抑制IFN-β启动子活性，且具有剂量依赖性。ELISA结果显示，nsp1能显著抑制IFN-β蛋白的表达。水泡性口炎病毒 (VSV) 复制抑制试验结果显示，nsp1明显抑制poly(I:C)介导的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。结果提示，nsp1作为PEDV的保守蛋白，具有拮抗Ⅰ型干扰素启动子活性和应答的功能，为揭示PEDV逃逸宿主天然免疫应答的机制和研发新型高效抗PEDV疫苗奠定基础。

摘要:鞭毛蛋白根据能否组装可以表达为单体或多聚体。目前，关于它们之间的区别少有报道。文中，将重组质粒pET-fliC/M2e2分别导入大肠杆菌BL21(DE3) 和沙门菌SL5928中来表达嵌合鞭毛蛋白mfliC/M和pfliC/M，然后分析它们的组装特性。SDS-PAGE结果表明，两重组菌成功表达了嵌合鞭毛蛋白。透射电镜观察显示，在重组大肠杆菌表面未见鞭毛，而重组沙门菌表面呈现鞭毛。将嵌合蛋白纯化后，圆二色谱 (Circular dichroism，CD) 分析表明，两者的CD信号明显不同，pfliC/M的CD信号与野生型鞭毛蛋白一致，而mfliC/M基本上没有CD信号出现。动态光散射分析表明，mfliC/M的聚集程度明显低于pfliC/M。将嵌合蛋白转染小鼠腹腔细胞3 h后，两者均能诱导产生IL-1β，但mfliC/M组高于pfliC/M组。以上结果对于鞭毛蛋白表达形式的选择具有重要的参考价值。

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