摘要:酶工程是酶学与工程科学融合的综合性科学技术，是现代生物技术的支柱之一。为促进国内酶工程研究的发展，本期“酶工程专刊”集中展现了我国酶工程专家学者在酶工程领域所取得的最新进展。

摘要:工业酶制剂研发与应用已经渗透到各大工业领域，但中国作为用酶大国、产酶小国面临重大挑战，鉴于以化学催化为核心的基础物质加工业面临资源、能源和环境三大危机，酶工程与生物催化已被列入许多国家的科技与产业发展战略，应用高效、清洁的生物催化技术是实现化学工业可持续发展以及发酵工业产业升级的重要途径之一。文中以2017年第十一届中国酶工程学术研讨会杜邦-杰能科中国酶工程杰出贡献奖获得者特邀报告为基础整理编写而成，从自主酶库构建、酶分子机器/细胞工厂创制及产业化应用等角度概述当前酶工程与生物催化发展现状及前景。

摘要:酶分子的高效性和稳定性是工业广泛应用的物质基础。利用分子生物学技术可以将不同酶分子通过串联、插入、翻译后融合等方式构建成符合工业需求的杂合酶，但应用中多结构域杂合酶在表达量与酶活等方面仍存在弊端，而基于特定蛋白质结构域的多功能设计成为新趋势。高通量测序技术的发展，使得生物学家正面临着爆炸式增长的大数据集。近年来“蛋白质功能区”概念的提出，拓宽了人们对蛋白质结构与功能组织层次的认知，功能区残基聚簇的协同演化可导致同一家族不同蛋白质功能的差异。基于海量大数据分析可以快速定位特定功能区以及协同进化的关键位点，再利用合成生物学技术就可实现多种功能残基在同一蛋白质中的精准嫁接，完成天然酶分子的再设计。这将是杂合酶技术发展的新阶段，也会成为生物大数据时代下蛋白质设计的新趋势。

摘要:羟基化氨基酸在生物技术和分子生物学中具有独特价值，具有抗真菌、抗菌、抗病毒和抗癌的特性。通过比较化学合成与生物催化合成羟基氨基酸的异同，选择具有高对映结构选择性的生物催化合成方法成为羟基氨基酸合成的首选。生物催化实现疏水性氨基酸的羟基化和羟化酶紧密相关，而羟化酶又是单核非血红素Fe(Ⅱ) 和α-酮戊二酸依赖型双加氧酶 (Fe/αKGDs) 的一种，Fe/αKGDs存在共性催化机制。因此，疏水性氨基酸在被催化的过程中，会利用关键中间体高价铁-超氧复合体 (Fe(Ⅳ)=O) 引起多种氧化转化，从而完成羟基化过程。文中就疏水性氨基酸的羟基化合成及功能应用，尤其是 (2S,3R,4S)-4-羟基-异亮氨酸 (4-HIL) 和羟脯氨酸，进行了详细的阐述，探讨了Fe/αKGDs的共性催化反应机制，并对羟基氨基酸在基础研究和工业中的应用进行了综述。

摘要:w-转氨酶能催化羰基化合物发生不对称还原胺化反应，在制备手性胺类化合物方面具有较好的应用前景。由于底物结合区域特殊的空间结构，野生型w-转氨酶在合成大位阻手性胺方面的应用受到了限制。此外，在立体选择性和稳定性方面这一类酶也存在一些不足，目前满足工业应用需求的w-转氨酶仍较为有限。文中首先介绍了w-转氨酶的结构特征和催化机制，并探讨S型和R型酶在结构特征方面的主要差异。然后对w-转氨酶的分子改造研究进行了综述，重点阐述了基于结构特征和催化机制进行的分子改造研究，包括底物特异性改造、立体选择性改造和稳定性改造三方面。最后，对w-转氨酶分子改造研究进展进行总结和展望。

摘要:粗甘油是生物柴油生产中的主要副产物，一些微生物可将甘油转化为重要化工原料1,3-丙二醇 (1,3-PD)，而利用这些微生物野生菌株生物合成1,3-PD会存在一些局限性，如底物抑制、产物抑制等。文中从1,3-丙二醇的甘油生物转化途径与这些局限性出发，总结了生物合成中存在的问题，并针对这些问题提出了一些基于基因敲除或基因过表达等基因工程技术的改造方法，综述了利用基因工程菌生物转化甘油生成1,3-丙二醇的最新研究进展。

摘要:纤维素水解成为葡萄糖需要一系列纤维素酶的作用，其中β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidases) 起着至关重要的作用。来自于培菌白蚁中肠的β-葡萄糖苷酶 (MbmgBG1) 具有较高的葡萄糖耐受性 (1.5 mol/L的葡萄糖，保持60%以上的酶活力)，但是，酶活力低和热稳定性差限制了β-葡萄糖苷酶 (MbmgBG1) 在食品以及工业领域中的应用。因此通过对保守氨基酸附近的非保守氨基酸定点突变，获得点突变体 (F167L、T176C、E347I、R354K、N393G和V425M)，其中突变体F167L、R354K的比活力 (底物pNPG) 比MbmgBG1分别高出约2倍和4倍。突变体的Kcat/Km值比野生型大，反映了突变体对底物的亲和力以及催化能力比MbmgBG1强。当酶活力保留60%以上时，MbmgBG1所耐受的葡萄糖浓度为1.5 mol/L，而F167L为2.0 mol/L，R354K为3.0 mol/L。这些特性的增强表明，对活性中心附近保守区域内的非保守氨基酸突变，可以较大程度地影响活性，因此需要更深入地研究β-葡萄糖苷酶的活性中心位点，进行改造以提高催化效率。

摘要:本研究旨在利用理性设计的方法来提高来源于土曲霉Aspergillus terreus的酸性脂肪酶ATL的催化活力。通过同源比对，选择脂肪酶盖子区域和底物结合口袋域中的位点进行定点突变，得到8种ATL的突变脂肪酶。结果发现，盖子区域突变酶ATLLid与底物结合口袋域突变酶ATLV218W的催化活性显著提高。ATLLid和ATLV218W对底物对硝基苯酚月桂酸酯p-nitrophenyl laurate (p-NPL) 的催化活性最高，kcat值较ATL分别提高了39.37倍和50.79倍，kcat/Km值较ATL分别提高了2.85倍和8.48倍。与ATL相比，ATLLid和ATLV218W的热稳定性略有下降，最适pH为5.0，pH 4.0–8.0具有较好的稳定性，说明突变未对ATL的嗜酸耐酸特性产生影响。通过同源建模模拟及分子对接技术分析底物p-NPL与酶分子间的相互作用，解析了ATLLid和ATLV218W催化活性提高的机理。

摘要:葡萄糖氧化酶 (Glucose oxidase，简称GOD) 可氧化葡萄糖生产葡萄糖酸及其衍生物，在新型无抗饲料添加剂的开发中具有良好的应用潜力，但其生产加工过程中尚存在热稳定差的瓶颈问题。本研究采用融合双亲短肽技术提高葡萄糖氧化酶的热稳定性，分别选取8种不同氨基酸长度、不同Linker连接的双亲短肽 (Self-assembling peptides，SAPs) 融合至黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶的N端，构建了8种融合型酶SAP1-GS-GOD、SAP1-PT-GOD、SAP2-PT-GOD、SAP3-PT-GOD、SAP4-PT-GOD、SAP5-PT-GOD、SAP6-PT-GOD、SAP7-PT-GOD，并在毕赤酵母GS115中异源表达。获得的连接PT Linker的融合酶在60 ℃下孵育60 min后的相对酶活均高于初始酶。其中，融合酶SAP5-PT-GOD在60 ℃下孵育30 min的相对酶活为67%，是相同处理条件下初始酶相对酶活的10.9倍。同时，融合酶SAP1-PT-GOD、SAP2-PT-GOD、SAP3-PT-GOD、SAP5-PT-GOD的Kcat/Km值较初始酶均有进一步的提高。研究表明，在葡萄糖氧化酶的N端融合以PT为Linker的目标双亲短肽能有效提高葡萄糖氧化酶的热稳定性，通过对融合酶分子内作用力进行分析，酶分子内氢键的增加对融合酶热稳定性的提高效果最为显著。上述研究获得的热稳定性提高的融合葡萄糖氧化酶及其效果机制分析对提高酶在加工和应用过程中的活性具有重要的研究意义和应用价值。

摘要:真菌α-淀粉酶被广泛应用于麦芽糖浆生产工业，但其热稳定性普遍较差，在制糖工艺中增加了由于酶活力损失而引起的追加生产成本。在充分研究了热稳定性对于真菌α-淀粉酶应用于工业生产的重要性的基础上，为提高米根霉α-淀粉酶 (ROAmy) 的热稳定性，基于酶蛋白B-factor分析和分子动力学模拟，利用重叠PCR技术分别对ROAmy中的3个氨基酸残基G128、K269和G393进行了单点突变及组合突变。结果表明，所获得的7个突变体均比原酶具有更好的热稳定性，其中效果最好的为组合突变体G128L/K269L/G393P，其在55 ℃下的热失活半衰期 (t1/2) 约为原酶的5.63倍。同时，该突变体的最适温度由50 ℃提高到了65 ℃，最大反应速率 (Vmax) 和催化效率 (kcat/Km) 分别提高了65.38%和99.86%。通过蛋白结构功能比较分析，发现氢键数目的增多或脯氨酸在特殊位置中的引入可能是突变体热稳定性得到提高的主要因素。

摘要:木酮糖是生物体内的代谢中间产物，是多种稀有糖合成的前体物质，因其独特的生物活性在膳食、保健、医药等领域发挥着重要作用。本研究旨在从最基本有机原料之一的甲醛出发，利用生物酶法催化甲醛合成木酮糖。通过来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida的苯甲酸脱羧酶 (Benzoylformate decarboxylase) 突变体BFD-M3催化甲醛聚合生成羟基乙醛和1,3-二羟基丙酮 (DHA)。通过来源于大肠杆菌的转醛醇酶 (Transaldolase)突变体TalB-F178Y进一步催化羟基乙醛和DHA聚合生成木酮糖，最终实现甲醛到木酮糖的酶法转化，转化率为0.4%。此外，经过优化甲醛底物浓度，木酮糖转化率达到4.6%，比优化前提高了11.5倍。为了进一步提高木酮糖的转化率，采用Scaffold多酶组装技术固定BFD-M3、TalB-F178Y蛋白，使木酮糖转化率达到14.02%，较未用Scaffold技术前提高3倍，为生物法合成稀有糖提供了一种新方案。

摘要:作为新型Ⅲ型聚酮合酶，米曲霉来源的CsyB能够依次接受一个起始单元为短链脂肪酰辅酶A、一个延伸单元为丙二酰辅酶A和另一个延伸单元为乙酰乙酰辅酶A的3个底物形成短链的csypyrone B1-3。基于CsyB的晶体结构分析，显示它的活性中心存在一个长约16 ?的能够接受脂肪酰辅酶A结合通道，这个通道很可能能够接受多种底物。为了检测该酶的底物多样性，将CsyB基因导入到存在长链脂肪酰辅酶A前体的大肠杆菌中表达。高效液相结果显示，相比对照菌株，重组菌株产生了一系列长链的csypyrone衍生物。利用紫外可见光特征吸收值和高分辨液相色谱-质谱联用仪对这些新产物作了初步分析。对3个具有羟基的csypyrone产物的结构进行了核磁共振一维谱和二维谱的详细鉴定，确定了其羟基的位置。上述结果显示，CsyB具有广泛的底物特异性，不但可以接受多种长链饱和或不饱和脂肪酰辅酶A，还可以接受具有羟基修饰的长链脂肪酰辅酶A作为底物。

摘要:尿酸氧化酶 (Urate oxidase，Uox) 是一种催化尿酸氧化为尿囊素的酶，常用于尿酸的检测以及痛风和高尿酸血症治疗。文中从土壤中筛选出一株Uox高产菌株OUC-1，经16S rRNA部分基因序列分析，与苛求芽孢杆菌Bacillus fastidiosus序列相似度达99%。B. fastidiosus OUC-1的Uox经纯化后，分析表明该酶反应最适pH和温度分别为10.0和40 ℃；Uox以尿酸为底物反应动力学参数Km值为 (0.15±0.04) mmol/L (n=5)。Mg2+能够提高该酶性活性，而Zn2+和SDS能强烈抑制该酶的酶活。参考GenBank中苛求芽孢杆菌基因组中的uox基因序列，成功扩增出uox基因，通过SWISS-MODEL对Uox空间结构进行预测，推测该酶是同源四聚体，单亚基分子量为35.38 kDa。文中将uox基因克隆并在大肠杆菌中表达，为后续的Uox的性能改造提供条件和技术支持。

摘要:云芝Trametes versicolor具有很强的环境有机污染物降解能力，其烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶 (NADPH-cytochrome P450 reductase，CPR) 为细胞色素P450酶 (Cytochrome P450s，CYPs) 提供电子，参与有机污染物的降解过程。序列分析显示，云芝基因组拥有1个潜在CPR序列和多个潜在CYP序列。为深入研究云芝CPR参与细胞降解有机污染物的分子机制，实验进行了云芝CPR在大肠杆菌中异源表达和酶学特性分析。结果表明，经IPTG诱导后，去除预测的N端膜锚定区域 (氨基酸残基1–24) 的CPR蛋白 (CPRΔ24) 可在重组菌中实现可溶性表达，且表达蛋白的分子量与理论值 (78 kDa) 一致。镍离子亲和层析和分子筛层析纯化后测得其比活性为5.82 U/mg。酶学性质分析显示，重组CPRΔ24的最适温度和pH分别为35 ℃和8.0，并对一些金属离子及有机溶剂具有不同程度的耐受性。酶在35 ℃、pH 8.0反应条件下对NADPH的动力学参数Km和kcat分别为19.7 μmol/L、3.31/s；对底物细胞色素c的动力学参数Km和kcat分别为25.9 μmol/L、10.2/s。以上研究为探究云芝CPR在环境有机污染物降解途径中的功能机制奠定基础。

摘要:α-氨基酸酯酰基转移酶 (α-amino acid ester acyltransferase，AET) 能够催化底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 (L-alanyl-L-glutamine，丙谷二肽)。利用重组大肠杆菌saet-QC01表达α-氨基酸酯酰基转移酶，对其表达条件进行了优化，通过Ni-NTA亲和层析法分离纯化重组蛋白，并对其酶学性质、催化应用进行了研究。适合酶表达的诱导条件：温度20 ℃，诱导阶段 (OD600=2.0?2.5)，IPTG浓度0.6 mmol/L，诱导时间12 h。α-氨基酸酯酰基转移酶的最适反应温度27 ℃，最适pH 8.5，在pH 7.0?8.0很稳定，在酸性条件下相对稳定，低浓度的Co2+、低浓度的EDTA对酶活有促进作用。在底物浓度丙氨酸甲酯盐酸盐600 mmol/L、谷氨酰胺480 mmol/L，丙谷二肽的产量达到78.2 g/L，生产速率达到1.955 g/(L·min)，转化率达到75.0%。α-氨基酸酯酰基转移酶具有良好的酸碱耐受性，催化效率高的优良特性，在工业生产中具有较好的应用潜力。

摘要:随着大型褐藻生产燃料乙醇以及褐藻寡糖重大药用价值的发现，褐藻胶裂解酶成为国内外多个领域的研究重点。文中对解藻酸弧菌上与褐藻胶降解相关的5个基因分别进行克隆表达，通过SDS-PAGE和酶活性定量测定，发现该基因簇中的4个基因有降解褐藻胶活性。对酶活最高的rAlgV3进行了诱导条件的优化、酶蛋白纯化及酶性质研究，发现优化诱导条件后重组酶rAlgV3的酶活由2.34×104 U/L上升为1.68×105 U/L，比优化前提高了7.3倍；对酶性质进行表征发现该酶在4–70 ℃均有活性，最适反应温度为40 ℃，在4–20 ℃酶相对稳定；该酶在pH 6.5?9.0环境下均有较高的酶活，最适pH为8.0；pH稳定性好，在pH 4.5–9.5环境下可以稳定存在；适量的NaCl浓度和Fe2+、Fe3+等离子具有促进酶活的作用，SDS和Cu2+离子可明显抑制酶活力。对该酶的底物特性的研究发现，该酶不仅可以降解褐藻胶中的Poly-M片段，也能降解Poly-G片段，具有广泛底物特性；其降解海藻酸钠主要释放二糖和三糖，是一种内切酶。该酶对于第三代燃料乙醇的发展及褐藻寡糖的生产具有重要作用。

摘要:黑曲霉表面展示南极假丝酵母脂肪酶B (CALB) 可有效应用于食品、化妆品、医药等行业。以黑曲霉Aspergillus niger SH-1为宿主细胞构建诱导型糖化酶基因启动子表面展示CALB，在较高浓度葡萄糖碳源的发酵中CALB表达会受到抑制，发酵后期菌体容易出现菌丝断裂和展示酶活力下降等问题。采用组成型3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子替代诱导型糖化酶基因启动子的细胞表面展示CALB黑曲霉菌株可有效解决上述问题，该菌株不但可以利用葡萄糖，而且还能利用木糖为发酵碳源，以木糖为碳源发酵在144 h展示酶水平达到1 100.28 U/g。文中探讨了甘蔗渣水解液发酵生产黑曲霉表面展示CALB，初步达到预期的结果，为甘蔗渣的综合利用提供了新途径。

摘要:

摘要: