摘要:筛选是制约酶定向进化改造的瓶颈。为解决这一难题，近年来一系列基于组合活性中心饱和突变 (Combinatorial active-site saturation test，CAST) 及迭代饱和突变 (Iterative saturation mutagenesis，ISM) 的半理性设计新方法被开发出来，包括单密码子饱和突变 (Single code saturation mutagenesis，SCSM)、双密码子饱和突变 (Double code saturation mutagenesis，DCSM) 和三密码子饱和突变 (Triple code saturation mutagenesis，TCSM)。通过构建“小而精”的高质量突变体文库，对特定靶点进行组合突变，并成功应用于多种生物催化剂的立体/区域选择性及催化活力等多参数的改造。文中综述了近年来定向进化技术的最新进展及其在生物催化剂定向改造中的应用。

摘要:蚜虫是重要的农业害虫，每年造成数以亿计的经济损失。[反]-β-法尼烯 [(E)-β-farnesene，EβF] 是绝大多数蚜虫报警信息素的主要成分，可使蚜虫产生骚动、从植株上脱落，并吸引蚜虫天敌，有效控制蚜虫危害。EβF合成酶是催化合成EβF的关键酶，目前该基因已从薄荷、香橙、花旗松、黄花蒿、洋甘菊等植物中得到分离鉴定。植物中表达EβF合成酶基因以催化法呢基焦磷酸 (Farnesyl diphosphate，FPP) 合成EβF是控制蚜虫危害的重要策略。文中概括了当前植物抗蚜转基因研究现状，综述了植物EβF合成酶基因及其在植物抗蚜分子育种中的应用。针对当前转基因植物的EβF生成量较低等问题，展望了EβF合成酶基因在植物抗蚜分子育种中的应用前景和研究策略。

摘要:柠檬烯和红没药烯均为植物天然产物，分别属于单萜类和倍半萜类化合物，能够预防和治疗癌症等多种疾病。以其作为前体物，还可以转化合成多种具有高附加值的工业产品，例如药品、保健品、化妆品及生物燃料等。目前柠檬烯和红没药烯的工业生产主要是通过植物提取法实现的，但从植物组织中提取柠檬烯和红没药烯存在着产物含量低和分离纯化困难等缺点。微生物代谢工程的快速发展为这些植物天然产物的生产提供了一条更具潜力的生物合成路线。利用微生物代谢工程技术构建生产这些有价值的植物天然产物的微生物细胞工厂具有绿色清洁、可持续发展和经济效益好等独特优势。文中系统综述了近年来代谢工程技术在微生物合成柠檬烯和红没药烯过程中的应用进展，包括所涉及的宿主菌株、关键酶、代谢途径及其改造等，并探讨了其未来发展方向。

摘要:重组凝血因子Ⅷ (rFⅧ) 替代疗法是目前临床上治疗A型血友病最为有效的方法。过去十几年的临床试验已经验证了rFⅧ替代疗法的安全性和有效性，但由于FⅧ的半衰期较短，患者需要隔天或者每周3次进行静脉注射治疗。长期频繁静脉注射治疗不仅给患者带来肉体上的痛苦，还容易产生FⅧ抗体，严重影响治疗效果。以下就目前长效型重组凝血因子Ⅷ的研究进展及存在的主要问题进行了综述。

摘要:旨在建立一种快速鉴定猪肺炎支原体 (Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp) 血清体液免疫显性蛋白抗原的方法。通过构建pGEX-6P-1-mhp366重组表达质粒并转入大肠杆菌BL21(DE3)，将GST-Mhp366重组蛋白进行原核表达。将GST-Mhp366重组菌和GST工程菌裂解液加入谷胱甘肽包被板进行抗原包被，分别与17份Mhp阳性血清和13份Mhp阴性血清反应，通过对抗原包被量、封闭液、血清和二抗稀释度的优化，确定间接ELISA的反应条件。最终确定GST-Mhp366重组菌和GST工程菌裂解液原液为抗原的最佳包被量，PBS+10% FBS+2.5%脱脂奶粉为最佳封闭液，分别将血清按照1∶500稀释、酶标二抗按照1∶40 000稀释作为最佳工作浓度，从而建立了一种基于间接ELISA的快速鉴定Mhp血清体液免疫显性蛋白抗原的方法，同时通过已知的血清体液免疫显性蛋白Mhp156和Mhp364对所建立的方法进行了验证。该方法的建立能够用于在基因组水平高通量筛选Mhp血清体液免疫显性蛋白抗原，并为Mhp初乳体液免疫和黏膜免疫显性蛋白抗原鉴定方法的建立奠定基础。

摘要:Mig1和Snf1是酿酒酵母葡萄糖阻遏效应的两个关键调控因子。为了提高酿酒酵母工程菌同时利用葡萄糖和木糖的能力，分别对MIG1和SNF1基因进行了单敲除和双敲除，并通过摇瓶发酵实验和RNA-Seq转录组分析，初步揭示了Mig1和Snf1可能影响葡萄糖和木糖共利用表达差异基因的层级调控机制。研究结果表明，MIG1单敲除对混合糖的共利用影响不大；SNF1单敲除会加快混合糖中木糖的利用而且葡萄糖和木糖可以被同时利用，这可能归因于SNF1单敲除会解除对一些氮分解代谢阻遏基因表达的抑制，从而促进了细胞对氮源营养的利用；进一步敲除MIG1，会解除更多氮分解代谢阻遏基因表达的抑制，以及一些碳中心代谢途径基因表达上调。虽然MIG1和SNF1双敲除菌株利用葡萄糖加快而利用木糖变慢，但是葡萄糖和木糖可以被同时利用，进而加快乙醇的积累。综上所述，MIG1和SNF1的敲除导致氮分解阻遏基因表达上调，有助于促进葡萄糖和木糖的共利用；解析Mig1和Snf1对氮分解阻遏基因的层级调控作用，为进一步提高葡萄糖和木糖的共利用提供新的靶点。

摘要:木聚糖酶是一种备受关注的糖苷水解酶，能够应用于酿造、饲料、制药、生物能源等多个领域，但是目前大部分木聚糖酶在低于30 ℃的环境中活力较低。为了获得在较低温度下具有高活力的木聚糖酶，从青霉L1 (Penicillium sp. L1) 中克隆到一条GH11木聚糖酶基因XYN11A，并在毕赤酵母GS115中进行异源表达。经过纯化和酶学性质测定，该酶的最适pH和最适温度分别为3.5?4.0和55 ℃，能够在酸性和中性缓冲液 (pH 1.0?7.0) 中以及40 ℃下保持稳定，同时对所有已测试的金属离子和化合物都有一定的抗性。值得注意的是，该酶具有GH11家族中比较高的比活力6 700 U/mg，另外，该酶在较低温度20?40 ℃亦可展现出较高的酶活力 (24%?58%)。经过16 h的榉木木聚糖水解实验，该木聚糖酶的水解产物主要是木二糖、木三糖和木四糖，几乎不产生单体木糖。因该酶同时具有产寡糖、较低温度下活力高以及嗜酸性等3种特性，XYN11A在食品和饲料工业中具有巨大的应用潜力。

摘要:家蚕头部是一个神经中枢和感受的器官，其头部含有触角和感觉毛，感受外界的信号，并将外界信号传送到大脑进行反应。保幼激素主要是由咽侧体合成和分泌的，而保幼激素结合蛋白是保幼激素转运和发挥功能的载体，在昆虫体内具有极其重要的功能。文中通过SilkDB和NCBI数据库筛选并鉴定到一个新的具有保幼激素结合蛋白家族保守结构的蛋白BmTOL，其编码基因编号为BGIBMGA003404 (GenBank登录号：KY681053)。利用原核表达系统成功表达了该蛋白，通过Ni-NTA亲和层析的方法获得了BmTOL的重组蛋白并制备了多克隆抗体。组织表达分析发现无论是转录水平还是蛋白水平BmTOL在头部都是高量表达，且Bmtol基因在起蚕时表达量较高，在5龄和蛹期表达量较低，而在化蛾后表达量又开始上调。免疫组化结果显示BmTOL蛋白定位在头部的皮层、触角和脑中，推测其可能与头部信息传递有关，为家蚕的生长发育和行为调控提供重要的信息来源。

摘要:亲环素A（Cyclophilin A，CypA）是肽基脯氨酰顺/反异构酶家族成员，主要分布于细胞质中，当细胞受到外界刺激时会分泌到细胞间隙，与CD147以配体-受体形式结合，促进炎症细胞的趋化。利用大肠杆菌BL21表达并纯化CypA蛋白，利用该蛋白刺激小鼠的骨髓来源巨噬细胞（BMDM）。实时荧光定量PCR和ELISA试验结果发现，BMDM分泌的IL-1β等炎症因子的表达水平均显著上调，表明胞外CypA具有促进炎症发生的作用。同时以CypA蛋白为免疫原制备多克隆抗体，用于LPS诱导的小鼠急性肺炎的治疗试验。与未治疗组相比，anti-CypA抗体治疗组小鼠的肺组织表面出血点较少，损伤程度减轻，肺组织和血液中IL-1β的表达量显著下降，表明anti-CypA抗体对LPS诱导的炎症具有一定的治疗效果。本研究以胞外CypA-CD147的相互作用为靶点，利用anti-CypA抗体抑制炎症反应，为开发抗炎症药物提供了一种新的思路和策略。

摘要:为制备抗卡他莫拉菌 (Moraxella catarrhalis，Mc)表面蛋白UspA1胞外结构域的多克隆抗体 (PcAb)，对UspA1蛋白进行生物信息学分析，获取胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的基因序列并引入大肠杆菌偏好性密码子，对其优化后化学合成全基因序列。将该基因序列按常规方法克隆入表达载体pET-28a(+)后表达重组UspA1-His融合蛋白并纯化。以该纯化抗原免疫新西兰大白兔，经4次免疫后，用Protein A亲和层析柱从抗血清中纯化出抗UspA1-His融合蛋白PcAb IgG。经免疫荧光法、酶联免疫吸附法及Western blotting鉴定，抗UspA1-His融合蛋白PcAb能特异性识别UspA1蛋白的表面暴露区。该多抗的制备为下一步建立卡他莫拉菌快速检测技术奠定了基础。

摘要:CD36作为重要的清道夫受体密切参与了巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄取作用，为了进一步研究CD36的功能，本文利用慢病毒介导的shRNA干扰技术，构建了CD36基因沉默巨噬细胞 (J774A.1) 株，并以此为模型分析了CD36在caveolin-1蛋白表达过程中的作用。首先，针对CD36基因序列设计合成5条shRNA片段，并构建得到pLKO.1-CD36-shRNA慢病毒干扰载体，测序鉴定后与psiCHECK-Ⅱ-CD36载体共转染入293T细胞中，筛选出有效的CD36-shRNA。将慢病毒干扰载体与病毒包装质粒共转染入293T细胞，包装得到慢病毒颗粒，之后感染J774A.1细胞，经嘌呤霉素筛选后得到CD36基因沉默稳转细胞株。Western blotting及激光共聚焦检测结果表明CD36基因沉默效率达90%，并且伴随着CD36的基因沉默，与之结合的DiI-oxLDL也随之大幅降低，证明构建成功具有良好生物学活性的CD36基因沉默细胞株。最后，抑制剂处理及oxLDL给药刺激实验结果表明，CD36的基因沉默能够显著降低JNK及ERK的磷酸化水平，进而抑制了caveolin-1的蛋白表达，表明CD36能够经由JNK及EKR信号传导调节caveolin-1的蛋白表达。

摘要:通过生物信息学手段对9种硬骨鱼转座组进行注释。结果表明9种硬骨鱼类转座组大小和构成差异显著，其转座组含量从高到低分别为斑马鱼、矛尾鱼、青鳉鱼、罗非鱼、花斑剑尾鱼、大西洋鳕鱼、三刺鱼、金娃娃和红鳍东方鲀，转座子含量和基因组大小呈正相关。DNA转座子在硬骨鱼类中具有多样性高和含量差异大的特点 (0.50%–38.37%)，是硬骨鱼类转座组差异的主要决定因素，其中hAT和Tc/Mariner超家族是硬骨鱼类主要的DNA转座子。RNA转座子在硬骨鱼类中也具有多样性高的特点，其中LINE转座子占硬骨鱼类基因组的0.53%–5.75%，共检测到14个超家族分布，其中L1、L2、RTE和Rex转座子扩增较为明显，LTR转座子除了在斑马鱼和三刺鱼中含量达到5.58%和2.51%，在大多硬骨鱼类基因组中的含量低于2%，在硬骨鱼类中共检测到6个LTR转座子 (Copia、DIRS、ERV、Gypsy、Ngaro和Pao) 超家族分布，其中扩增最为明显的是Gypsy。而SINE转座子在硬骨鱼类中扩增最弱，仅在斑马鱼和矛尾鱼中分别达到3.28%和5.64%，在其他7个物种中低于1%。SINE中tRNA、5S和MIR三个超家族在部分硬骨鱼类中有一定程度扩增。本研究表明硬骨鱼类转座组具有多样性丰富、差异大的特点，转座组差异与硬骨鱼基因组大小有很强的相关性，转座组是决定硬骨鱼基因组大小的重要因素。

摘要:为克服抗菌肽易被蛋白酶降解及对宿主大肠杆菌的杀伤作用，并进一步提高大肠杆菌系统的表达能力，以棘胸蛙Paa spinosa抗菌肽Spinosan-C为研究对象，按照大肠杆菌密码子利用频率进行密码子优化，设计合成8拷贝的串联8×Spinosan-C基因，将合成的串联基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a，利用大肠杆菌感受态细胞Rosetta进行原核表达，获得高效表达的串联8×Spinosan-C重组蛋白，用甲酸专一性切割得到抗菌肽Spinosan-C单体。体外抑菌试验表明，切割后的抗菌肽Spinosan-C单体对测试菌生长具有抑制作用，为蛙类抗菌肽的规模化制备提供了参考。

摘要:对异戊烯基转移酶NovQ在毕赤酵母Gpn12异源表达过程中诱导剂甲醇添加量进行了探究，并以毕赤酵母Gpn12全细胞为酶源，以甲萘醌、异戊烯醇为前体，催化合成维生素K2 (MK-3)。每24 h添加2%甲醇时，NovQ表达量提高约36%。考察摇瓶中初始pH、温度、甲醇添加量、前体 (甲萘醌、异戊烯醇) 添加量、催化时间、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 添加量等7个因素对Gpn12全细胞催化合成MK-3的影响，发现催化温度、甲萘醌添加量、催化时间影响显著，对3个显著因素进行响应面优化得出催化条件为：催化温度31.56 ℃，甲萘醌添加量295.54 mg/L，催化时间15.87 h，优化后的摇瓶MK-3产量达到98.47 mg/L，与响应面预测结果一致，较优化前对照组提高了35%。在30 L发酵罐进行生物催化实验，催化时间24 h，细胞催化剂浓度220 g (干重)/L，MK-3产量达到189.67 mg/L。该方法为Gpn12规模化生产MK-3奠定了一定的基础。

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