• 2022年第38卷第6期文章目次
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      2022, 38(6):0-0.

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      2022, 38(6):0-0.

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      摘要:

    • >导读
    • 导读

      2022, 38(6):2055-2060. DOI: 10.13345/j.cjb.220456

      摘要 (133) HTML (304) PDF 411.09 K (297) 评论 (0) 收藏

      摘要:

    • >特邀综述
    • 抗新型冠状病毒中和抗体药物临床研究进展

      2022, 38(6):2061-2068. DOI: 10.13345/j.cjb.220118

      摘要 (388) HTML (858) PDF 392.14 K (917) 评论 (0) 收藏

      摘要:自1998年预防呼吸合胞病毒的帕利珠单抗药物上市以来,多种靶向病毒的治疗性抗体药物已成功用于感染性疾病的临床治疗。新型冠状病毒肺炎疫情暴发后,多种中和抗体药物快速进入临床研究阶段,展现出积极的治疗及预防效果,并以紧急使用授权的方式用于疫情防控。本文对抗新型冠状病毒中和抗体药物的临床进展和主要临床试验结果进行总结,以期为包括新型冠状病毒肺炎在内的新发、突发传染病中和抗体药物研发提供参考。

    • >综述
    • MicroRNA在自然杀伤细胞发育分化及功能调控过程中的作用

      2022, 38(6):2069-2078. DOI: 10.13345/j.cjb.210774

      摘要 (254) HTML (513) PDF 515.56 K (398) 评论 (0) 收藏

      摘要:自然杀伤(natural killer,NK)细胞是固有免疫系统中重要的效应细胞,在宿主抗感染、抗肿瘤中发挥重要作用,并参与免疫调节。NK细胞主要由骨髓造血干细胞发育分化而来,NK细胞的发育、成熟及功能依赖于微环境、胞内转录因子及转录后水平的调节。MicroRNA作为一种小非编码RNA,主要在转录后水平上调节靶基因的表达,在NK细胞的生命过程中发挥重要作用。研究发现年龄会影响NK细胞的miRNA表达谱,进而影响NK细胞的发育与功能。基于miRNA对NK细胞发育及功能的调节作用,miRNA可能作为潜在的靶标来保护或恢复患者NK细胞功能,从而治疗相关疾病。为此,文中将对microRNA在NK细胞发育分化及功能调控过程中的研究进展做初步概述。

    • CRISPR-Cas13a系统用于肿瘤诊断与治疗的进展

      2022, 38(6):2079-2086. DOI: 10.13345/j.cjb.210814

      摘要 (352) HTML (617) PDF 432.67 K (714) 评论 (0) 收藏

      摘要:CRISPR-Cas系统是一种目前已知的基因编辑工具,其中以靶向DNA基因组编辑的CRISPR-Cas9系统的研究较为成熟。相较于靶向DNA的基因组编辑技术CRISPR-Cas9系统,近年来靶向RNA的Ⅵ型-CRISPR家族CRISPR-C2c2/Cas13a系统研究日渐增多。CRISPR-Cas13a系统具有特异性识别并结合单链RNA序列从而非特异性切割RNA的特点,可应用于检测肿瘤外周血游离核酸,对早期肿瘤患者进行筛查。同时,Cas13a在进行体内RNA切割的过程中,不涉及编码基因DNA的改变,可直接对基因转录产物mRNA进行编辑,达到基因修饰的目的,并能够同时靶向多基因转录产物从而调控基因的表达。Cas13a系统可应用于分子诊断及RNA编辑中,该系统在肿瘤的诊断与治疗中也被证实具有广阔的发展前景。基于已有的文献资料,文中综述了靶向RNA的CRISPR-Cas13a技术应用于肿瘤诊断与治疗的研究进展,探讨了CRISPR-Cas13a系统对癌症治疗的新思路及存在的局限,并展望了未来可能的研究方向。

    • 纳米粒子在CRISPR/Cas9基因治疗中的应用

      2022, 38(6):2087-2104. DOI: 10.13345/j.cjb.210739

      摘要 (212) HTML (939) PDF 1.04 M (963) 评论 (0) 收藏

      摘要:CRISPR/Cas9基因编辑技术已成为基因治疗领域最有前景的工具。在临床应用中,对CRISPR/Cas9进行安全有效的递送一直是亟待解决的问题。纳米粒子,如脂基纳米粒子、聚合物纳米粒子、纳米金颗粒以及生物膜类纳米粒子等,因其生物相容性、安全性和可设计性等特点有望为基因治疗带来新的突破。文中首先对纳米粒子的特性和基因治疗中CRISPR/Cas9的发展进行了概述,然后详细归纳了纳米粒子在递送不同形式的CRISPR/Cas9中的应用,最后对纳米粒子介导的基因治疗的递送在未来面临的挑战和安全性等方面作出总结论述。

    • 肠道菌群在肿瘤发生发展及免疫治疗中作用的研究进展

      2022, 38(6):2105-2119. DOI: 10.13345/j.cjb.210711

      摘要 (452) HTML (868) PDF 525.77 K (1217) 评论 (0) 收藏

      摘要:肠道菌群是一个与人体共生的复杂微生物区系,近年来被越来越多的研究者所关注。研究发现,肠道菌群不仅在维持人体正常生理功能中起到重要作用,在肿瘤发生、发展、诊断及治疗中也有不可忽视的作用。本文在对肠道菌群与肿瘤关系进行概述的基础上,重点介绍了肠道菌群促进肿瘤发生、发展的主要机制,以及肠道菌群对抗肿瘤免疫治疗尤其是免疫检查点抑制疗法的影响。此外,文中还总结了目前可行的调节肠道菌群以提高肿瘤治疗疗效的方法,并提出了其中可能存在的困难和挑战。

    • 基于肠脑轴传播α-突触核蛋白诱发帕金森病的研究进展

      2022, 38(6):2120-2127. DOI: 10.13345/j.cjb.210822

      摘要 (238) HTML (808) PDF 530.59 K (679) 评论 (0) 收藏

      摘要:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是最常见的神经退行性疾病,随着我国人口老龄化加剧,PD病人的增加将造成严重的经济和医疗负担。PD的典型病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元的死亡以及多巴胺能神经元中异常聚集的淀粉样蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)形成病理包涵体即路易小体(Lewy body)。研究发现路易小体不仅存在中枢神经系统中,也同样存在于外周神经系统。肠道内丰富的肠神经系统被称为“第二大脑”。肠脑轴的发现也证明α-Syn能在大脑和肠道进行双向传输。肠道中也存在着庞大的微生物群,这些微生物参与病理性α-Syn的形成和传输。因此文中基于肠脑轴探讨α-Syn在大脑和肠道的双向传输关系,尝试探索肠道微生物群对α-Syn异常聚集的影响。结合目前PD病人的研究和动物模型尤其是非人灵长类实验的研究,希望为PD疾病的筛查和诊断提供参考。

    • 氨基酸对炎症性肠病的调控作用

      2022, 38(6):2128-2138. DOI: 10.13345/j.cjb.210697

      摘要 (219) HTML (995) PDF 602.80 K (742) 评论 (0) 收藏

      摘要:炎症性肠病是胃肠道的一种慢性复发性炎症,包括克罗恩病和溃疡性结肠炎,患者众多,而且目前很难实现彻底治愈。由于患者消化功能受损,食物不容易吸收,很容易出现营养不良的情况,临床经常使用营养治疗来克服营养不足、改变炎症状态。氨基酸作为辅助营养治疗,可能有助于维持炎症性肠病患者的肠道完整性,减少炎症、氧化应激和肠道细胞死亡,对炎症性肠病的治疗起到积极的作用。最近在动物方面的研究已经证明氨基酸在炎症性肠病治疗中存在着巨大的潜力,氨基酸的供应和代谢可能是一种有前景的辅助治疗方法。本文就谷氨酰胺、精氨酸、甘氨酸等特定氨基酸的免疫调节作用进行综述,以期提供一种新的治疗炎症性肠病的思路。

    • 单增李斯特菌感染胎盘相关毒力因子的研究进展

      2022, 38(6):2139-2152. DOI: 10.13345/j.cjb.210860

      摘要 (226) HTML (631) PDF 790.35 K (589) 评论 (0) 收藏

      摘要:单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种可引起李斯特菌病的食源性致病菌。由于妊娠相关免疫缺陷和LM对非吞噬细胞独特的细胞内感染能力,孕妇是LM的主要目标人群。LM可穿过胎盘屏障,对胎儿造成重大伤害,包括早产、流产甚至死产。胎盘特异性毒力因子的作用对LM感染期间穿过胎盘屏障并感染胎儿尤为重要。文中介绍了国内外近年在孕妇中发生LM感染的事件,详细讨论了LM垂直传播以及在胎盘定殖机制方面的研究进展,着重讨论并分析了LM与感染胎盘相关毒力因子的最新发现,以期为今后防控LM的胎盘感染并保障食品安全提供参考。

    • 嗜盐微生物在生物医药领域的应用研究进展

      2022, 38(6):2153-2168. DOI: 10.13345/j.cjb.210928

      摘要 (355) HTML (557) PDF 1.46 M (927) 评论 (0) 收藏

      摘要:近年来抗生素耐药性问题日趋严重,患癌人数也在逐年增加,亟需开发新型药物。嗜盐微生物作为一类特殊的极端环境微生物,具有代谢多样性丰富、营养需求较低和能适应恶劣条件等特点,是发现新型药物的希望。目前,国内外学者已从嗜盐微生物中分离出了多种代谢产物和酶,具有明显的抗菌和/或抗肿瘤等活性。文中综述了嗜盐微生物及其相关产物在抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、生物医学材料以及药物载体等生物医学方面的作用,尤其对近年来在嗜盐微生物中发现的新型抗菌和抗肿瘤物质以及嗜盐微生物特有的代谢产物四氢嘧啶等进行了总结,并对其后续在生物医药领域的开发和产业化应用进行了展望。

    • 组织器官脱细胞支架的制备及研究进展

      2022, 38(6):2169-2186. DOI: 10.13345/j.cjb.210772

      摘要 (339) HTML (1098) PDF 669.65 K (1009) 评论 (0) 收藏

      摘要:脱细胞基质(decellularized extracellular matrix,dECM)旨在去除引起免疫排斥的细胞,保留原组织结构和成分。由于其具有与原组织器官相似的结构和成分,在组织工程和生物医学的应用上受到广泛关注,已成为一种很有前景的生物医学材料。通过适当的脱细胞方法,dECM很容易能够从组织器官中获得。文中总结了脱细胞的方法及最新研究进展,同时对脱细胞后支架灭菌、交联和保存的方式进行综述,概括了不同组织器官获得的脱细胞支架的最新应用及进展。最后对脱细胞支架目前面临的问题和挑战进行分析,并展望了未来的发展趋势。

    • >医药生物技术
    • 植物咖啡酸-O-甲基转移酶的研究进展

      2022, 38(6):2187-2200. DOI: 10.13345/j.cjb.210818

      摘要 (335) HTML (1123) PDF 1.08 M (1005) 评论 (0) 收藏

      摘要:单木质素醇(H型、G型和S型)是构成植物木质素和木脂素的基本单元,其组成的不同直接决定木质素和木脂素的化学多样性和生物活性差异。咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase,COMT)可催化苯丙素类化合物羟基上氧原子的甲基化,在不同类型单木质素醇的构成中起决定作用,是木质素和木脂素生物合成途径的关键酶。2010年的相关综述主要对COMT的基因特征和在木质素生物合成中的调控作用作了介绍,文中聚焦了近十多年来COMT的最新研究进展,从基因特征、表达特征、结构特征和调控作用几个方面进行全面综述,并对COMT的研究和应用前景进行展望。

    • 基于多组学数据的肿瘤药物敏感性预测

      2022, 38(6):2201-2212. DOI: 10.13345/j.cjb.210676

      摘要 (398) HTML (1225) PDF 966.73 K (1346) 评论 (0) 收藏

      摘要:肿瘤药物敏感性预测在指导患者临床用药方面具有重要意义。本文基于癌症药物敏感性基因组学数据库(genomics of drug sensitivity in cancer,GDSC)198种药物的细胞系敏感性IC50数据,通过Stacking集成学习构建了包含基因表达、基因突变、拷贝数变异数据的多组学癌症药物敏感性预测模型。采用多种特征选择方法对基因特征进行降维,使用Stacking方法集成6种初级学习器和1种次级学习器进行建模,采用5折交叉进行模型验证。预测结果中AUC大于0.9的占比为36.4%,在0.8–0.9之间的占比为49.0%,最低AUC为0.682。基于Stacking构建的多组学预测模型较已有单组学和多组学模型的准确性和稳定性具有优势。多组学整合预测药物敏感性优于单一组学。特征基因功能注释和富集分析解析了肿瘤对sorafenib潜在的耐药机制,从生物学角度提供了模型可解释性及其应用于临床用药指导的价值。

    • 在cDNA文库构建中探究癌症病人血浆外泌体miRNA的特异性扩增

      2022, 38(6):2213-2223. DOI: 10.13345/j.cjb.210758

      摘要 (176) HTML (620) PDF 849.45 K (429) 评论 (0) 收藏

      摘要:血浆外泌体微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)与癌症的发生、诊断和治疗密切相关,但其分子机制尚不明晰。本研究探讨了癌症病人血浆外泌体miRNAs在cDNA文库构建中非特异性扩增的解决方案。在酶切法中,采用核酸外切酶T (exonuclease T,EXOT)和phi29 DNA聚合酶降解引物;在磁珠法中,利用DNA结合磁珠分离模板和引物。随后,采取琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测磁珠分离情况,运用RT-qPCR检测癌症病人血浆外泌体miRNA和不同连接物的含量变化。结果显示,非特异性扩增来源于miRNA的连接物USR5SR;核酸外切酶T (EXOT)和phi29 DNA聚合酶虽可降解USR5SR,但模板链也会发生降解;磁珠分离法中以9% PEG沉淀引物片段、15% PEG沉淀模板链效果最佳。综上所述,磁珠分离法能够高效解决cDNA文库构建中的非特异性扩增,从而实现293T细胞和癌症病人血浆外泌体miRNA cDNA文库的成功构建。

    • 实时荧光定量PCR快速鉴别新型冠状病毒主要变异株

      2022, 38(6):2224-2235. DOI: 10.13345/j.cjb.220028

      摘要 (213) HTML (1118) PDF 4.20 M (858) 评论 (0) 收藏

      摘要:为建立一种快速鉴别严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的5种主要变异株的TaqMan探针实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)体系,基于SARS-CoV-2野生型及变异株alpha (N501Y、HV69-70del)、beta (E484K、K417N)、gamma (K417T、V1176F)、delta (L452R、T478K)和omicron (H655Y、N679K、P681H)序列设计特异性引物、探针,建立和优化一种鉴别新型冠状病毒(SARS-CoV-2)5种主要变异株的TaqMan探针RT-qPCR方法,并进行该方法的特异性、敏感性、鉴别能力评价。该方法可准确区分出SARS-CoV-2野生型和突变型,与其他呼吸道病原体(n=21)无交叉,显示高特异性。该方法最低检测限为2×102拷贝/mL,操作简单、快速、成本廉价,可用于监测SARS-CoV-2毒株的变异,精准指导疫情识别与防控。

    • 新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的优化与应用

      2022, 38(6):2236-2249. DOI: 10.13345/j.cjb.210657

      摘要 (229) HTML (1268) PDF 954.38 K (679) 评论 (0) 收藏

      摘要:基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理,以新冠病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)为靶标,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,以期快速筛选新型Mpro小分子抑制剂。利用大肠杆菌原核表达与分离纯化高活性的Mpro,再以FRET法进行比活力测定。基于FRET原理,以7-甲氧基香豆素-4-乙酸(7-methoxycoumarin-4-acetic acid,MCA)与2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitropheno,Dnp)标记的多肽作为Mpro水解底物,通过优化反应缓冲液、Mpro反应浓度、反应温度与时间及DMSO耐受浓度,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型进行苗头化合物的筛选。利用大肠杆菌实现了高活性Mpro的原核表达与分离纯化,且比活力不低于40 000 U/mg。通过一系列优化实验,使用0.4 μmol/L Mpro与5 μmol/L底物建立了Z'因子值为0.79的Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,且反应体系中含有的二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)是影响FRET筛选模型可靠性的重要因素。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现白花丹素与银杏酸在体外对Mpro酶活性具有良好的抑制作用。本研究建立了基于FRET原理的Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步证实了白花丹素与银杏酸是一类新型苗头化合物,为抗新型冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础。

    • SARS-CoV-2中和纳米抗体在里氏木霉中的重组表达

      2022, 38(6):2250-2258. DOI: 10.13345/j.cjb.210681

      摘要 (187) HTML (404) PDF 557.19 K (429) 评论 (0) 收藏

      摘要:基于骆驼科动物单链抗体VHH结构域的纳米抗体具有分子量小、结构简单、溶解性好、稳定性强等多种优势,可通过吸入给药,在呼吸道病毒的防控中具有重要应用价值。里氏木霉是食品级的蛋白质生产宿主,其纤维素酶分泌量可达到80 g/L以上,有望用于药物蛋白的低成本生产。文中在密码子优化的基础上,使用组成型强启动子Pcdna1,实现了SARS-CoV-2中和纳米抗体Nb20在里氏木霉中的重组表达。将Nb20与里氏木霉纤维二糖水解酶CBHⅠ的N端片段融合表达,并在二者间引入胞内KEX2蛋白酶切位点,于葡萄糖培养基中摇瓶发酵48 h可生产出浓度为47.4 mg/L的Nb20蛋白。重组表达的纳米抗体能够与SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合区相结合,有望用于新型冠状病毒的中和。以上结果显示,里氏木霉在纳米抗体的重组表达中具有一定的应用潜力。

    • 基于蛋白质结构预测的胰岛素样生长因子-1的制备及活性分析

      2022, 38(6):2259-2268. DOI: 10.13345/j.cjb.210723

      摘要 (243) HTML (867) PDF 731.43 K (502) 评论 (0) 收藏

      摘要:为了更经济高效地制备胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1),本研究采用计算机模拟技术对3种IGF-1融合蛋白进行蛋白质结构预测与分子对接,筛选出酶切最适配的IGF-1融合蛋白表达形式。利用基因工程技术构建并鉴定了IGF-1融合蛋白原核表达载体,并转化大肠杆菌Origami B (DE3)菌株,获得重组子;经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达后,对菌体的破菌上清进行亲和层析、脱盐、凝血酶酶切及酶切产物亲和层析纯化得到目的蛋白;通过3T3细胞增殖法建立活性评价体系并对获得的IGF-1进行活性测定。结果显示,构建的IGF-1融合蛋白原核表达载体序列正确,获得的重组子在25℃、0.05 mmol/L IPTG诱导16 h时融合蛋白为可溶性表达,经初步纯化、凝血酶酶切、再次纯化后可获得纯度大于90%的IGF-1目的蛋白,在建立的活性评价体系下测得制备的IGF-1比活为2.47×105 U/mg,与市售标准品接近。本研究建立了一条用于制备IGF-1的完整工艺路线,为IGF-1药物的研制及工业化生产奠定基础。

    • 利用植物质体转基因技术高效表达抗人源白介素6单链抗体

      2022, 38(6):2269-2280. DOI: 10.13345/j.cjb.210872

      摘要 (245) HTML (780) PDF 727.64 K (516) 评论 (0) 收藏

      摘要:白介素6(interleukin-6,IL-6)是与包括癌症在内的多种疾病相关的一种多功能细胞因子,免疫疗法利用抗人源IL-6抗体来治疗相关疾病取得了很好的治疗效果。植物作为生物反应器可以有效降低药用蛋白的生产成本,同时积累功能蛋白。通过基因枪轰击和再生筛选,得到了2个在烟草质体中表达了鼠源抗人源IL-6单链抗体(single chain variable fragment,scFv)的独立株系,并用Southern blotting鉴定了质体转化烟草的同质化状态。抗人源IL-6 scFv基因在质体转基因烟草中成功转录和翻译,功能性抗人源IL-6 scFv在质体转基因烟草叶片中的含量占到总可溶性蛋白的1%,达到41 mg/kg鲜重。另外,质体转基因烟草的表型与野生型烟草相比并没有显著差异,它们具有相似的生长速率、成熟植株的株高以及果荚数目。抗人源IL-6 scFv的高表达量也表明了利用质体转基因植物低成本生产scFv的潜力。

    • 尖端载药气泡可溶性微针的制备与透皮效果分析

      2022, 38(6):2281-2291. DOI: 10.13345/j.cjb.210959

      摘要 (263) HTML (897) PDF 797.87 K (488) 评论 (0) 收藏

      摘要:气泡微针作为一种新型的经皮递药技术,可以实现无痛精确给药,引起了研究者极大的关注。为了提高微针携带药物的利用率,本文提出了一种尖端载药气泡可溶性微针的制备方法。在微针成型过程中将气泡形成于针体内,药物集中到微针顶端。重点研究了气泡微针的制备优化工艺,并探究了起泡剂浓度、干燥温度、溶液黏度对气泡微针成型效果的影响,同时对其透皮效果进行了分析。实验结果表明,气泡微针成型工艺稳定,成型率在90%以上,同时将成型周期缩短至4 h左右。药物主要集中在微针针尖,高度在180 μm,气泡的高度在250 μm,且该微针阵列能够在小鼠皮肤上打出微通道,微针的针体能够在5 min内迅速溶解。透皮扩散实验表明,气泡微针能够在1 min内迅速释放约48%的药物,5 min内共释放约91%的药物。微针阵列的气泡微结构能够阻碍药物向基底的扩散,有效提高了药物的利用率,为微针透皮给药的实际应用提供了一定技术依据。

    • >组织工程与细胞培养
    • 贝莱斯芽孢杆菌抗真菌能力及基因组分析

      2022, 38(6):2292-2307. DOI: 10.13345/j.cjb.210804

      摘要 (245) HTML (1127) PDF 841.15 K (708) 评论 (0) 收藏

      摘要:蛋白水解酶及脂肽类化合物具有广谱的抑菌活性,这些抑菌活性蛋白及物质拥有巨大的研究和开发潜力。本研究通过蛋白水解酶平板筛选到一株对6种不同病原真菌有较明显抑菌效果的菌株,命名为X49,对该菌株进行理化分析,并由16S rRNA基因测序、API测试和电镜分析鉴定菌种,进一步分析其基因组序列,再利用偶氮酪蛋白方法分析蛋白水解酶活性及提取脂肽类化合物进行抗真菌测试。结果表明,该菌株在10–50℃、pH 4.0–9.0范围内均可以生长,对环境盐浓度的适应性较强,在10% NaCl浓度下仍然能够生长。菌种鉴定发现X49菌株属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。基因组分析则显示,B. velezensis X49菌株有11个编码的丝氨酸蛋白酶,其基因编号1_894属于S8枯草杆菌蛋白酶家族,与已知具有抗真菌能力的丝氨酸蛋白酶有高达99%的相似度。另外有多达30个编码的非核糖体肽合成酶,其中包含参与合成已知的表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、杆菌肽及短杆菌肽脂肽类化合物。胞外蛋白水解酶活性分析发现其在高温下仍具有一定的活性。将B. velezensis X49菌株与中药干姜共发酵后,提取出的脂肽类化合物,其抑菌功效大大提高。由此可见,本研究筛选出的B. velezensis X49菌株对于植物及人类病原菌都有很显著的抑制作用。而与中药共发酵的活性物质可作为未来药物的研究开发。

    • >生物技术与方法
    • 负载淫羊藿苷的壳聚糖基仿生支架的促软骨形成和炎症缓解作用

      2022, 38(6):2308-2321. DOI: 10.13345/j.cjb.210838

      摘要 (200) HTML (822) PDF 955.22 K (391) 评论 (0) 收藏

      摘要:淫羊藿苷(icariin,ICA)是具有促软骨修复和抗炎作用的小分子药物,将ICA负载到软骨组织工程支架将能增强支架的生物功能性。本研究将聚l-丙交酯-己内酯(poly (L-lactide-co-caprolactone,PLCL)电纺纤维经聚多巴胺(polydopamine,PDA)涂覆处理后制备成的短纤维与柠檬酸/壳聚糖溶液(citric acid/chitosan solution,CC)混合,通过冻-融和冷冻干燥方法制备成短纤维增强的壳聚糖水凝胶(PDA@PLCL/CC);然后通过物理吸附方法负载ICA构建新型工程软骨仿生支架(ICA-PDA@PLCL/CC);最后通过体外兔软骨细胞培养试验,研究ICA介导的软骨仿生支架对软骨细胞功能及炎症反应的影响。结果表明,PDA@PLCL/CC具有适当的孔径和孔隙率(>80%),具有较高的吸水率和力学性能,能够促进软骨细胞增殖和黏附。ICA-PDA@PLCL/CC支架利于维持软骨细胞形态,且能促进软骨生成性基因(sox-9)、糖胺聚糖(gag)和Ⅱ型胶原(col)基因的表达和软骨基质的合成。在模拟炎症存在的情形下,ICA-PDA@PLCL/CC仿生支架可降低软骨细胞纤维化,有效下调软骨细胞促炎症因子白介素-6(il-6)、白介素-1β(il-1β)和诱导型一氧化氮合成酶(inos)的表达,减少基质金属蛋白酶-3(mmp-3)的表达,提高软骨胞外基质糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)和Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen,Col Ⅱ)的合成。该研究发展的ICA-PDA@PLCL/CC工程软骨仿生支架在软骨损伤的再生修复中具有应用潜力。

    • 高尔基体跨膜糖蛋白73高表达诱发脂肪肝的脂类特性分析

      2022, 38(6):2322-2331. DOI: 10.13345/j.cjb.210808

      摘要 (182) HTML (614) PDF 973.45 K (396) 评论 (0) 收藏

      摘要:脂肪性肝病是最常见的慢性肝脏疾病,脂质代谢异常是脂肪性肝病发生的重要原因。为研究高尔基体糖蛋白(Golgi protein 73,GP73)对肝脏脂质代谢的影响,选用八周龄C57BL/6J小鼠通过尾静脉注射搭载GP73的腺相关病毒(AAV-GP73),构建肝脏特异性高表达GP73的小鼠,通过对肝脏进行脂质代谢组学分析发现小鼠肝脏中的脂质尤其是甘油三酯明显增加。京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析显示,GP73通过引起脂代谢产物的改变导致诸多与细胞代谢活动相关的信号通路出现紊乱,特别是与人类密切相关的疾病如Ⅱ型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和癌细胞胆碱代谢更可能发生失调。研究表明,GP73可能通过参与调控脂类代谢并促进肝脏内脂质积累诱发脂肪肝。

    • 软骨寡聚基质蛋白荧光免疫层析定量检测方法建立

      2022, 38(6):2332-2341. DOI: 10.13345/j.cjb.210746

      摘要 (178) HTML (370) PDF 692.80 K (327) 评论 (0) 收藏

      摘要:本研究旨在建立一种可用于类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)辅助诊断的人软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)荧光层析检测方法。采用双抗体夹心法原理制备免疫层析试纸条,并进行性能评价及方法学对比。通过对临床样本的检测得到受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线,计算试纸条灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值。线性范围为0.39–50.00 ng/mL;批内批间变异系数均小于15%;试纸条37℃加速破坏20 d,荧光信号强度变化范围在15%以内;与类风湿因子(rheumatoid factor,RF)、抗环瓜氨酸肽(anti-cyclic citrullinated peptide,anti-CCP)抗体无交叉反应;与ELISA试剂盒平行检测48份临床血清样本,相关性良好。采用本研究制备的试纸条检测样本,COMP区分RA患者和健康人的cut-off值为22.55 ng/mL (灵敏度为0.821,特异度为0.842,阳性预测值为0.741,阴性预测值为0.895)。同时使用ELISA试剂盒进行相同样本检测,两种检测方法灵敏度、特异度均能达到80%以上。这种可定量检测COMP的荧光层析试纸条具有快速、简便、灵敏等优点,可为RA患者提供快速辅助诊断。

    • 人脐血血浆外泌体提取方法的比较

      2022, 38(6):2342-2351. DOI: 10.13345/j.cjb.210919

      摘要 (201) HTML (1084) PDF 778.38 K (702) 评论 (0) 收藏

      摘要:为探寻高效且稳定的提取人脐血血浆外泌体的方法,利用超高速离心法、蔗糖垫密度梯度离心法、改良超速离心法和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀法提取人脐血血浆外泌体,并比较4种方法的优劣。利用透射电镜、动态光散射技术观察外泌体的形态、结构及大小;聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)法测定外泌体蛋白总量;Western blotting检测外泌体表面标志蛋白CD63、HSP70以及外泌体阴性蛋白GM130(高尔基标志蛋白)的表达。结果表明,与提取外泌体的“金标准”,即超高速离心法相比,蔗糖垫密度梯度离心法稳定性好,获取的外泌体粒径较均一,但操作较复杂,耗时长;改良超速离心法操作较简单,纯度较高;PEG沉淀法提取的外泌体蛋白量最高,操作时间最短,但杂质较多。结果表明,4种方法均能从人脐血血浆中获取外泌体,但在操作时间、纯度、提取量等方面存在一定差异。因此,应根据实验目的和具体要求选择合适的提取人脐血血浆外泌体的方法。

    • 新型三明治样荧光偏振筛选模型在新型冠状病毒主蛋白酶小分子抑制剂筛选中的应用

      2022, 38(6):2352-2364. DOI: 10.13345/j.cjb.210949

      摘要 (159) HTML (481) PDF 903.15 K (416) 评论 (0) 收藏

      摘要:新型冠状病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)通过水解多聚蛋白质体(polyprotein)调控病毒基因组RNA复制,且人体不存在其同源蛋白酶,这使Mpro成为抗新型冠状病毒药物开发的理想靶标之一。本研究基于荧光偏振技术(fluorescence polarization,FP)和生物素-亲和素反应(biotin-avidin system,BAS)原理,成功地建立了三明治样荧光偏振筛选模型用于Mpro小分子抑制剂的快速筛选。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现了漆树酸(anacardic acid,AA)是Mpro的竞争型抑制剂,1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-O-pentagalloylglucose,PGG)是Mpro的混合型抑制剂,且已报道的部分抑制剂是非特异性Mpro小分子抑制剂。文中建立的三明治样荧光偏振筛选模型具有良好的简便性、灵敏性和稳定性,初步证实了漆树酸和PGG是一类新型苗头化合物,建立科学严谨的活性评价体系对于抗新型冠状病毒药物的筛选与发现是至关重要的。

    • 利用ELP-Intein系统在大肠杆菌中生产抗菌肽DLP4

      2022, 38(6):2365-2376. DOI: 10.13345/j.cjb.210841

      摘要 (266) HTML (729) PDF 752.02 K (565) 评论 (0) 收藏

      摘要:DLP4(defensin-like peptide 4)是一种新型昆虫防御素抗菌肽,对革兰氏阳性细菌具有强大的抗菌活性而且不易产生抗药性。本研究利用类弹性蛋白(elastin-like polypeptide,ELP)的相变特性和蛋白质内含子(intein,I)的C端断裂系统,通过构建重组表达质粒pET-ELP-I-DLP4,以大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主细胞,诱导表达后的重组蛋白通过简单的离心、pH和温度转变进行纯化得到DLP4。研究中发现,在表达纯化过程中蛋白质内含子发生了C端提前断裂。为了解决这一问题,将其断裂为N端片段(I0N)和C端片段(I0C)后,分别与ELP或DLP4融合,构建了pET-ELP-I0N和pET-ELP-I0C-DLP4两种重组表达质粒。分别在大肠杆菌中诱导表达,将表达后的菌液混合,使蛋白质内含子恢复C端断裂活性,最终得到的DLP4的得率约为1.49 mg/L。抑菌试验证明纯化的DLP4表现出预期活性,这为DLP4在原核系统中的表达纯化提供了有效途径。

    • 生物法合成肠炎沙门菌糖蛋白

      2022, 38(6):2377-2388. DOI: 10.13345/j.cjb.210855

      摘要 (213) HTML (721) PDF 734.11 K (363) 评论 (0) 收藏

      摘要:肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)是一种重要的人兽共患病原菌,在对该菌感染的预防与控制上一直存在困难,而糖蛋白疫苗的出现为其预防提供了新的思路。对于糖蛋白的合成,一般采用传统的化学交联方法,该法制备流程烦琐、生产成本高。因此,探索经济且稳定的生物合成方法非常必要。为了实现生物法合成肠炎沙门菌糖蛋白,本研究利用CRISPR/Cas9方法构建肠炎沙门菌waaL基因缺失株SE ΔwaaL,使用银染的方法检测细菌外膜脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的合成情况。使用环形PCR方法构建了表达寡糖转移酶PglL、重组铜绿假单胞菌的外毒素(recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,rEPA)和霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit,CTB)的表达质粒,并分别在rEPA的N端和CTB的C端加入了PilES45-K73糖基化位点序列。将重组质粒转化到SE ΔwaaL中,诱导表达后通过Western blotting方法对糖蛋白的合成进行验证,并通过镍柱(Ni-NTA)对糖蛋白进行纯化。结果表明,waaL基因的缺失阻断了肠炎沙门菌LPS正常合成,在该缺失株中rEPA和CTB蛋白均可成功表达。此外,在表达寡糖转移酶PglL的情况下,rEPA和CTB发生了明显的糖基化,其糖基化部分为肠炎沙门菌O抗原多糖。本研究结果证明肠炎沙门菌缺失waaL基因后,在寡糖转移酶PglL的作用下可以将自身O抗原多糖链共价连接到载体蛋白rEPA和CTB上,形成糖蛋白,为生物法合成肠炎沙门菌糖蛋白的研究奠定了基础。

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