摘要:自噬是一种高度保守的细胞内成分的降解过程，不仅维持细胞的代谢稳定，还与机体对抗各种病原菌感染有着密切关系。自噬能协助机体清除病原体，但有些细菌进化出多种策略干扰自噬信号通路或抑制自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体来逃避自噬的降解，甚至利用自噬来促进其生长增殖。文中从自噬的分子机制出发，讨论多种致病菌与宿主细胞自噬关系的最新进展，以及自噬与病原菌感染的作用和意义，以期为病原菌感染导致的自噬研究提供参考。

摘要:泛素化修饰作为最普遍存在的翻译后修饰形式之一，介导了生物体内蛋白质稳态调控等功能。泛素分子的7个赖氨酸和N端甲硫氨酸可以继续被泛素分子修饰，进而形成8种类型的泛素链。其中，K48和K63泛素链由于丰度高且功能研究相对清楚被称为经典泛素链，而其他6种泛素链被称为非经典泛素链。在非经典泛素链中，K27泛素链是在泛素分子的Lys27 (K27) 位点上继续发生泛素化形成的，具有紧密的空间结构。近些年，K27泛素链在固有免疫、蛋白稳态和DNA损伤修复等方面的功能逐渐被报道，但K27泛素链的合成、修剪过程及其下游招募特定蛋白质的分子调控机制还所知甚少。文中结合实验室研究，综述了K27泛素链结构特征、结合方式和生物学功能，为未来K27泛素链结构和生物学功能的深入研究提供参考。

摘要:亚硝酸盐是氮循环过程的中间产物，其积累超过一定量则会抑制微生物的生长与代谢，也会给人与水生生物带来健康风险。而在高氮污水生物脱氮工艺中，持续维持亚硝酸盐的积累能实现短程硝化过程，降低生物脱氮的能耗进而降低运营成本。本文综述了在水环境中亚硝酸盐积累的生物过程与积累原因，并对影响亚硝酸盐积累的因素进行了总结，旨在为提高污水处理过程中氮的去除效率，降低运营成本，减少排放污水及自然水体中亚硝态氮含量提供参考。

摘要:微小RNA (MicroRNA，miRNA) 是一类由18–25个核苷酸组成的高度保守的核苷酸序列，它可以特异性结合信使RNA (mRNA) 的3′-非编码区域，进而发挥降解mRNA或阻遏mRNA翻译的负调控作用。长链非编码RNA (Long non-coding RNA，lncRNA) 是一类长度超过200个核苷酸、不能编码蛋白质或只能编码蛋白质微肽的核苷酸序列，它可以在表观遗传、转录水平和转录后水平调控基因表达。脂肪作为一种重要的储能物质，在调节动物体能量平衡过程中发挥着重要的作用，并与动物产肉量、肉品质等产肉性状密切相关。而脂肪功能的紊乱可导致高血脂、Ⅱ型糖尿病以及一系列心血管疾病发生，因此动物脂肪沉积的分子调控机制备受人们关注。近年来，越来越多的研究发现miRNA和lncRNA在动物脂肪沉积中发挥重要作用。文中就现阶段miRNA和lncRNA在动物脂肪沉积中的研究进展进行综述，以期为进一步揭示动物脂肪沉积的分子调控机制提供理论指导和新思路。

摘要:辅因子工程是代谢工程的一个新兴分支领域，主要通过直接调控细胞内关键酶的辅因子，如ATP/ADP、NADH/NAD+、NADPH/NADP+等的浓度和形式来实现代谢流的最大化，快速地将物质流导向目标代谢物。ATP作为一种重要辅因子参与微生物细胞内大量的酶催化反应，将物质代谢途径串联或并联成复杂的网络体系，最终使得物质代谢流的分配受到牵制。因此ATP调控策略有望成为微生物菌株改造的有利工具，用于提高目标代谢物的浓度和生产能力，强化微生物对于环境的耐受以及促进底物利用等。文中将重点论述目前常用的有效ATP调控策略以及ATP调控对于细胞代谢的影响，以期为微生物细胞工厂的高效构建提供参考。

摘要:生物经济时代正在引发人类新一波技术和产业革命，并已成为了全球主要发达国家和新兴经济体抢占的制高点。文中从生物医药产业、转基因作物种植产业、生物能源产业以及生物基化学品产业4个角度分析了全球生物产业发展的时空特征，概括总结了全球生物产业发展的主要特点，并进一步针对我国生物产业发展中存在的瓶颈问题提出政策建议，对我国生物经济的未来发展具有指导意义。

摘要:马麝病毒性出血症 (Moschus chrysogaster viral hemorrhagic disease，McVHD) 为马麝的一种急性、高度致死性传染病，其病原马麝出血症病毒 (Moschus chrysogaster hemorrhagic disease virus，McHDV) 与兔出血症病毒高度同源。为了筛选McHDV保护性抗原，为McVHD疫苗研究奠定基础，文中通过对McHDV主要结构蛋白VP60抗原表位的分析，设计引物，应用RT-PCR技术扩增获得三段VP60主要抗原表位区核酸序列，并采用重叠延伸PCR将3段产物连接后克隆至原核表达载体pET-28a(+)，成功构建原核表达质粒pET-truncated-VP60后转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，并经IPTG诱导表达。纯化表达产物免疫3–4月龄非RHD免疫兔，血凝抑制试验测定抗血清效价。首次免疫后21 d，通过攻毒保护试验分析重组蛋白的免疫保护效力。结果表明，McHDV VP60主要抗原表位蛋白在大肠杆菌中成功表达，重组蛋白分子质量约为45 kDa，且以包涵体形式存在；重组蛋白纯化后配制疫苗免疫的新西兰白兔，可100%抵抗McHDV株的攻击，表明所筛选的抗原表位串联表达的重组蛋白具有良好的免疫保护效力，研究结果为McVHD新型疫苗的研发奠定了基础。

摘要:将来源于肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291的蔗糖磷酸化酶 (Sucrose phosphorylase, SPase) 基因进行密码子优化后将其插入到pET-28a中构建表达载体pET-28a-spase，诱导大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a-spase表达制得SPase粗酶液，将重组SPase纯化后进行酶学表征。结果表明，重组SPase的比酶活为213.98 U/mg，纯化倍数为1.47倍，酶活回收率达87.80%。该酶最适温度为45 ℃，最适pH为6.5，该酶对蔗糖的Km为128.8 mmol/L，Vmax为2.167 μmol/(mL·min)，kcat为39 237.86 min-1，利用重组SPase催化氢醌合成α-熊果苷，最优条件为：氢醌添加量为40 g/L，蔗糖/氢醌的摩尔比为5:1，重组SPase 250 U/mL。在25 mmol/L的吗啉乙磺酸 (MES) 缓冲液 (pH 7.0) 中，反应温度30 ℃，避光反应24 h后终止反应，再用500 U/mL的糖化酶40 ℃处理2.5 h。α-熊果苷产量达98 g/L，氢醌的转化率接近99%。综上所述，文中克隆并研究了重组SPase，并建立了其在α-熊果苷生产中的应用。

摘要:提高酶的热稳定性是生物催化领域的热点和难点，计算机辅助的理性设计相比于传统的定向进化更加高效，在酶工程领域中的应用越来越广泛和深入。文中以枯草芽孢杆菌脂肪酶A为模式蛋白，首先，利用Rosetta-VIP计算设计对酶的结构空腔进行分析，选择了16个有利于结构空腔填充 (ΔΔE<0) 的单点突变，并以突变位点的溶剂可及表面积和进化保守性为二次筛选依据，测定了其热稳定性与酶活性。有6个单点突变体(F17A、V74I、L114P、I135V、M137A、I157L) 的热稳定性得到了提高，其中Tm值最大提高3.18 ℃。结果表明，单点突变体满足ΔΔE越低、蛋白溶剂可及表面积减少且符合序列保守性，则得到保留原有酶活力的正向突变的可能性越大。此外，将热稳定性提高的6个单点突变进行迭代组合突变，两点组合突变体的Tm最大提高4.04 ℃，三点组合突变体的Tm最大提高5.13 ℃，四点组合突变体的Tm提高了7.30 ℃，六点组合突变体的Tm提高了7.43 ℃。因此，基于酶的分子结构的空腔分析、溶剂可及表面积及氨基酸序列保守性计算的多重虚拟筛选方法，可有效提高酶的热稳定性。

摘要:过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和氧气，在工业上有着较为广泛的应用。然而，纺织和造纸工业的特殊的高碱性环境，使得开发碱性过氧化氢酶有着重要的应用价值。利用大肠杆菌表达来自于谷氨酸棒杆菌的过氧化氢酶，对其表达条件进行了优化，并通过镍柱亲和层析的方法分离纯化重组蛋白，然后表征纯酶的酶学性质。最适表达条件为：诱导剂IPTG浓度0.2 mmol/L，诱导温度25 ℃，诱导时间11 h。过氧化氢酶比酶活达到55 266 U/mg，具有较高的催化活性。该酶具有相当宽泛的pH值适应范围，在pH 4.0–11.5范围内均具有较高的酶活性，并在pH 11.0条件下表现出最高的酶活性。将纯酶在pH 11.0的溶液中处理3 h时剩余酶活为93%，说明该酶在高碱条件下有良好的稳定性。该酶最适温度为30 ℃，在25–50 ℃热稳定性较好。其动力学参数Km为25.89 mmol/L，Vmax为185.18 mmol/(min×mg)。抑制剂十二烷基硫酸钠 (SDS)、尿素、NaN3、β-巯基乙醇、EDTA对酶活有不同程度的抑制作用。来源于谷氨酸棒杆菌的过氧化氢酶具有较高的催化效率、良好的碱耐受性，在工业生产中有较好的应用前景。

摘要:腈水合酶激活子具有亚基自身交换伴随子或者金属离子伴随子的功能，能够辅助腈水合酶摄取金属离子，对于腈水合酶的活性表达必不可少。与腈水合酶自身相比，激活子的序列保守性低，研究其激活作用的特点，探索其结构与功能之间的关系，对于理解腈水合酶的成熟机制具有重要意义。将红球菌Rhodococcus rhodochrous J1低分子量型腈水合酶L-NHase分别与4种异源激活子组合共表达，测定异源激活子对L-NHase的激活作用，进一步对激活子进行序列分析和结构模拟，并研究关键结构域的功能。结果表明，4种异源激活子均能激活L-NHase，但激活后L-NHase的比酶活存在差异，激活子A对L-NHase的激活程度最高，激活后的L-NHase比酶活为出发酶的97.79%；激活子G对L-NHase的激活程度最低，激活后的L-NHase比酶活为出发酶的23.94%。激活子E和激活子G具有保守结构域TIGR03889，缺失其中部分序列会使两者的激活作用基本丧失。将激活子G的N端序列替换为激活子E的N端序列，并将激活子E的C端序列添加至激活子G的C端，能够使L-NHase的比酶活提高178.40%。激活子的激活作用具有普遍性和特异性，其保守结构域对激活作用至关重要，同时N端结构域和C端结构域也对激活作用产生重要影响。

摘要:β-防御素是斑点叉尾鮰Ietalurus punetaus抵御病原微生物侵染的首要蛋白质免疫因子，其一级结构包含氨基端24个氨基酸组成的信号肽和羧基端43个氨基酸组成的成熟肽，该成熟肽赋予β-防御素的生物学活性。文中首次构建了产斑点叉尾鮰β-防御素的毕赤酵母 Pichia pastoris 重组菌株，实现了基于真核表达的斑点叉尾鮰β-防御素的生物合成。首先通过RT-PCR从斑点叉尾鮰皮肤中分离β-防御素成熟肽基因“IPBD”，将其与表达载体pPICZαA连接并转入毕赤酵母X-33后，获得重组毕赤酵母菌株；经含1 000 μg/mL博来霉素的培养基筛选，获得高拷贝重组菌株。以BMM培养基 (无氨基氮源培养基) 替代BMMY培养基 (含氨基氮源培养基)，对重组菌株的发酵培养条件进行优化，确定其产斑点叉尾鮰β-防御素的最适条件为：28 ℃、250 r/min、1.0%甲醇诱导表达96 h。重组菌株产物经镍离子亲和层析获得分子量为5.98 kDa的纯化蛋白，基于MALDI-TOF-TOF的质谱分析证明该纯化蛋白为重组IPBD。抑菌活性测定结果表明重组IPBD对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、单增李斯特菌Listeria monocytogenes以及革兰氏阴性的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的抑菌率分别为69.6%、71.6%和65.8%。本研究为鱼类来源天然小分子抗菌肽的开发提供了可参考的重组DNA技术。

摘要:堆肥中添加生物钝化剂是当前降低粪便中重金属生物毒性最为有效的方式之一，为了进一步提高其钝化重金属的能力，文中获得了复合重金属高耐性的钝化剂菌株，并探究其生物学特性和吸附特征。采集猪粪堆肥样品并在改良的牛肉膏培养基中分离和筛选耐铅又耐镉的高耐性菌株，通过形态结合分子生物学鉴定该菌株。该菌株分别在不同pH、温度和盐浓度条件下培养获得其最适的生长条件，进而在该条件下分析其对铅镉吸附的特性。结果获得一株耐铅浓度为600 mg/L、镉浓度为120 mg/L的铅镉复合耐性菌株SC19，该菌株为西地西菌属，其最适生长环境为pH值7.0、温度37 ℃、盐浓度0.5%。培养36 h的稳定期SC19菌株在吸附时间30 min时铅的去除率最高，对铅的最大去除率和吸附量分别为60.7%和329.13 mg/g；培养8 h的对数期在吸附时间30 min时镉的去除率最高，对镉的最大去除率和吸附量分别为51.0%和126.19 mg/g。红外光谱分析显示，SC19菌株对铅镉离子的吸附主要是细胞表面的多种活性基团与金属离子发生络合作用。该研究揭示了SC19菌株有较好的二价态铅镉离子吸附能力，可为生物钝化重金属提供重要的微生物种质资源。

摘要:细胞自噬是植物逆境应答过程中最常见的保护机制之一。动物中，自噬相关基因抵御镉 (Cd) 毒害的功能研究较清楚，但植物却知之甚少。文中以芹菜品种‘皇后’为试材，采用外源Cd (终浓度为0、2、4、8 mg/L) 添加营养液水培处理，利用转录组测序 (RNA-seq) 技术筛选细胞自噬相关差异基因并进行qRT-PCR验证。结果表明Cd胁迫对芹菜植株产生了明显的毒害作用，并与浓度间产生了量效关系。在筛选的8个差异表达的自噬相关基因中，ATG8a、ATG8f、ATG13、AMPK-1、AMPK-2基因随Cd浓度升高表达上调，ATG12、VPS30和VPS34则先上调后下降，说明自噬相关基因可能通过表达上调增加了自噬小体结构以抵御Cd毒性作用；而高浓度Cd (8 mg/L)可能超出芹菜的耐受范围，导致多个自噬基因又出现表达下调趋势。以上结果有助于后期自噬相关基因的功能研究，为进一步探讨芹菜对Cd胁迫的耐性机制提供参考依据。

摘要:对穗醋栗花色苷合成的分子机理知之甚少。拟探究穗醋栗花色苷合成关键基因dfr对不同颜色醋栗花色苷的影响，以黑穗醋栗 (Ribes nigrum L.)、红穗醋栗 (Ribes rubrum L.) 和白穗醋栗 (Ribes albrum L.) 果实为试材，通过RACE方法克隆二氢黄酮醇4-还原酶 (dfr) 基因cDNA全长序列，分别命名为Rndfr、Rrdfr和Radfr (KY786100、KY786101和KY786102)。系统发育分析表明，Rndfr、Rrdfr和Radfr在进化上具有较高的同源性。测定果实发育不同时期的花色苷含量，结果显示，黑穗醋栗和红穗醋栗花色苷含量较高且随着果实的发育成熟而逐渐增加。而白色醋栗中花色苷含量极低，几乎检测不到花色苷。定量PCR分析表明，dfr在黑穗醋栗中的表达量在果实成熟的各个时期均高于红穗和白穗醋栗。随着果实直径不断变大和果皮着色加深，在黑穗醋栗中，dfr的表达量总体呈现持续上升的趋势；在红穗醋栗中，果实着色约75%时dfr的表达量最高，之后下降；在白穗醋栗中，dfr的表达量总体呈现下降趋势，其表达量最低。推测dfr基因在醋栗果实呈色中发挥作用。

摘要:随着后基因组时代的到来，工业微生物的代谢工程改造在工业生产上发挥着越来越重要的作用。而基因组规模代谢网络模型 (Genome-scale metabolic model，GSMM) 将生物体体内所有已知代谢信息进行整合，为全局理解生物体的代谢状态、理性指导代谢工程改造提供了最佳的平台。乳酸乳球菌NZ9000 (Lactococcus lactis NZ9000) 作为工业发酵领域的重要菌株之一，由于其遗传背景清晰且几乎不分泌蛋白，是基因工程改造和外源蛋白表达的理想模式菌株。文中基于基因组功能注释和比较基因组学构建了L. lactis NZ9000的首个基因组规模代谢网络模型iWK557，包含557个基因、668个代谢物、840个反应，并进一步在定性和定量两个层次验证了iWK557的准确性，以期为理性指导L. lactis NZ9000代谢工程改造提供良好工具。

摘要:氨基甲酸乙酯 (Ethyl carbamate，EC) 是一种存在于发酵食品和酒精饮料中的可致癌物，过量摄入可能会影响人体健康。酶法降解是减少发酵食品中氨基甲酸乙酯及其前体尿素含量的有效方法之一。脲酶具有氨基甲酸乙酯水解酶和尿素酶两种活性，因此在减少发酵食品中氨基甲酸乙酯及其前体尿素方面具有良好的应用前景。目前脲酶降解发酵酒精饮料中氨基甲酸乙酯面临的主要问题是脲酶对氨基甲酸乙酯的催化活性及亲和力较低，因而其降解效果不理想。文中成功在大肠杆菌Escherichia coli中表达了来源于解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens JP-21的脲酶，表达水平为尿素酶3 291.74 U/L，氨基甲酸乙酯水解酶227.26 U/L。通过模拟脲酶中催化亚基UreC与氨基甲酸乙酯对接的结构，确定了M326和M374这两个影响酶与底物结合的位点。采用点饱和突变获得了3株氨基甲酸乙酯水解酶活性提高的突变体M374A、M374T和M326V，以EC为底物时的Km分别为101.84 mmol/L、129.49 mmol/L和121.67 mmol/L，比野生型分别降低了37.47%–50.82%。突变体可以降解黄酒中97%的尿素，M374T对黄酒中EC的降解效果最好，可将黄酒中EC从513.90 μg/L降至393.57 μg/L，降解率是野生脲酶的1.97倍。研究结果对今后改造脲酶催化特性和改善其应用特性具有重要意义，可为开发减控发酵食品中的微生物代谢氨 (胺)类危害物策略提供参考。

摘要:植物内生真菌一直是发现结构新颖、活性广泛的化合物的重要宝库。文中对一株艾纳香内生真菌粉红粘帚霉Clonostachys rosea进行化学研究，通过活性跟踪手段，结合硅胶柱色谱、凝胶色谱、以及半制备液相色谱技术从该菌株的发酵提取物中共分离获得6个单体化合物，经波谱学技术结合质谱鉴定其分别为verticillin A (1)、(S)-(+)-fusarinolic acid (2)、8-hydroxyfusaric acid (3)、cerebroside C (4)、3-Maleimide-5-oxime (5)以及bionectriol A (6)。所有化合物进行了体外抗大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌4株细菌的活性评价，其中1、4和6对3株细菌表现出显著的抑菌活性，MIC值2–16 μg/mL。研究结果为从黎药植物艾纳香的内生真菌中寻找新型抗生素提供重要参考。

摘要:构建基于TeI3c/4c嗜热二型内含子的温度诱导Targetron基因失活系统 (Thermotargetron)，并应用于中温微生物基因编辑。在大肠杆菌HMS174 (DE3) 基因组中，选择Subunit of flagellum基因 (fliC) 和C4 dicarboxylate orotate:H+ symporter基因 (dctA) 为靶基因。根据TeI3c/4c DNA识别规则，在fliC和dctA基因中选择fliC489a、fliC828s、fliC1038s和dctA2a位点为基因打靶位点。使用重叠延伸PCR方法，基于pHK-TT1A质粒构建打靶载体。打靶载体转化HMS174菌株，对数期转化子培养液48 ℃热激1 h后涂布于氯霉素抗性LB平板上。使用菌落PCR和DNA测序检测突变株并计算基因失活效率。获得突变株后，通过琼脂穿刺和碳源代谢实验，鉴定ΔfliC、ΔdctA突变株表型变化。菌落PCR测序结果表明，TeI3c/4c插入到fliC和dctA基因设计位点，且打靶效率高达100%。突变株表型验证实验表明，ΔfliC突变株运动能力显著下降，ΔdctA突变株苹果酸代谢能力缺失。综上所述，文中建立了一套适用于嗜中温微生物的温度诱导型、高效基因失活系统，该系统可通过控制宿主菌在48 ℃保温时间实现高效、靶向、精准基因失活。

摘要:本研究旨在探讨西门子ADVIA Centaur XP梅毒血清学试验化学发光免疫分析法 (CLIA) 检测梅毒螺旋体特异性抗体的测量阈值，并与化学发光微粒子免疫分析法 (CMIA)、梅毒螺旋体免疫印迹法 (TP-WB) 及梅毒螺旋体抗体颗粒凝集试验 (TPPA) 法检测结果进行比较，为CLIA方法的规范应用提供参考。收集河北燕达医院2018年7月至2019年7月雅培ARCHITECT i2000 CMIA法检测梅毒螺旋体特异性抗体筛查样本30 887例，选取CMIA法筛查梅毒特异性抗体中样品吸光度与临界值的比值 (S/CO) 为1–9的153例患者为研究对象，采用梅毒血清学检测逆序流程，并分别以TP-WB及TPPA法为确认方法，运用MedCalc对结果进行受试者工作特征曲线 (ROC曲线) 分析，获得截断值，采用卡方检验进行计数资料的差异显著性检验。采用不同方法对同一批血清样本梅毒螺旋体特异性抗体的检测结果存在差异，CLIA法与TPPA法差异不显著，与TP-WB法及CMIA法差异显著；分别以TPPA检测结果和TP-WB检测结果为金标准，ROC曲线分析发现，CLIA法的最佳诊断截断值分别为4.01和16.06，曲线下面积分别为0.961和0.838。采用不同梅毒血清学试验方法作为金标准时，CLIA法建议截断值差异较大，因此，CLIA测定梅毒抗体S/CO为1.00–16.06时，实验室血清学检测应推荐首选TP-WB方法学进行复核确证，避免临床误诊发生。

摘要:基于毕赤酵母核糖体DNA序列 (rDNA)，构建多拷贝谷氨酰胺转胺酶基因表达载体pPICZα-rDNA- mtg，并转化到表达前导肽 (Pro peptide或pro) 的宿主菌pGAP9-pro/GS115，得到共表达菌株pro/rDNA-mtg (GS115)。实时荧光定量PCR (qPCR) 分析了4株阳性表达菌株中mtg基因拷贝数，进一步研究了不同基因拷贝数对重组毕赤酵母产酶的影响及高产菌株在3 L发酵罐高密度发酵。结果表明，被检测的4株阳性表达菌株中mtg拷贝数分别为2.21、3.36、5.72和7.62 (mtg-2c、mtg-3c、mtg-6c和mtg-8c)，其发酵产酶能力和蛋白质表达水平为mtg-3c>mtg-2c>mtg-6c>mtg-8c；高密度发酵较低和较高拷贝数的两株菌mtg-3c和mtg-6c，发酵上清的最高酶活和单位菌体酶活分别为3.12 U/mL、52.1 U/g湿重和2.07 U/mL、36.5 U/g湿重，其中单位菌体酶活mtg-3c是mtg-6c的1.4倍；mtg-3c纯化酶的最高酶活达到7.21 U/mL，蛋白浓度为437.2 μg /mL。通过分析拷贝数对重组毕赤酵母产酶的影响，发现mtg-3c适合pro/rDNA-mtg中pro和mtg共表达，MTG高酶活与菌株较高分泌蛋白有关。

摘要:肠激酶 (Enterokinase，EK) 是一类特异性识别切割DDDDK序列的丝氨酸蛋白酶，作为一种工具酶广泛应用于生物医药领域。目前，EK在毕赤酵母Pichia pastoris中的表达水平较低，难以应用。本研究比较了6种不同的信号肽SP1、SP2、SP3、SP4、SP7和SP8对毕赤酵母分泌表达EK的影响。在摇瓶水平上，与α-factor信号肽相比，SP1信号肽显著提高了EK的分泌表达 (从6.8 mg/L提高至14.3 mg/L)，酶活从 (2 390±212) U/mL提高至 (4 995±378) U/mL。在此基础上，通过共表达毕赤酵母内源蛋白Kex2，EK酶活提高至 (7 219±489) U/mL。另外，N端融合WLR三个氨基酸进一步提高酶活至 (15 145±920) U/mL，比酶活为 (1 174 600±53 100) U/mg。EK在毕赤酵母中的高效分泌表达为未来应用奠定了基础。

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