摘要:成簇规律间隔短回文重复序列 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR) 系统在近年来得到越来越广泛的应用。相比传统的基因组编辑技术，CRISPR/Cas系统具有编辑效率高、特异性强、花费低、对实验技术要求低等优势。其中Ⅱ型和Ⅴ型CRISPR/Cas系统分别仅需要单个Cas9蛋白和单个Cpf1蛋白作为切割双链DNA的工具，因此特别受到研究者们的青睐。目前CRISPR/Cas9技术已成功应用于斑马鱼、小鼠、人类细胞等真核生物的基因组编辑中，并取得一系列重要成果，但在细菌领域进行的相关研究并不多。文中将简单描述CRISPR/Cas系统及其作用机制，重点介绍该系统的优化以及近年来其在细菌学领域所取得的 进展。

摘要:拜耳-维立格单加氧酶是一类可以催化酮生成酯以及硫等杂原子氧化的黄素依赖的单加氧酶，在合成化学和生物催化等工业领域有重要的应用前景。本文总结了微生物次生代谢产物生物合成途径中涉及的拜耳-维立格反应，讨论了其反应的特点和催化这些反应的拜耳-维立格单加氧酶的氨基酸序列特征，为拜耳-维立格单加氧酶的蛋白质工程改造提供参考。

摘要:代谢工程作为通过引入外源合成途径或改造优化代谢网络，进行高附加值的天然代谢产物生物合成的技术，已经得到广泛应用。但随着目标合成产物的结构日渐复杂，构建多基因的从头合成途径造成宿主生物代谢失衡与中间产物对宿主细胞产生毒害作用等一系列问题发生的可能性也随之增加。为解决这些问题合成支架策略应运而生，合成支架将途径酶共定位以提高局部酶和代谢物的浓度，来增强代谢通量并限制中间产物与宿主细胞环境间的相互作用，成为生物催化和合成生物学研究的热点之一。尽管由核酸、蛋白质构成的合成支架策略已经应用于多种代谢物的异源合成，并取得了不同程度的成功，但合成支架的精确组装仍然是一项艰巨的任务。文中详细介绍了合成支架技术的研究现状，详细阐述了合成支架技术的原理和实例，并初步探讨了其应用前景。

摘要:重组细菌载体疫苗因其能够诱导机体产生粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫的特点，已经被广泛用作递送保护性抗原和核酸疫苗的载体来预防某些传染病。但是重组到细菌载体疫苗中的保护性抗原和核酸难以穿越细菌细胞壁释放到宿主细胞内发挥作用，残留在动物或畜禽产品中的疫苗菌株还可能造成环境的污染和疫苗菌株的传播。而有效解决这些问题的方法是构建一种细菌自动裂解系统，使疫苗菌株能够在体外培养时正常生长而在体内环境中自动裂解死亡。目前主要应用的细菌裂解系统包括：基于调控延迟肽聚糖合成的裂解系统、基于噬菌体裂解蛋白调控的裂解系统、基于毒素-抗毒素系统 (Toxin-antitoxin system) 的裂解系统。此外，一种潜在的基于细菌Ⅵ 型分泌系统 (Type Ⅵ secretion system，T6SS) 的裂解系统也有望成为构建自动裂解菌株的新方法。文中将着重对这几种裂解系统的调控机制进行阐述。

摘要:大多数生物体中都含有谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase, GDH) (E.C. 1.4.1.2–1.4.1.4)。在真核生物中，该酶主要存在于线粒体中，并在氮和碳的代谢以及信号通路中起着至关重要的作用。研究发现谷氨酸脱氢酶与肿瘤发生及发展有一定的关系，对于肿瘤研究具有一定意义，但是关于其与人类肿瘤的关系方面的综述很少见。文中对谷氨酸脱氢酶与乳腺癌、胶质瘤、结直肠癌以及卵巢癌等的关系进行了归纳和总结，希望可以为相关研究提供帮助。

摘要:近年来，随着微流体技术和生物微电子机械系统技术的不断发展，人类中枢神经系统 (CNS) 的微流体平台及相关疾病的体外模型逐渐得到了广泛的研究。微流体平台可以更好地模拟体内环境，同时能够控制结构、微环境和外来刺激。文中总结了微流控芯片在CNS的基本技术和CNS疾病中的应用。此外，文中对微流控芯片在CNS中的研究进行了展望，强调了通过跨学科的共同努力能够实现更高程度的仿生学挑战。

摘要:萜类化合物的直接前体物质异戊烯焦磷酸 (IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸酯 (DMAPP) 可以由2-甲基- D-赤藻糖醇-4-磷酸途径 (MEP途径) 和甲羟戊酸途径 (MVA途径) 合成。在已经优化MEP合成途径、番茄红素合成途径关键基因表达的重组大肠杆菌LYC101中，引入MVA途径基因，进一步提高重组大肠杆菌合成萜类化合物的能力。质粒pALV23和pALV145是本实验室在研究MVA途径基因协调表达时，用核糖体结合位点 (RBS) 文库连接MVA途径各基因构建质粒文库，而筛选到的有效提高β-胡萝卜素产量的质粒。首先比较了两个质粒分别在低产和高产番茄红素的菌株中对番茄红素合成的影响。结果表明，两个质粒在高、低产番茄红素的菌株中都可以有效提高番茄红素产量。在高产菌LYC101中pALV23比pALV145使番茄红素产量更高。然后，用CRISPR-Cas9系统辅助同源重组的方法，将MVA途经基因和启动子一共6.7 kb的条带整合到LYC101菌株的染色体上，得到遗传稳定的菌株LYC102。LYC102的番茄红素产率达40.9 mg/g，是出发菌株LYC101产率的2.19倍，比用质粒表达MVA途径基因的菌株提高了20%。在重组大肠杆菌中同时表达MVA途径和MEP途径，可以有效提高萜类化合物产率；文中构建了不含质粒的、遗传稳定的高产番茄红素菌株，为产业化合成番茄红素提供基础；同时构建平台菌株，可以用于其他萜类化合物合成。

摘要:酸性蛋白酶作为一类重要的天冬氨酸蛋白酶，被广泛应用于食品、医药和皮革等领域。为推动酸性蛋白酶的研究及应用，通过对发酵豆制品样品进行宏基因组测序，从中获得米曲霉酸性蛋白酶基因pepA，在毕赤酵母GS115中进行异源表达，并对重组酶PepA进行酶学性质分析。结果显示毕赤酵母发酵上清液中酸性蛋白酶的活性为50.62 U/mL。SDS-PAGE验证PepA的分子量约为50 kDa，且发酵上清液几乎无杂蛋白。PepA的最适pH值为4.5，最适温度为50 ℃，Mn2+和Cu2+对其具有激活作用，而Fe3+、Fe2+与Ca2+则具有抑制作用。上述研究结果可为米曲霉酸性蛋白酶的异源表达及其相关工业应用提供指导。

摘要:以来自于谷氨酸棒杆菌内源AH6启动子和5′ UTR及其前38 bp结合合适的Shine-Dalgarno (SD) 序列，构建双顺反子表达载体对木聚糖酶进行表达。为了能够实现分泌表达，选取了来自谷氨酸棒杆菌的两种分泌途径的信号肽，分别为Tat型的CgR0949及Sec型的CspB信号肽。在实现分泌表达之后，对其进行5 L发酵罐的扩大培养以提高分泌量。并对纯化的木聚糖酶进行了部分酶学性质的研究，包括最适催化pH及酸碱耐受性；最适催化温度及热稳定性。结果表明：在上述表达体系中，以CgR0949为信号肽木聚糖酶不能分泌到胞外；木聚糖酶能在CspB信号肽的引导下分泌到胞外，分泌表达量为486.2 U/mL。木聚糖酶的分泌量在5 L发酵罐水平上达到1 648.7 U/mL，是摇瓶培养的3.4倍。该木聚糖酶的最适反应pH 为4.5，最适温度为45 ℃；在pH 4–11范围内4 ℃处理24 h酶活保持在80%以上；在50 ℃前处理15 min酶活保持在95%以上，超过60 ℃则酶活迅速下降至20%及其以下。上述结果表明，谷氨酸棒杆菌内源元件能有效用于木聚糖酶的分泌表达，扩大培养能进一步提升木聚糖酶的分泌量。该双顺反子表达体系能为外源蛋白在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达提供一种可用的工具。此外，通过酶学性质的研究可进一步提高木聚糖酶的催化效率。

摘要:超长链脂肪酸延长酶家族基因影响生物体的多种生理功能。文中克隆了家蚕的一个该家族成员Bmelo424基因，其ORF为558 bp。该基因的蛋白序列预测有4个跨膜结构域，并有6个丝氨酸磷酸化位点、8个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点，其亚细胞定位于内质网中，二级结构分析结果显示其α-螺旋和β-折叠股分别占26.7%和20％。荧光定量PCR结果显示Bmelo424基因在家蚕各组织均有表达，尤其在头部表达量最高。通过在酿酒酵母中异源表达Bmelo424基因的方法研究其对脂肪酸延伸的作用，GC-MS结果表明，携带pYES2-Bmelo424重组质粒的酿酒酵母的C16:1n-7脂肪酸含量有显著提高，而C16:0、C18:0和C18:1n-9的含量下降。温度胁迫结果显示，Bmelo424基因能够提高酿酒酵母的低温适应能力，但却降低其高温适应能力。这为探究家蚕Bmelo424基因的功能提供了参考。

摘要:为了在毛竹中开发更多的活性LTR反转录转座子，文中分析和鉴定了一个毛竹LTR反转录转座子 (Ph-LTR2)，系统分析了该转座子在逆境下的表达模式。Ph-LTR2转座子全长6 030 bp，属于Ty3-Gypsy家族中的Reina亚家族。LTR序列同源性为96.41%，插入时间约为61.92万年，在基因组中有5个拷贝。Ph-LTR2转座子结构域包括GAG (种属特异抗原，gag protein) 蛋白域、PR (蛋白酶，Proteases) 蛋白域、RT (反转录酶，Reverse transcriptases) 蛋白域、RH (RNA 酶H，Ribonuclease H) 蛋白域、INT (整合酶，Integrase) 蛋白域和CHR (染色质组织修饰域，Chromatin organization modifier) 蛋白域。通过实时定量PCR检测了INT、RT和RH的表达模式，确定INT、RT和RH在毛竹叶、笋、根存在组织表达特异性。在高温、低温、甲基化抑制剂、辐照与高盐等胁迫下，Ph-LTR2转座子INT、RT和RH的转录水平均不同程度地提高了，具体来讲，INT、RT和RH在高温、低温、甲基化抑制剂处理后转录水平上调；在低剂量辐照处理和低浓度盐溶液处理后转录水平也上调，但随剂量和浓度的增加表达水平又下降，这些结果表明Ph-LTR2转座子的表达模式响应外界环境的变化，但具体机制尚不清楚。本研究结果为开发基于Ph-LTR2转座子标签奠定了一定的理论基础。

摘要:地衣芽胞杆菌有效的基因编辑工具有限，为了拓展和丰富其基因编辑手段，在地衣芽胞杆菌中构建一个抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统，并通过敲除α-淀粉酶基因amyL、蛋白酶基因aprE及敲入外源透明颤菌血红蛋白基因vgb对该系统进行初步验证。首先以温敏质粒pNZT1为载体分别构建amyL和aprE基因敲除质粒pNZTT-AFKF和pNZTT-EFKF，两个敲除质粒各自包含针对目标基因的同源臂、抗性基因及同向的FRT位点；将敲除质粒转化地衣芽胞杆菌并经过两次同源交换过程实现目标基因的敲除；最后导入一个FLP重组酶表达质粒通过FLP/FRT系统的重组作用介导抗性基因的回收。为进一步验证本系统的实用性及编辑效率，构建了包含透明颤菌血红蛋白编码基因vgb表达盒及基因组丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB敲除盒的重组质粒pNZTK-PFTF-vgb，并以此进行外源基因vgb在基因组上的定向敲入。结果显示，成功敲除amyL及aprE并回收了抗性标记卡那霉素基因，敲除后淀粉酶活和蛋白酶活分别减少95.3%和80.4%；vgb基因成功整合入基因组pflB位点并回收了抗性标记四环素基因，并利用荧光定量PCR技术检测到vgb的整合表达。文中首次建立了一个适用于地衣芽胞杆菌的、抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统，并进行了基因敲除及基因敲入验证，为地衣芽胞杆菌遗传改造提供了良好的方法参考。

摘要:异戊酰螺旋霉素 (Isovalerylspiramycin，ISP)Ⅰ是必特螺旋霉素 (Bitespiramycin，BT) 的一种主组分，其抗菌活性与BT相似，而且作为单一组分在质控和剂型上更具优势，目前正在进行临床前研究。原有的ISPⅠ工程菌株经过3次基因改造，已经具有2种抗性基因，很难再进行遗传操作。前期研究利用经典同源重组的方法无法构建无抗性的ISPⅠ产生菌，文中利用CRISPR-Cas9基因编辑系统在螺旋霉素 (Spiramycin，SP) 产生菌中成功将3位酰基化酶的基因bsm4替换为组成型强启动子ermEp*控制下的异戊酰基转移酶基因 (Isovaleryltansferase gene，ist)。删除bsm4后突变株只能产生SPⅠ组分，外源基因ist的表达产物催化SPⅠ在其4″位进行异戊酰化修饰形成ISPⅠ。经过HPLC和质谱鉴定，阳性菌株ΔEI的发酵产物中只有ISPⅠ一种ISP组分，证实新的ISPⅠ工程菌株构建成功。ΔEI菌株不带有抗性基因，可重复利用CRISPR-Cas9系统进行基因操作来获得新的改良菌株。

摘要:本研究旨在制备抗人脂蛋白相关磷脂酶A2 (Lp-PLA2) 单克隆抗体，对单抗进行初步评价，采用免疫层析方法学，建立一种可在社区医疗机构应用的Lp-PLA2快速检测方法。首先从NCBI获得人Lp-PLA2全长基因序列构建表达载体，在CHO-K1细胞中表达Lp-PLA2重组蛋白。以获得的重组蛋白免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术筛选杂交瘤细胞，小鼠腹水诱生单克隆抗体。通过SDS-PAGE、ELISA等方法评价抗体性能。利用双抗夹心法制备Lp-PLA2量子点荧光免疫层析检测试剂，并使用便携式检测仪器评估试剂性能。制备并筛选得到亲和力达到1×10–8的配对单克隆抗体PLA1与PLA5，抗体亚类为IgG1，能特异性识别血液中Lp-PLA2蛋白。自制Lp-PLA2量子点荧光免疫检测试剂可检测线性范围为20–2 000 ng/mL，与进口试剂的检测相关系数R达到0.99。综上，本研究制备得到一对高亲和力、高特异性的抗人Lp-PLA2单克隆抗体，并建立了Lp-PLA2免疫层析检测方法，该方法检测准确、操作简便，适合Lp-PLA2检测应用于社区医疗机构，为居民心血管健康管理提供了新途径。

摘要:为开发新型荧光蛋白标记乳酸菌以填补国内研究空白，利用pSIP载体，构建了以红色荧光蛋白mCherry为标记，并以乳酸菌胆盐水解酶基因bsh为报告基因的乳酸菌融合表达系统。在4种不同启动子 (PsppA、PldhL、P32和PslpA) 调节下，相继实现了融合基因的诱导型和组成型表达，表达的融合重组蛋白mCherry-BSH同时检测出红色荧光活性和胆盐水解酶BSH活性。mCherry红色荧光标记的乳酸菌融合表达系统的成功构建不仅为研究乳酸菌在生物体内的分布、定植及存活情况从而揭示其益生功能的作用机理提供有利条件，也为更多活性蛋白在乳酸菌宿主中的表达、细胞定位、功能鉴定的研究奠定基础。

摘要:为缩短重组胰岛素起效时间，达到快速降低餐后血糖的作用，以圆锥芋螺胰岛素G1 (cI G1) 为研究对象，参照人胰岛素原 (hPI) 和圆锥芋螺胰岛素G1原 (cPI G1) 基因设计重组cPI G1的核苷酸序列，按照大肠杆菌Escherichia coli密码子使用频率进行密码子优化后构建pET22b(+)-cPI G1质粒，以E. coli BL21(DE3) 菌株为宿主进行原核表达，获得重组cPI G1蛋白，经胰蛋白酶切割及纯化得到重组cI G1，其效价为25.9 IU/mg。空腹血糖测试 (FBGT) 和葡萄糖耐量实验 (OGTT) 表明，cI G1可迅速降低正常和链脲佐菌素 (STZ) 致糖尿病模型小鼠的血糖，但持续时间短，研究结果为重组速效胰岛素的开发提供参考。

摘要:比较Ni2+-NTA磁珠和羧基磁珠固定结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶 (Mycobacterium tuberculosis dihydrofolate reductase，MtDHFR)，探索适合小分子配体混合物库筛选的MtDHFR固定化方法。重组表达带6×His标签MtDHFR，纯化后表征酶学性质，比较用Ni2+-NTA磁珠和羧基磁珠固定化时相应固定化容量、保留活性、稳定性及对抑制剂响应。结果表明，Ni2+-NTA磁珠对MtDHFR固定化容量为 (93±12) mg/g磁珠 (n=3)，但酶比活保留不超过32%，Ni2+明显抑制酶活性，EDTA与Ni2+呈协同抑制效应，Fe3+无显著干扰。羧基磁珠活化固定MtDHFR的容量 (8.6±0.6) mg/g磁珠(n=3)，固定化酶比活保留 (87±4)% (n=3)。在含50 mmol/L KCl的100 mmol/L HEPES (pH 7.0)中，游离和固定化MtDHFR在0 ℃保存16 h活性都无显著改变，但在25 ℃保存16 h，游离酶活性下降近60%而羧基磁珠固定化MtDHFR活性下降仅35%。甲氨喋呤对游离MtDHFR和固定化MtDHFR的IC50无显著差异 (P>0.05)。综上，Ni2+-NTA磁珠不适合固定化MtDHFR；羧基磁珠固定化MtDHFR能保留活性、热稳定性及对抑制剂的响应，该固定化方法有望用于快速筛选其配体混合物库。

摘要:高温高浓发酵技术作为一项新兴的啤酒生产技术，它为啤酒生产带来诸多利益的同时，也存在着发酵结束后酵母絮凝性下降、高级醇生成量过高等系列问题。为提高高温高浓发酵条件下酿酒酵母的絮凝性同时降低高级醇的合成能力，首先构建了以酿酒酵母BAT2基因为整合位点过表达FLO5基因的菌株，重组菌株S6-BF的絮凝性达到67.67%，比出发菌株S6提高了29%，而高级醇生成量仅降低5.9%；进一步构建以BAT2基因为整合位点再次过表达FLO5 基因的菌株，与出发菌株S6相比，重组菌株S6-BF2的絮凝性提高了63%，达到85.44%，高级醇生成量下降至159.58 mg/L，降低了9.0%；通过弱化线粒体支链氨基酸转氨酶 (BAT1) 的表达，高级醇的生成量得到进一步的降低，达到142.13 mg/L，比原始菌株S6降低了18.4%，同时重组菌株S6-BF2B1的絮凝性没有受到影响；风味物质的测定结果表明啤酒中醇酯比例较为合理。研究结果对工业啤酒酵母发酵后的沉降分离和提高啤酒风味品质有着重要的意义。

摘要:

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