摘要:近年来，基因工程技术发展迅速，许多重组蛋白得以表达。其中利用植物生物反应器表达特异药物蛋白为人类一些重要疾病的预防和治疗提供了新途径。植物叶绿体遗传转化和表达系统成为目前植物生物反应器的研究热点。因结构和遗传上的特殊性，高等植物叶绿体在重组蛋白表达方面具有独特优势，外源基因表达量高、定点整合，而且叶绿体母系遗传特性保证了生物安全性。很多重要药用蛋白质在植物叶绿体中表达成功。烟草作为高等植物叶绿体转化模式植物，在疫苗抗原、抗体等药物蛋白和其他重要重组蛋白表达方面取得显著进展。高等植物叶绿体遗传转化也为叶绿体基因的表达和调控机制的研究提供新的技术和方法。文中从叶绿体遗传转化原理、载体构建、重组蛋白和重要药物蛋白在叶绿体中的表达以及重组蛋白表达对植物代谢和性状影响等多个角度，对高等植物叶绿体遗传转化体系研究的新进展进行了综述，以期为叶绿体表达平台的开发和重要药用蛋白质的表达提供新思路。

摘要:干细胞研究已成为当今生命科学领域中的前沿和热点问题，该研究为探讨胚胎发生、组织细胞分化以及基因表达调控等生物学问题提供了理想的模型，同时也为临床组织缺陷性疾病和遗传性疾病的细胞治疗和基因治疗开辟了新的手段。其中，经血源性子宫内膜干细胞 (Menstrual blood-derived stem cells，MenSCs) 来源丰富，具有多向分化潜能和较低的免疫排斥的特性，可以实现个体化治疗，是临床最具有应用优势的干细胞。脑与脊髓作为中枢神经系统，其损伤极为常见，致死率和致残率居各类创伤之首。与周围神经系统损伤相比，中枢神经受损后恢复较为困难，其治疗仍缺乏突破。而MenSCs的治疗有希望解决此难题，故结合近年来国内外对MenSCs的生物学特性及其对中枢神经系统疾病治疗的研究作一综述，从而为中枢神经系统疾病的治疗提供参考。

摘要:Spt是一大类参与酿酒酵母转录调控的蛋白质。Spt蛋白是SAGA复合体的组成部分，该复合体与基因上游TATA框区域相互作用而发挥调控作用。根据目前的研究，约有10%的酿酒酵母基因转录受到Spt蛋白的调控，且与环境压力下上调基因的调控密切相关。Spt蛋白参与的庞大的调控网络及其复杂的调节机制是当前一个研究热点。Spt蛋白还具有转座子抑制的功能，是转座子功能调控和适应性进化意义上的重要“开关”。除此之外，一些Spt蛋白可以直接调控不饱和脂肪酸的合成，从而直接影响细胞膜重塑，对于酵母广泛抗性具有重要意义。文中从以上3个维度对迄今为止Spt蛋白的研究进展进行综述，结合前期研究工作，对于Spt蛋白通过转录调控、细胞膜转变、转座活性调节用以增强酿酒酵母抗性的潜在作用谨作展望。

摘要:寡核苷酸是生物医学和生命科学研究中调节基因表达的基本工具，并被开发为基因靶向治疗药物，用于治疗病毒、肿瘤和遗传病。寡核苷酸药物主要包括反义寡核苷酸、小干扰RNA、核酶、脱氧核酶、反基因、CpG寡核苷酸、转录因子诱饵和核酸适配体等。天然的寡核苷酸在体内很容易被降解，特异性低，且有毒副作用。因此，药物寡核苷酸通常带有特定的修饰基团，如硫代磷酸二酯键、氟代、甲基以及锁核酸等，以增强寡核苷酸在体内的稳定性，提高特异性，并降低其毒副作用。目前，寡核苷酸主要采用化学方法合成，但化学合成的寡核苷酸初产物纯度低，而纯化十分困难。大规模核酸合成仪和纯化设备十分昂贵，因而大量合成和纯化寡核苷酸的成本高昂，大大限制了寡核苷酸药物的研究和应用。尽管已经涌现了多种多样的核酸扩增和检测方法，但用于扩增寡核苷酸的方法极少，且均不适合大量制备寡核苷酸。一种新的基于热循环的寡核苷酸扩增方法，称为“聚合酶-内切酶扩增反应” (Polymerase-endonuclease amplification reaction, PEAR)，能够使寡核苷酸等小分子核酸在双酶催化下，利用独特的“滑动-切割机制”进行自我复制，并实现指数扩增。PEAR反应简单、高效、稳定。该方法已成功制备硫代和氟代修饰的寡核苷酸，与化学合成法相比，该技术不依赖于大规模DNA合成仪，降低了生产成本，适合大量生产高纯度的寡核苷酸，将有助于推动寡核苷酸药物的研究和应用。

摘要:旨在应用体积排阻色谱法测定口蹄疫灭活疫苗中的146S抗原含量。使用TSKgel G4000SWXL (7.8 mm×30 cm) 色谱柱，以pH 7.2的缓冲盐体系作为流动相，流速为0.6 mL/min，进样量为100 μL，检测波长为259 nm。以口蹄疫病毒 (O型) 灭活146S抗原纯化样品建立标准曲线；使用灭活抗原液配制3份口蹄疫灭活疫苗，并进行精密度、重复性、特异性、耐受性验证；应用该方法快速测定16批疫苗的146S含量。结果表明，抗原浓度在0.56–67.42 μg/mL范围内，其峰面积与浓度的线性关系良好 (R2=0.996，n=10)，3份疫苗146S抗原测定回收率分别为93.6% (RSD=2.7%，n=3)、102.3% (RSD=2.6%，n=3)、95.5% (RSD=5.1%，n=3)，方法重复性好、准确性强 (RSD=0.5%，n=6)，且操作简便、高效，对16批疫苗的测定结果较理想。应用该方法有望快速高效地检测口蹄疫灭活疫苗的146S抗原含量，为疫苗的质量控制提供有力支持。

摘要:对单核细胞增多性李斯特菌 (简称单增李斯特菌) lmo1711基因编码的氨基肽酶进行克隆表达与纯化，并研究该重组蛋白的体外酶学特性。首先通过生物信息学分析预测Lmo1711与氨基肽酶家族成员的亲缘关系及关键活性位点的保守性。利用SWISS-MODEL模拟预测该蛋白的空间结构；构建Lmo1711原核表达载体并转化入E. coli Rosetta中，诱导表达重组目的蛋白，并利用镍离子亲和层析方法纯化目的蛋白；以氨基酸-对硝基苯胺偶联物为底物，Lmo1711通过水解底物N端氨基酸残基产生游离对硝基苯胺单体，405 nm处检测吸光值对该产物进行检测从而分析Lmo1711的酶学特性。在此基础上系统研究Lmo1711对不同氨基酸残基底物的催化特异性，及不同金属离子对该酶活性的影响。经原核表达纯化获得49.3 kDa的重组Lmo1711蛋白，与预测分子量一致；生物信息学分析推测Lmo1711属于M29氨基肽酶家族，且存在保守关键氨基酸活性位点 (Glu250、Glu316、His345、Tyr352、His378、Asp380)；酶活分析显示，Lmo1711具有较强的氨基肽酶活性，针对不同底物的结合和催化能力差异较大，对亮氨酸残基的亲和程度最高；Lmo1711氨基肽酶活性具有金属离子依赖性，Co2+、Cd2+、Zn2+等多种金属离子均能显著增强其活性，其中Co2+的激活效应最显著。本试验首次发现并证实，单增李斯特菌Lmo1711属于M29氨基肽酶家族成员，具有较强的催化活性，且对金属离子具有不同程度的依赖性。

摘要:为分析牛乳源金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) EsxA蛋白的免疫原性，构建EsxA-pET-28a重组表达质粒，重组质粒经诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。用纯化后重组EsxA蛋白免疫小鼠，用间接ELISA检测免疫小鼠血清中的IgG、IgG1和IgG2a水平；免疫小鼠经S. aureus菌株攻击后，检测小鼠肝、脾、肾组织荷菌数和免疫保护率，观察S. aureus菌株攻击后小鼠肝、脾、肾病理组织学变化。结果表明，成功诱导表达了EsxA重组蛋白，该重组蛋白免疫小鼠后血清抗体效价可达1∶900，与对照相比，重组蛋白免疫后可减少小鼠肝、脾、肾组织的荷菌数，减轻这些脏器的病理损伤，对免疫小鼠保护率达75%。上述结果表明，该重组EsxA蛋白具有良好的免疫原性。

摘要:β-胡萝卜素是类胡萝卜素家族中的典型代表，属于疏水性较强的化合物，前期研究表明，改变细胞膜形态以及增加3-磷酸甘油二酯的供给，均可容纳更多的β-胡萝卜素，从而提高其产量。然而在之前的研究中，没有对细胞膜的磷脂中主要组分磷脂酰乙醇胺的合成途径对β-胡萝卜素积累的影响进行系统的讨论。本研究将磷脂酰乙醇胺的合成途径分为上中下游3个模块，对它们的多种表达组合策略进行比较。首先过表达了上游模块1，菌株CAR016的β-胡萝卜素的产量与单位细胞的β-胡萝卜素产量均有显著提高，分别可达到44 mg/L以及13.7 mg/g DCW。与对照菌株相比，分别提高30.5%与35.6%。过表达磷脂酰乙醇胺合成的中游模块，β-胡萝卜素的产量以及单位细胞的β-胡萝卜素的产量分别为103.5 mg/L DCW与19.8 mg/g DCW。与对照菌株CAR016 (pACYC184-M) 相比，分别提高1.4倍与53.5%。将上游模块1与中游模块2共表达，菌株CAR016 (pModule1, pModule2) 单位细胞的β-胡萝卜素产量为22.3 mg/g DCW。与CAR016 (pModule2) 相比，单位细胞产量提高18%，与出发菌株CAR016 (pTrc99A-M，pACYC184-M) 相比，单位细胞的β-胡萝卜素产量提高122%。本研究找到了磷脂酰乙醇胺合成途径表达的最优组合策略，可以产生更大量的细胞膜，为储存β-胡萝卜素提供了更多的空间，从而进一步提高β-胡萝卜素的产量。细胞膜形态和合成途径的模块化改造，是今后提高类胡萝卜素产量的新方向。

摘要:巴斯德毕赤酵母是用途广泛的蛋白表达系统。目前用于毕赤酵母的质粒主要以整合型质粒为主，很少见到游离的质粒用于外源基因的表达。文中通过将来源于酵母自身的自主复制序列连接到酵母整合型表达载体pGAP中构成自主复制的游离型表达载体pGAPZαA-PARS，将该载体用于表达木聚糖酶基因。转化毕赤酵母后同传统的整合型表达菌株相比，以甘油为碳源时最高酶活达到343 U/mL，比整合型表达提高了45.9%。同时游离载体表达重组酶比活相对整合表达提高了81.2%。为了节约发酵成本，进一步研究了分别以甘油、葡萄糖、蔗糖、混合碳源 (蔗糖︰甘油=1︰2) 等不同碳源下游离型重组菌株的表达水平。发现甘油表达水平最高，蔗糖最低，但是以工业葡萄糖为碳源时产酶成本最低。由于pGAP载体不需要以甲醇为碳源，因而文中所构建的游离载体pGAPZαA-PARS极大促进了毕赤酵母在食品行业中的应用。同时，游离型载体可大幅度提高表达水平，为进一步研究提高GAP启动子的高效表达奠定了基础。

摘要:紫苏醇，即[4-异丙烯基-1-环己烯]甲醇，是一种具有类似芳樟醇和松油醇特殊气味的单环单萜烯醇。在医药、食品和化妆品等行业具有广阔市场空间和研究价值。文中研究了以工程大肠杆菌通过甲羟戊酸途径合成紫苏醇的方法。首先在大肠杆菌中构建来源于粪肠球菌的MVA代谢途径合成柠檬烯，随后柠檬烯通过细胞色素P450烷烃羟化酶的羟基化转化为紫苏醇。然后将构建的紫苏醇合成菌株在摇瓶发酵条件下进行优化，研究发现工程大肠杆菌以葡萄糖为原料，通过MVA代谢途径可合成约50.12 mg/L的紫苏醇。本研究构建合成紫苏醇的MVA代谢途径也可用于其他萜类化合物的合成，为今后生物法合成萜类化合物提供了理论依据和技术支持。

摘要:CAR-T细胞疗法通过靶向识别肿瘤细胞表面抗原，特异性杀伤肿瘤细胞，近年来已经成为肿瘤免疫疗法的研究热点。通过基因工程方法构建靶向人类表皮生长因子受体2 (HER2) 的CAR慢病毒表达质粒，以磷酸钙沉淀辅助多质粒共转染HEK293T细胞包装，制备CAR慢病毒颗粒lenti-car，感染人外周血单核细胞获得HER2靶向的CAR-T细胞，并分析其对HER2阳性和阴性肿瘤细胞的特异性抑制效果。研究结果表明，构建的CAR-T细胞可被HER-2阳性的肿瘤细胞特异性激活，分泌大量炎症性细胞因子IFN-γ和IL-2。在同样效靶比等处理条件下，构建的HER2靶向CAR-T细胞对HER2阳性的人卵巢癌细胞株SK-OV-3的生长抑制率为 (58.47±1.72)%，显著高于对照组 (P<0.05)；而对HER2阴性的人慢性髓原白血病细胞株K562的生长抑制率为 (11.74±2.37)%，与对照组无显著差异 (P>0.05)。进一步，在K562细胞中转染人HER2表达载体使其成为HER2阳性，则HER2靶向CAR-T细胞对其的生长抑制率上升为 (30.41±7.59)%，较HER2阴性K562具有明显差异 (P<0.05)。研究结果表明，构建的HER2靶向的第二代CAR-T细胞可选择性地抑制高表达HER2蛋白的肿瘤细胞的生长，暗示了其对HER2阳性肿瘤进行细胞免疫治疗的临床应用前景。

摘要:旨在自制能够辅助诊断原发性膜性肾病的抗磷脂酶A2受体 (PLA2R) 抗体酶联免疫吸附试验 (ELISA)定量检测试剂盒；通过包埋HEK293细胞表达的重组抗原、患者血清与抗原反应、酶的催化放大效应测定样本中抗PLA2R IgG滴度，通过临床数据分析、与市售试剂盒的比对，评价该试剂盒的临床应用价值及性能。研究发现自制试剂盒与国外试剂盒检测阳性一致率97.2%，阴性一致率100%；检测限不高于2 RU/mL；准确度的测量相对偏差在±15%区间内；试剂盒线性范围在2–500 RU/mL，线性相关系数r值不低于0.990 0；重复性检测的变异系数 (CV) 小于15%；于37 ℃恒温箱放置1周后，2–8 ℃放置1年后，检测性能无明显改变。结果表明自制试剂盒对血清抗PLA2R抗体检测的敏感性、特异性均与德国欧蒙公司 (E150522BD) 试剂盒相近，诊断效能高，可用于原发性膜性肾病辅助诊断。

摘要:构建叉头框G1 (Forkhead box G1, FOXG1) 的慢病毒干扰 (shRNA) 质粒及表达质粒，通过敲低和过表达FOXG1探讨其对结直肠癌细胞上皮-间质转化EMT的作用及其机制。应用Western blotting检测FOXG1在RKO、SW480、SW620、LOVO、DLD-1五种结直肠癌细胞中蛋白的表达水平，设计并合成FOXG1的shRNA片段 (shFOXG1)，运用DNA重组技术获得重组质粒，经双酶切技术及测序方法鉴定后进行慢病毒的包装、纯化及稳定转染，经筛选后获得稳定的结直肠癌细胞株，通过Western blotting和qRT-PCR技术检测FOXG1敲低和过表达效率及EMT关键因子E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、Snail、Twist mRNA和蛋白的变化，光学显微镜观察敲低后细胞形态学变化，通过划痕实验检测迁移能力变化，Transwell检测侵袭迁移能力的变化。5种结直肠癌细胞中，FOXG1在RKO细胞中蛋白表达量最高，而在DLD-1细胞中表达量最低，与对照组相比较，在RKO细胞中敲低FOXG1，细胞形态由长梭型变成了类圆形或者多边形，细胞极性和紧密连接增加，细胞迁移距离明显降低，侵袭转移穿过小室的细胞数也明显减少，EMT关键因子E-cadherin表达增高，Vimentin、Fibronectin、Snail、Twist表达降低，过表达FOXG1组则相反。FOXG1在结直肠癌中高表达，这种基因的高表达能够促进结直肠癌细胞的侵袭和转移，对结直肠癌细胞的EMT起着重要的调控作用。

摘要:骨髓间充质干细胞 (Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 已被广泛应用于治疗脊髓损伤，但目前对其治疗机制了解甚少。BMSCs被移植至脊髓钳夹损伤模型大鼠，以研究其保护作用。通过LFB (Luxol fast blue) 染色、锇酸染色、TUNEL (TdT-mediated dUTP nick-end labeling) 染色和透射电镜对白质有髓神经纤维进行观察。免疫印迹检测BMSCs移植对脑源性神经营养因子 (Brain derived neurotrophic factor，BDNF) 和caspase 3蛋白表达的影响。通过脊髓损伤后1、7、14 d三个时间点移植BMSCs并进行后肢运动评分 (Basso，beattie and bresnahan；BBB评分) 和CNPase (2′,3′-cyclic-nucleotide 3′-phosphodiesterase)、髓鞘碱性蛋白 (Myelin basic protein，MBP)、caspase 3蛋白水平的检测。免疫荧光观察BMSCs移植到受损脊髓后分化情况及CNPase-caspase 3+共表达情况。骨髓间充质干细胞移植7 d后，部分移植的BMSCs可表达神经元和少突胶质细胞标记物，大鼠后肢运动能力和髓鞘超微结构特征均明显改善。骨髓间充质干细胞移植后BDNF蛋白表达水平增加，caspase 3蛋白表达水平则降低。相对于脊髓损伤后1 d和14 d，7 d移植BMSCs后MBP和CNPase蛋白表达水平最高；caspase 3蛋白表达水平则最低。骨髓间充质干细胞移植后CNPase-caspase 3+细胞散在分布于脊髓白质。结果表明，急性脊髓损伤后，BMSCs移植到受损脊髓有分化为神经元和少突胶质细胞的倾向，并促进BDNF的分泌介导抗少突胶质细胞凋亡而对神经脱髓鞘病变有保护作用，且最佳移植时间为脊髓损伤后7 d。

摘要:建立了高效液相色谱 (HPLC) 测定蛇足石杉 (Huperzia serrate) 内生真菌胶胞炭疽发酵液中石杉碱甲 (Huperzina A) 和石杉碱乙 (Huperzine B) 含量的方法，并以此方法检测胶胞炭疽发酵液中石杉碱甲和石杉碱乙含量的积累。内生真菌发酵液经氯仿萃取、甲醇溶解、过滤后进行高效液相检测分析，选用Agilent Eclipse plus-C18 色谱柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)，以0.015 mol/L乙酸铵 (pH 6.8) 和甲醇溶液 (70∶30) 为流动相进行等度洗脱，流速1 mL/min，检测波长为308 nm，连续检测内生真菌胶胞炭疽发酵液中第6–15天石杉碱甲和石杉碱乙的含量积累。结果表明，发酵提取液中的石杉碱甲和石杉碱乙可在25 min内进行很好的分离和分析，石杉碱甲在1.50?48.00 μg/mL范围内线性关系良好 (相关系数r为0.999 5)，石杉碱乙在0.25?7.50 μg/mL范围内线性关系良好 (相关系数r为0.999 7)，石杉碱甲和石杉碱乙的平均加标回收率分别为106.83%、108.06%，相对标准偏差 (RSD) 分别为3.34%、3.60%。该方法简便、快速、精密度高、结果准确，适用于内生真菌发酵液中石杉碱甲和石杉碱乙含量检测。在发酵过程中，内生真菌发酵液中石杉碱甲和石杉碱乙的含量呈现先增后减，随后有所增加继而又减少的趋势。石杉碱甲和石杉碱乙的含量分别在内生真菌发酵第14天、第8天达到最高，分别为12.417 0 μg/mL、4.660 3 μg/mL。该方法学的建立为内生真菌胶胞炭疽合成石杉碱甲与石杉碱乙的机制研究提供了检测手段，从而有利于药物新资源的开发。

摘要:构建随机ssDNA文库，通过SELEX技术，以正常、炎性宫颈脱落细胞为反筛细胞，以上皮内低级别病变 (CIN1)、上皮内高级别病变 (CIN2、CIN3) 和鳞状细胞癌脱落细胞为正筛细胞，经过12轮筛选特异性适配子高度富集得到宫颈癌前病变适配子库，经特异性、亲和力分析和细胞免疫荧光确立高特异性适配子CIN-Ap4可作为诊断宫颈癌前病变生物标志物，为宫颈癌前病变分子诊断奠定理论基础，提供新思路。利用Prime Premier 5.0设计构建了随机ssDNA文库并根据文库两端固定序列设计引物，对对称PCR和间接不对称PCR中的退火温度、循环数以及上、下游引物浓度比等条件进行优化，分析确定50 μL反应体系中对称PCR的最佳反应条件为：最佳退火温度为49.5 ℃，最佳循环数为15个循环；间接不对称PCR的最佳反应条件为：50 μL反应体系中上、下游引物浓度的最佳比例为 80∶1，最佳循环数为35个循环。实验结果表明成功构建了寡核苷酸文库，在最适PCR条件下可获得理想的dsDNA和ssDNA，并具有良好的重复性，为顺利筛选适配子提供保证。

摘要:吡咯喹啉醌 (PQQ) 是一种细菌脱氢酶的辅酶，具有促进机体生长、调节机体自由基水平等功能，应用于食品、医药等领域。由于化学合成法成本较高，微生物发酵法生产PQQ受到关注。目前，发酵法生产PQQ产量较低，限制了其工业应用。然而，由于对PQQ菌株的合成与调控机制尚缺乏深入理解，以及对野生型菌株缺乏必要的基因工程改造手段，目前采用代谢工程强化PQQ合成菌株还缺乏相关基础。因此，本研究以扭脱甲基杆菌Methylobacterium extorquens I-F2为研究对象，整合常压室温等离子体诱变、流式细胞术分选和高通量筛选策略，对样品制备和流式分选过程进行优化，最终筛选出一株PQQ高产突变菌株1-C6，PQQ产量比出发菌株I-F2提高98.02%。本文所述的流式细胞术结合高通量筛选方法能简单、快速地获得高产突变菌株，相比于基因工程改造和传统筛选方法，具有提升效果明显且易于实施等优势。

摘要:3-羟基丁酮 (Acetoin) 作为一种重要的食用香料和平台化合物被广泛应用于医药、食品等领域。为改善解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的3-羟基丁酮生产能力，采用常压室温等离子体 (ARTP) 和60Co γ射线进行复合诱变，以3-羟基丁酮产量为分析指标，筛选获得最优突变株B. amyloliquefaciens H-5，3-羟基丁酮产量为68.2 g/L。为进一步实现3-羟基丁酮的高效生产，对此突变株进行5 L发酵罐水平的培养条件优化，并于30 L发酵罐上进行放大培养，最终3-羟基丁酮产量达85.2 g/L，较出发菌株B. amyloliquefaciens FMME088提高了26.8%。上述研究结果表明，ARTP和60Co γ射线复合诱变能够有效获得高产菌株，该突变株具有较高的工业化微生物发酵生产3-羟基丁酮的潜能。

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