摘要:

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摘要:功能性基因的筛选是探索生物进程、研究疾病发生发展和诠释基因功能的重要方法，在生物、医药、新治疗靶点筛选及肿瘤耐药等方面有广泛的应用。CRISPR-Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9) 技术作为近期热门的基因编辑工具，能够高通量地对基因组进行精准修饰，为实现功能性基因的筛选提供了简便高效的技术支持。文中对CRISPR-cas9技术应用于功能性基因筛选的方法及研究进展进行了综述。

摘要:植物Ⅲ型聚酮合酶 (Polyketide synthases，PKSs) 催化形成一系列结构迥异、生理活性不同的聚酮类化合物的基本骨架结构，是聚酮类化合物生物合成途径的关键酶。目前已从植物中克隆和鉴定了多种功能不同的Ⅲ型PKSs。定点突变技术是研究蛋白质结构与功能之间复杂关系的重要方法。文中综述了近年来基于定点突变的植物Ⅲ型PKSs结构与功能关系的研究进展，包括利用定点突变技术修饰各种可能影响植物Ⅲ型PKSs结构的氨基酸残基，来研究其对功能的影响 (如控制起始底物的特异性、缩合反应次数以及中间产物环化方式)，以期为植物Ⅲ型PKSs结构与功能关系的研究提供参考。

摘要:玉米赤霉烯酮 (Zearalenone，ZEN) 及衍生物是一类主要由镰刀菌属的真菌产生的非甾体雌激素类真菌毒素，广泛存在于玉米、大麦、小麦和高粱等谷物饲料及其副产品中，严重危害牲畜及人类健康，迫切需要相关的技术对ZEN进行降解脱毒。传统的物理化学方法不能有效去除谷物中的毒素，并会破坏谷物的营养成分，影响食物口感，甚至造成二次污染，因此利用生物工程技术对ZEN及其衍生物进行脱毒是未来解决这一问题的主要方法。本文简要介绍了ZEN及衍生物和降解ZEN的微生物种类、降解特性，然后详细介绍了目前研究的ZEN降解酶种类、解析唯一的蛋白结构及其异源表达和应用情况，以期为通过分子酶工程和发酵工程等生物工程技术降低ZEN降解酶的成本提供指导，从而提高食品安全。

摘要:聚3-羟基丙酸酯 (P3HP) 作为聚羟基脂肪酸酯家族 (PHAs) 中的新型热塑性塑料，具有生物降解性和生物相容性等优点。目前，未见野生微生物可以合成P3HP的报道，生产途径主要为化学法和生物法。其中，通过化学法或添加3-HP单体及其结构类似物作为前体的P3HP合成效率低、成本高且不具环保性；而通过构建和改造工程菌的生物代谢途径，能够利用廉价、可再生的碳源，已经逐渐成为研究热点。本文综述了国内外P3HP生物合成研究进展，并对甘油途径、丙二酸单酰辅酶A (Malonyl-CoA) 途径和β-丙氨酸途径等合成方法进行了优缺点分析，为生物合成P3HP的深入研究奠定理论基础。

摘要:氯代脂肪烃 (Chlorinated aliphatic hydrocarbons，CAHs) 具有高毒性、高富集性、高环境残留的特点和致癌、致畸、致突变效应，对人体健康和生态环境造成了严重危害。CAHs降解是生物和非生物过程共同作用的结果，存在多种交互作用，明晰CAHs的生物与非生物共促降解机制对于强化CAHs污染场地修复具有重要意义。文中首先对CAHs降解方式进行了分类介绍，按照还原脱氯、好氧共代谢和直接氧化三种方式总结了影响CAHs降解的典型生物与非生物降解因子。从共促降解的角度出发，系统分析并提出了诱导降解机制和协同降解机制，并对基于共促机制强化CAHs降解的工程应用与存在的技术局限进行了综述和分析，最后对未来的发展方向进行了展望。

摘要:基于质谱的蛋白质组学快速发展，蛋白质质谱数据也呈指数式增长。寻找速度快、准确度高以及重复性好的鉴定方法是该领域的一项重要任务。谱图库搜索策略直接比较实验谱图与谱图库中的真实谱图，充分利用了谱图中的丰度、非常规碎裂模式和其他的一些特征，使得搜索更加快速和准确，成为蛋白质组学的主流鉴定方法之一。本文介绍基于谱图库的蛋白质组质谱数据鉴定策略，并针对其中两个关键步骤——谱图库构建方法和谱图库搜索方法进行深入介绍，探讨了谱图库策略的进展和挑战。

摘要:我国湖南地区因水禽家禽饲养较多且密集，是流感病毒高发省份。为了监测流感病毒的变异情况，采用RT-PCR技术扩增了10株H9N2亚型流感病毒的HA和NA基因，并进行了序列测定和分析。结果显示，10株分离株均属于欧亚分支中的Y280亚系；HA碱性裂解位点序列均为RSSR↓GLT，为低致病性流感病毒特征；HA受体结合位点234位均为L，具有与人唾液酸α-2,6受体结合的特性；NA蛋白均在颈部 (63–65位) 出现氨基酸缺失，这种缺失能增加流感病毒在哺乳动物中的复制能力。提示H9N2亚型毒株近年有毒力和致病力趋于转强的可能性，因此，要加强对H9N2亚型禽流感病毒的监测，密切关注它的重组趋势。

摘要:畜禽屠宰加工、鱼粉饲料加工等一些食品工业生产过程中会释放出大量的硫化氢恶臭气体，导致周边环境的严重污染。为实现以培养异养型细菌脱除硫化氢气体的目的，取分离到的异养脱硫细菌XJ-2，通过诱变筛选得到一株高效脱硫菌株ZJNB-B3，其脱硫率达97%。基于形态学研究、API 50 CHB生理生化鉴定及16S rRNA基因测序，鉴定该菌为蜡状芽胞杆菌Bacillus cereus ZJNB-B3。该菌GenBank登录号为MF679650。降解特性研究表明，ZJNB-B3菌株对有毒的硫化物有较高耐受性，耐受上限高达300 mg/L。采用响应面法优化环境因素对菌株降解硫化物效率的影响，得到在最适培养温度30 ℃下，初始S2–浓度为211.8 mg/L、初始pH值6.72、接种量为5.04%时，菌株氧化脱硫效果最显著，经过实测在48 h产生的硫酸盐浓度为63.8 mg/L，脱硫率达97.3%。菌株在氧化硫化物时不会产生硫酸抑制菌株的生长，可以在pH值温和的环境条件下脱硫，因此，该菌有较高的工业应用价值。本研究为异养型细菌应用于工业反应器脱除硫化氢恶臭气体提供了小试研究基础。

摘要:CRM197 (Cross-reacting material 197)是白喉毒素的无毒突变体，在生物制药领域具有非常广泛的应用前景。为了实现CRM197在大肠杆菌中的无标签、可溶表达，以替代现有昂贵、复杂的白喉杆菌分泌发酵工艺，文中对目的蛋白的序列进行优化，转化大肠杆菌经IPTG诱导，目的蛋白获得了可溶性高表达，目的蛋白约占碎菌上清总蛋白的40%。超声破菌后、经阴离子交换、肝素亲和以及脱盐三步柱上层析获得纯度高于95%的CRM197样品。细胞毒性实验证明，CRM197的IC50值是白喉毒素IC50值的 2.1×107倍，是白喉类毒素IC50值的9.6倍，表明文中表达的CRM197是安全无毒的。随后，比较了高、低剂量的CRM197在小鼠体内的免疫原性，发现2 μg组三免后的抗体滴度与20 μg组的相当，可达1︰409 600。文中建立了CRM197的无标签、高效、可溶表达的大肠杆菌表达系和快速纯化体系，获得了具有较好免疫原性和安全性的重组蛋白，为该蛋白的进一步应用奠定了基础。

摘要:本研究旨在人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 的结合多肽的基础上应用嫁接抗体技术制备抗hCG单域抗体，简化单域抗体制备过程，提高多肽生化稳定性。利用单域抗体通用骨架 (cAbBCII10)，以hCG结合多肽取代互补决定区CDR1或CDR3，合成cAbBCII10嫁接抗体全基因序列并与sfGFP基因序列融合后，插入到带有His标签的原核表达载体pET30a(+) 中，成功构建了pET30a-(His6)-cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP与pET30a-(His6)- cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP融合蛋白表达质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，用IPTG诱导表达融合蛋白，得到高表达量的可溶性融合蛋白。利用Ni-NTA亲和柱纯化得到纯蛋白，应用SDS-PAGE鉴定纯化的蛋白为正确表达的目标蛋白。通过抗原抗体结合实验，发现hCG结合多肽嫁接到单域抗体通用骨架的互补决定区CDR1或CDR3后都有抗原结合活性，具有相似的抗体滴度，且嫁接到CDR3后的抗原结合活性比CDR1要高 (2–3倍)。嫁接抗体基本保留了所用单域抗体框架较为稳定的生化特性，具有一定的热稳定性和较好的碱耐受性，同时，所接入的hCG结合片段对hCG具有较特异的结合活性，为进一步优化抗原结合多肽嫁接抗体技术制备抗hCG单域抗体提供了可靠的实验基础。

摘要:生物标志物是指与生理或病理变化相关的可监测的变化。尿液作为机体的一种排泄物，不受稳态机制的调节，可以反映机体的多种变化。动物模型可以模拟人类疾病过程，监测疾病的变化，并为早期诊断提供线索。大鼠作为常用的模型动物并非所有疾病的优势模型动物，因此比较大鼠与其他动物的尿液蛋白质组，从而为其他疾病选择优势模型动物提供线索。文中通过膜上酶切切成肽段再通过液相色谱与串联质谱偶联技术 (LC-MS/MS)分析肽段信息，比较大鼠、豚鼠和金黄地鼠的尿液蛋白，结果显示3种鼠的尿蛋白数量不同，在机体不同系统中表达情况不同，参与的生物功能也不同。这为不同疾病选择不同的优势模型动物提供了依据。

摘要:构建并表达HIV-1 CAP2NC蛋白，探索其体外自组装条件。通过PCR技术扩增HIV-1 (NL4-3毒株) CAP2NC基因片段，并将其连接到原核表达载体pTO-T7，获得重组质粒pTO-T7-CAP2NC，然后转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 菌株，经疏水层析纯化后获得重组蛋白CAP2NC。SDS-PAGE结果表明，重组蛋白CAP2NC可在大肠杆菌可溶高效表达，经纯化后纯度约为95%。ELISA检测表明重组蛋白CAP2NC可被HIV-1衣壳蛋白特异性单克隆抗体识别，具有较好反应活性。重组蛋白透析后在非原性SDS-PAGE中呈现为多种聚体形式。分子筛排阻层析分析CAP2NC蛋白透析后可进行组装，负染电镜进一步观察显示CAP2NC蛋白在RNA存在条件下，可形成空心管状颗粒，其形态结构与HIV-1病毒衣壳体外自组装形成的类似。上述结果表明HIV-1 CAP2NC蛋白具有体外自组装的性质，为进一步在体外研究非成熟病毒样颗粒结构奠定基础。

摘要:神经肽在参与调控人体各种生理功能上发挥着重要的作用，如痛觉、睡眠、情绪、学习与记忆等生理活动都受到神经肽的影响。神经肽主要存在于机体的神经组织内，其他体液和器官中也有少量的分布。目前对全脑组织神经肽高通量鉴定的研究仍不足，高通量检测这些神经肽对了解神经肽的组成和功能具有重要的意义。本研究通过对小鼠全脑组织内源性肽段的萃取，运用液相串联质谱 (LC-MS/MS) 技术对全脑组织的神经肽进行检测，共鉴定到1 830条内源性肽段和99条预测神经肽肽段。这些内源性肽段的鉴定在疾病的治疗和机制研究以及药物的研发方面提供了参考价值，也为研究新的神经肽及其功能奠定了基础。

摘要:基因敲除技术是了解基因功能的重要技术手段。以大肠杆菌K-12 MG1655基因组hfq (309 bp) 和rne-710 (1056 bp) 基因为模型，首先构建Δhfq∷Spe和Δrne-710∷Spe菌株，通过融合PCR方法分别构建缺失hfq (309 bp) 和rne-710 (1056 bp) 的融合片段并连接至辅助质粒，缺失hfq和rne-710的片段经重组分别替换壮观霉素抗性盒，得到无痕敲除株Δhfq和Δrne-710。双质粒无痕敲除和融合PCR方法相结合为大片段基因缺失开辟了新的途径。

摘要:IFN-λ1是Ⅲ型干扰素家族的一个成员，具有与Ⅰ型干扰素相似的功能。此前，我们已经从毕赤酵母表达获得了可溶性重组人干扰素-λ1。然而，毕赤酵母表达中的高糖基化带来了免疫原性，影响了蛋白质的生产纯化效率。为了克服这个缺点，文中构建了一种干扰素突变体 (rhIFN-λ1-Nm)，定点突变潜在糖基化位点。AOX1启动子与α因子信号序列存在的情况下，用甲醇诱导成功地实现了rhIFN-λ1-Nm在毕赤酵母GS115胞外分泌表达。对rhIFN-λ1-Nm进行纯化，获得了纯度>98%的产品，并对糖化水平、分子量、二级结构、N末端序列等理化性质和生物活性进行了研究。研究结果表明，rhIFN-λ1-Nm糖基化水平明显降低，蛋白质生产纯化收率显著提高，而对结构和生物活性无影响；糖基化位点突变rhIFN-λ1可以被开发为IFN-λ1的替代品，有望发展成为未来的生物免疫制剂。