摘要:CRISPR/Cas9基因编辑技术是通过人工设计的单向导RNA(Single-guide RNA，sgRNA)指导Cas9蛋白对目的基因靶位点进行特异性的识别、结合和切割后，通过细胞的非同源末端连接或同源末端重组修复机制来完成对基因组的敲除与敲入的编辑技术。RIG-I是机体的一种模式识别受体，能够识别胞质中的含5′-三磷酸基团的RNA，并通过与下游信号分子MAVS相互作用，激活IRF3/7和NF-κB，从而启动I型干扰素和炎性因子的表达。已有研究表明，B型流感病毒(IBV)在感染早期能够上调RIG-I的表达水平。为了探索RIG-I是否为B型流感病毒激活抗病毒天然免疫信号通路的主要受体及其对IBV复制的影响，本研究利用CRISPR-Cas9技术对293T细胞中的RIG-I基因进行了敲除，经嘌呤霉素压力筛选到了一株稳定敲除RIG-I基因的293T (RIG-I-/- 293T)细胞系。Western blotting 检测发现，IBV或仙台病毒感染后该细胞系中RIG-I不再表达，说明该敲除细胞系构建成功。IBV感染RIG-I-/- 293T细胞后，干扰素、炎性因子及干扰素刺激基因的转录水平与野生型293T细胞相比明显下降，并且在RIG-I-/- 293T细胞中检测不到p65和IRF3磷酸化，表明IBV感染早期细胞因子的表达主要依赖于RIG-I信号通路的激活。IBV在野生型及RIG-I-/- 293T细胞中的多步生长曲线表明，RIG-I可抑制 IBV的复制。以上结果表明，RIG-I敲除的293T细胞系构建成功，RIG-I是IBV激活下游抗病毒天然免疫信号通路的主要受体之一，且对IBV的复制具有负调控作用，该研究为探索IBV的感染机制奠定了基础。

摘要:人信号淋巴细胞激活分子F7 (SLAMF7/CS1) 是一种细胞表面糖蛋白，在多发性骨髓瘤细胞中高度表达。已有研究表明CS1是多发性骨髓瘤较为灵敏且特异的生物标志物。CAR-T细胞免疫疗法是治疗多发性骨髓瘤的新方法，其中CS1 CAR-T细胞免疫疗法针对复发性难治性多发性骨髓瘤有较好的疗效。为了检测CS1 CAR-T细胞上CS1 CAR的表达效率和探寻CAR-T细胞免疫疗法的辅助手段，文中制备了一种CS1-Fc融合蛋白。首先利用PCR技术从已有质粒中扩增得到CS1的胞外段序列，再通过重叠延伸PCR与人IgG1-Fc段相连。将重组片段连接至pMH3真核表达载体上，经酶切鉴定和DNA测序后，将重组质粒pMH3-CS1-Fc-his转染至中国仓鼠卵巢细胞 (CHO-S)。经G418加压筛选和流式细胞术鉴定，证实CS1-Fc融合蛋白在CHO-S细胞中获得了表达。利用镍柱对CS1-Fc融合蛋白进行纯化，经Western blotting鉴定，融合蛋白的分子量约为70 kDa。流式细胞术和细胞计数分析结果显示，CS1-Fc融合蛋白能有效检测CS1 CAR的表达效率，证实了CS1-Fc融合蛋白对CS1 CAR-T细胞具有活化、促增殖及促分泌细胞因子的作用。本研究结果为多发性骨髓瘤细胞免疫治疗CAR-T细胞的体外检测和效能强化奠定了实验基础。

摘要:同型融合和蛋白质分选复合体 (HOPS) 由VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41这6种蛋白组成，能够通过膜融合机制来调节生物体内的膜泡运输。已有研究表明其可以作为融合因子来促进自噬体与溶酶体膜融合过程。为在体外确定HOPS复合体与自噬性SNARE蛋白STX17是否具有直接相互作用，首先利用PCR技术从已有质粒中扩增得到6种基因的编码序列，将其连接至pGEX 4T-1-GST或pET-His-NusA原核表达载体上，经菌落PCR初步鉴定和DNA测序无误后成功构建6种原核表达重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)；利用谷胱甘肽琼脂糖树脂与镍柱对重组蛋白进行纯化，烟草蚀纹病毒 (TEV) 蛋白酶酶切掉GST或His-NusA标签，得到分子量约为105 kDa的HA-VPS11蛋白、97 kDa的Flag-VPS16蛋白、108 kDa的HA-VPS18蛋白、70 kDa的Flag-VPS33蛋白、97 kDa的HA-VPS39蛋白和98 kDa的Flag-VPS41蛋白；通过体外GST pull-down技术对6种蛋白的功能进行验证，证实自噬性SNARE蛋白STX17和6种重组蛋白在体外均具有直接相互作用，为深入探究HOPS复合体参与自噬体与溶酶体膜融合过程中的功能及作用机制奠定实验基础。

摘要:规律成簇间隔的短回文序列 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR) 是细菌和古菌中的获得性免疫系统，利用该系统能定点进行基因编辑。最近，科学家发现了新的CRISPR-associated (Cas)蛋白，其中由Cas12a介导的基因编辑能显著降低脱靶率。文中对CRISPR/Cas系统的发现历史、组成和分类、工作原理进行概述，并总结了该系统的最新研究进展及在斑马鱼Danio rerio中的应用。

摘要:非洲猪瘟 (African swine fever，ASF) 是由非洲猪瘟病毒 (African swine fever virus，ASFV) 引起的一种猪烈性传染病，是全球养猪业的“头号杀手”，强毒株引发的超急性和急性感染死率高达100%。2018年8月ASF首次传入我国，截止2019年6月6日，已有32个省份累计暴发137起疫情，给我国社会、经济构成巨大威胁。ASF疫苗的研制始于20世纪60年代，但均以失败而告终，其主要原因是对ASFV生物学特性缺乏深入的研究。有效控制当前ASF疫情扩散、研制安全有效的疫苗将是我国面临的巨大挑战。本文对ASFV形态与基本结构、传播途径、致病机制、基因组及编码蛋白、入侵机制、免疫逃逸等生物学特性进行了概述，并分析了当前疫苗研制面临的难点，以期为我国有效控制ASF疫情及病原研究提供参考。

摘要:HIV-1疫苗研发是当前艾滋病研究的一大热点，其病毒表面包膜糖蛋白Env三聚体介导病毒与细胞融合，是HIV-1疫苗研究的重要靶点。因此，设计并在体外表达类天然Env三聚体对HIV-1疫苗的研发具有重要的意义。近年来，Env三聚体研究取得了显著的进展。SOSIP、NFL2P、UFO等抗原改造方法实现了类天然Env三聚体的体外表达，逐步解决了改造抗原产量低、结构不稳定等问题，且表达的Env三聚体抗原能在动物免疫中诱导机体产生较高的中和抗体水平。Env三聚体改造方法促进了HIV-1疫苗的研究。文中综述了SOSIP、NFL2P、UFO三种HIV-1 Env三聚体抗原改造方法，对比各个改造方法优缺点，并结合自身工作提出相关建议，为后续HIV-1抗原的相关设计提供指导。

摘要:双特异抗体是指可以同时结合两个不同抗原或一个抗原不同表位的特殊抗体，目前已有3个双特异抗体批准上市，还有很多个双特异抗体处于临床或临床前研究阶段。文中就双特异抗体的发现、制备方法、结构类型和设计策略、作用机制以及目前研究现状进行综述。

摘要:文中简要介绍中国政府和中国科学院在基因技术研究领域的科技战略框架，以及在此指导下，中国研究人员取得的卓越进展，并通过文献计量和专利分析的方法揭示中国基因技术研发现状。无论在论文数量和质量，还是专利申请数量方面，中国都有了显著提升，但在国际合作和产学研结合方面仍有待加强。未来中国还需要抓好顶层设计，加强政府引导和监管，引入企业和社会的多方投资，加大科普宣传力度，预防生物安全和生物安保风险等。基因技术领域的创新和突破将为现代化产业的可持续发展提供主要的技术推动力，为中国生物经济发展注入新的活力。

摘要:为评价与比较马流产沙门菌 (Salmonella abortus equi) 2种不同鞭毛蛋白FliC (Flagellin C) 和FljB (Flagellin B) 的免疫原性，为进一步利用这两种蛋白奠定实验基础，本研究诱导表达及纯化FliC和FljB蛋白，将纯化后的蛋白分别免疫小鼠，对免疫后小鼠的抗体水平、滴度及抗体亚型进行检测，攻击小鼠后进行免疫相关受体检测及病理组织学观察。结果显示，成功诱导表达了重组蛋白FliC和FljB，纯化后蛋白的相对分子量分别为52 kDa和42 kDa。两种蛋白分别免疫小鼠，产生较高水平的特异性抗体IgG，FljB免疫组抗体水平高于FliC免疫组，且抗体亚型以IgG1为主。FljB免疫组攻击保护率为87.5%，高于FliC免疫组的75%，病理组织学及脏器荷菌数检测结果显示，FljB免疫组效果优于FliC免疫组；FljB免疫组诱导TLR2、TLR4、MHC-I、TCR (T细胞抗原受体) 的水平均高于FliC免疫组。该结果表明，FljB免疫组诱导小鼠免疫应答的水平高于FliC免疫组。

摘要:以随机整合方式获得的转基因动物外源基因的拷贝数、整合位点及染色体核型等遗传背景并不清楚，可能会存在外源基因的沉默整合、无效整合、毒性整合以及其表达水平不可预测等问题。文中选取了6只原代（F0）及其相对应的子一代（F1）的人乳铁蛋白（hLF）转基因山羊作为研究对象，分别颈静脉采血、提取DNA，通过染色体核型分析、实时荧光定量PCR（qPCR）、ELISA和Western blotting等检测技术，研究其外源基因的遗传背景与表达水平。结果显示，6只F0代转基因山羊的染色体没有明显的形态变异、数量改变等异常情况。相对拷贝数高低不同（2–16），且能够稳定地遗传给下一代，F0和F1代hLF基因拷贝数一致。F1代转基因山羊表达hLF水平最高可达1.12 g/L（L3-1，拷贝数8）。结果表明，整合的外源基因能够稳定地遗传下一代，也没有对转基因山羊个体的生长发育造成障碍，而且拷贝数高低与hLF表达水平无明显的相关性，这为转基因山羊及其他转基因动物的新品种培育奠定了基础，解析了遗传背景。

摘要:甲羟戊酸途径 (MVA途径) 被引入重组大肠杆菌中，能够提高重组大肠杆菌中萜类化合物的合成能力。但因重组大肠杆菌中萜类化合物合成途径中间产物积累，导致细胞生长和萜类化合物合成受到限制。本研究在稳定表达MVA途径以及优化2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径 (MEP途径)、番茄红素合成途径关键基因表达的重组大肠杆菌LYC103中，用质粒高表达MVA途径和番茄红素合成途径关键基因，挖掘该途径的限速步骤。结果表明，ispA、crtE、mvaK1、idi和mvaD基因过表达后，细胞生长没有明显变化，番茄红素产量依次提高了13.5%、16.5%、17.95%、33.7%和61.1%，说明这几个基因可能是合成番茄红素的限速步骤。mvaK1、mvaK2、mvaD三个基因在同一操纵子上，用mRNA稳定区 (RNA stabilizing region) 进行启动子文库 (mRSL) 调控mvaK1，相当于对3个基因同时调控。用高效基因组编辑技术 (CAGO) 对mvaK1基因的mRNA稳定区进行启动子文库的调控，得到菌株LYC104。番茄红素产量与对照菌株LYC103相比增加了2倍，细胞生长提高了32%。然后，利用CRISPR-Cas9技术在染色体lacZ位点整合idi基因，得到LYC105菌株。与出发菌株LYC103相比，细胞生长提高了147%，番茄红素产量增加了2.28倍。本研究在染色体上具有完整MVA途径的基础上，利用质粒高表达单个基因挖掘限速步骤，用同源重组方法整合限速基因、解除限速，为代谢工程构建高产菌株提供新策略。

摘要:法尼醇 (Farnesol, FOH) 是由焦磷酸异戊烯基 (IPP) 和焦磷酸二甲基烯丙基 (DMAPP) 合成的法尼酰基焦磷酸盐 (FPP) 去焦磷酸化作用生成的。在类球红细菌中IPP和DMAPP是由MEP途径生成，而完整的MEP途径需要消耗大量的辅因子NADPH，增加胞内NADPH的量有可能强化FOH的合成。文中从增加NADPH的生成和降低NADPH的消耗这两个策略出发，分别干扰了编码6-磷酸葡萄糖异构酶基因 (pgi) 和谷氨酸脱氢酶基因 (gdhA) 的表达，同时强化了磷酸戊糖途径中6-葡萄糖磷酸脱氢酶基因 (zwf) 和6-葡萄糖酸磷酸脱氢酶基因 (gnd) 的表达。实验结果表明，经改造的菌株NADPH含量显著增加，干扰菌株中菌株RSpgii的产量较高，为3.91 mg/g，在过表达的菌株中同时过表达zwf和gnd基因的重组菌株 (RSzg) 的FOH产量提高到了3.43 mg/g。为了获得FOH产量更高的菌株，以RSpgii为出发菌株，分别与zwf和gnd组合调控，获得的菌株RSzgpi的产量达到了最高量为4.48 mg/g，是出发菌株RS-GY2产率的2.24倍。

摘要:家蚕Bombyx mori是具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫，由家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV) 引起的家蚕血液型脓病每年给我国蚕桑产业造成巨大的经济损失。文中拟通过鉴定目前存在的家蚕抗病毒品系NC99R抗性特征，初步解析其抗BmNPV机制，以期为家蚕抗病品系分子机制解析提供一定参考。将对照组大造 (Dazao，DZ) 品系和实验组NC99R抗性品系家蚕幼虫分别定量添食BmNPV包涵体 (Occlusion bodies，OB)，计算DZ和NC99R品系对BmNPV的半致死剂量 (Median lethal dose，LD50)，结果显示DZ品系半致死剂量为1.2×105多角体/头，抗性品系NC99R的半致死剂量为1.8×106多角体/头，抗性水平相比对照组提高15倍左右。进一步统计分析DZ和NC99R品系口服感染1×106多角体/头和体腔注射1×106粒子/头出芽型病毒粒子 (Budded virus，BV) 后的死亡率，结果显示DZ品系死亡高峰集中在第4–6天，NC99R抗性品系死亡高峰集中在第6–8天，与对照相比延迟1–2 d。通过RT-PCR分析BmNPV DNA拷贝数，显示DZ在口服感染和体腔注射后BmNPV基因组都快速增殖，抗性品系NC99R BmNPV DNA拷贝数缓慢增加。HE染色分析显示DZ和NC99R品系在口服感染前期没有显著差异，感染到96 h，DZ中肠细胞核变大，成脱落趋势；而抗性品系NC99R，细胞核膨大，但细胞排列仍较整齐。RT-PCR分析病毒不同时期基因表达显示抗性品系NC99R在口服感染和体腔注射24 h后早期基因ie-1开始下调表达，其他时期基因随即下调表达；最后维持在较低表达水平或消失。

摘要:近年来，基于CRISPR/Cas9的碱基编辑技术因其具有不产生DNA双链断裂、无需外源DNA模板、不依赖宿主同源重组修复的优势，已经逐渐发展成为一种强大的基因组编辑工具，在动物、植物、酵母和细菌中得到了开发和应用。研究团队前期已在重要的工业模式菌株谷氨酸棒杆菌中开发了一种多元自动化的碱基编辑技术MACBETH，为进一步优化该方法，提高碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的应用效率，本研究首先在谷氨酸棒杆菌中构建了基于绿色荧光蛋白 (GFP) 的检测系统：将GFP基因的起始密码子ATG人工突变为ACG，GFP无法正常表达，当该密码子的C经编辑后恢复为T，即实现GFP蛋白的复活，结合流式细胞仪分析技术，可快速衡量编辑效率。然后，构建针对靶标位点的碱基编辑工具，经测试，该位点可成功被编辑，在初始编辑条件下碱基编辑效率为 (13.11±0.21)%。在此基础上，通过对不同培养基类型、诱导初始OD600、诱导时间、诱导物浓度进行优化，确定最优编辑条件是：培养基为CGXII，初始OD600为0.05，诱导时间为20 h，IPTG浓度为0.01 mmol/L。经过优化，编辑效率达到 (30.35±0.75)%，较初始条件提高了1.3倍。最后，选取原编辑条件下编辑效率较低的位点，进行了优化后编辑条件下的编辑效率评估，结果显示，不同的位点在最优编辑条件下的编辑效率提高了1.7–2.5倍，进一步证实该优化条件的有效性及通用性。研究结果为碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中更好的应用提供了重要的参考价值。

摘要:吡咯喹啉醌 (PQQ) 广泛存在于生物体内，具有促进机体生长、维护线粒体功能、促进神经生长因子合成和调节机体自由基水平等生理功能，在医药、食品和化妆品领域具有广阔的应用前景。为提高脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans FJNU-6的PQQ生产性能，文中以高浓度甲醇为拮抗因子进行实验室适应性定向驯化，通过光谱法快速筛选体系，选育PQQ高产正突变株。6轮适应性驯化后，每轮驯化的正向突变率达到90%以上，产量提高1倍的突变株达到10%左右。最后，利用5 L发酵罐对突变株FJNU-R8进行分批补料培养，相较于出发菌株，突变株在不同甲醇浓度下pqq和moxF基因簇的表达量较高且差异较小，甲醇消耗和生长速度较慢，PQQ产量达到1 087 mg/L (143 h)，单位细胞产量提高了1.42倍，展现出良好的工业应用潜力。文中所述的适应性定向驯化结合快速筛选体系能简单、快速地获得高产PQQ的生丝微菌突变菌株，对其他甲基营养菌高产PQQ突变株的高通量筛选具有借鉴作用。

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