摘要:

摘要:

摘要:

摘要:Sanger测序法，又称第一代测序技术，作为测序金标准推动了人类基因组“工作框架图”的绘制，但通量低、成本高的缺点限制了其进一步大规模应用。第二代测序技术，又称下一代测序技术，因其通量高、成本低等优点使得基因测序在基础研究与临床诊疗中得到广泛应用，但短读长一直是其不可回避的技术短板。第三代测序技术的出现，因其具有长读长优势，为基因序列上复杂重复区域解析与高质量基因组组装提供了新的技术手段。近年来，第三代测序技术进一步发展与完善，同时在肿瘤、免疫、生殖等相关领域逐步体现出临床应用价值。本文将综述第三代测序技术的研究进展与临床应用。

摘要:环状RNA (circular RNA,circRNA)是一种单链环状闭合RNA分子，由线性RNA通过反向剪接形成，具有稳定、高度保守、组织特异性等特点。circRNA能够通过形成竞争性内源性RNA、结合蛋白等多种方式参与机体的生理、病理过程。最近发现，circRNA分子可以通过翻译形成多肽或蛋白参与癌症的发生和发展。circRNA是人类癌症中有前途的诊断和预后标志物，也是癌症治疗的潜在药物靶点。本文重点介绍了circRNAs编码的多肽和蛋白质在多种癌症中的相关研究进展。这些多肽和蛋白质分别依赖内部核糖体进入位点和m6A两种不同的机制进行翻译。我们还总结了circRNA编码的多肽和蛋白质在各种癌症的诊断、治疗、预后和机制研究中的潜在用途。

摘要:由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的2019年冠状病毒肺炎(COVID-19)，其持续大流行已对世界公共卫生安全造成严重的危害。发展病毒检测技术并运用于卫生管理包括人员排查、患者鉴别与治疗、减缓病毒传播等方面已发挥了重要作用。本文简要概述了SARS-CoV-2生物学特征，对全球发展使用的SARS-CoV-2病毒主要检测技术和新兴发展检测技术进行了比较详尽的介绍，并对病毒检测技术进行了展望，以期为临床医疗诊断、公共卫生防护、疾病预防和控制等提供理论和技术帮助。

摘要:新型冠状病毒疫情(COVID-19)是21世纪截至目前人类面对的最为严重的公共卫生事件。疫苗、中和抗体以及小分子化合药物的出现有效预防和阻止了COVID-19的快速传播，而不断出现的病毒突变体却使这些疫苗及药物的效价降低，这对COVID-19的预防及治疗提出了新的挑战。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)通常会先黏附于呼吸道表面的大分子糖链——硫酸乙酰肝素，进而与特异性受体人血管紧张素转化酶2(human angiotensin-converting enzyme 2,hACE2)结合，从而实现对人体的侵入。SARS-CoV-2的刺突(spike,S)蛋白是高度糖基化的，而糖基化对于hACE2与S蛋白的结合也有着重要影响，S蛋白在宿主体内还会被一系列凝集素受体所结合，这意味着糖链在SARS-CoV-2的入侵及感染过程中有着重要的作用。基于SARS-CoV-2的糖基化及糖受体识别机制开发糖链抑制剂可能是预防或治疗新型冠状病毒感染的有效手段，相关研究发现海洋来源的硫酸化多糖、肝素分子及其他的一些糖类具有抗SARS-CoV-2的活性。本文系统阐述了新型冠状病毒的糖基化及其糖链在入侵、感染中的作用，并对抗SARS-CoV-2糖链抑制剂的发现和机制研究现状进行了总结，在此基础上还对糖类抗病毒药物的机遇与挑战进行了展望。

摘要:由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)引起的疾病被命名为新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)，是一种具有强传染性、高易感性、长潜伏期的传染病。病毒刺突蛋白受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)和细胞血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)之间的相互作用使得SARS-CoV-2顺利进入细胞。本文对SARS-CoV-2与ACE2的相关作用机制进行了简单概述，对目前针对SARS-CoV-2中和单克隆抗体、纳米抗体的最新研究进展进行了总结，探讨了新冠肺炎的发展过程和抗体药物的研究方向，以期为包括新冠肺炎在内的新发、突发传染病中和抗体药物的研发提供参考。

摘要:长非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是长度超过200 nt的非编码RNA，具有一个或多个短开放阅读框，可编码功能性微肽。这些功能性微肽在各种生物过程中扮演着重要角色，例如Ca²⁺转运、线粒体代谢、肌细胞融合和细胞衰老等过程。同时，这些生物过程又在机体稳态调控、疾病和癌症的发生与发展、胚胎发育等重要生理过程中起关键作用。因此，研究由lncRNA编码的微肽在生物体的潜在的调控机制，将有助于进一步解析生物体潜在调控过程，并为后续疾病的靶向治疗及动物生长性能的提高提供新的理论依据。本文综述了现阶段lncRNA编码微肽领域的最新研究进展，并对当前微肽在肌肉生理、炎症与免疫、人类常见癌症、胚胎发育等领域的研究进展进行描述与总结，最后简单阐述了lncRNA编码微肽现阶段面临的问题和存在的挑战，以期为后续微肽的深入研究提供科学参考及新思路。

摘要:泛素化是一种存在于真核生物内的蛋白质翻译后修饰，介导了蛋白质的特异性降解与信号转导，参与了诸多生命过程的调控进而影响着机体方方面面的功能。泛素化网络的紊乱和失衡是导致人类严重疾病的重要原因。泛素分子可以形成8种不同拓扑结构的同质泛素链，其丰度和功能差别巨大。目前，丰度较高的K48及K63经典泛素链的修饰底物较多、功能研究相对充分，而其他非典型泛素链的含量低、研究相对较少，但是诸多证据表明非典型泛素链在细胞内发挥着重要的调节功能。K6泛素链是一种重要的非典型泛素链，与K48链相似，具有紧密的空间结构。目前研究发现K6泛素链在DNA损伤修复、线粒体质量控制等过程中发挥重要调节功能，在肿瘤发生、发展以及帕金森疾病的致病过程中有着重要的作用。目前，由于缺乏特异性的K6泛素链抗体和有效的富集手段，导致K6泛素链修饰的底物、调控机制研究相对较少，诸多调控过程和功能有待进一步深入研究。本文系统综述了K6非典型泛素链的结构特征、调控机制以及相关的生物学功能与疾病，为K6泛素链的功能研究提供参考。

摘要:重组胶原蛋白作为天然动物组织胶原的替代物具有广泛应用于生物材料、生物医学等领域的潜力。种类繁多的重组胶原蛋白类型及其衍生体在多种表达系统中可实现一定规模的产业化生产，为探索和拓展重组胶原蛋白的临床应用奠定了基础。文中简述了重组胶原蛋白的不同表达体系，如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物和人类细胞表达体系，重组胶原蛋白的优势及潜在的应用和局限。着重介绍了目前重组胶原蛋白生产，包括不同表达体系的构建策略和重组胶原蛋白羟基化修饰等方面的研究进展，总结了重组胶原蛋白在生物医药领域的应用及应用基础研究和应用前景展望。

摘要:胶体金免疫层析试纸条技术是一种快速、灵敏和精准的固相标记检测技术，胶体金免疫层析试纸条具有价格低廉、操作简便、检测快捷和特异性强的优点，具有在短时间内灵敏、准确地定性检测出相关病毒的潜在能力，有效解决传统检测方法在医学、兽医、动植物病毒检测和农药残留检测等领域存在检测时间长、设备不便和专业性强的弊端。目前在检测领域，该技术在检测细菌性疾病、病毒性疾病和预防传染性疾病大面积扩散等方面都有应用，因此，该技术在检验方面具有巨大的发展空间。文中主要对胶体金免疫层析技术进行综述，并对该技术在生物病毒检测方面进行总结和展望。

摘要:目前，肺体外培养模型有肺类器官和肺芯片两种主要手段。肺类器官是离体的肺上皮干细胞在体外特定的三维培养环境中生长，自发形成具有自我更新能力的干细胞簇并成功分化出功能细胞。肺芯片是利用人工活性膜为细胞提供组织分层结构，模拟微环境和机械力的仿生微流体芯片。由于原有二维培养模式缺乏精确的微结构和功能，组织体外培养模型作为模拟肺部发育、稳态、损伤和再生机制的研究工具，为肺部纤维化、癌症等疾病的探索提供了新的手段和可能。本文就肺成体干细胞两种体外培养模型的分类、研发历史、建立方法、实际应用、优缺点等方面进行综述，期望为器官移植和再生、药物筛选等应用提供参考。

摘要:口腔静态生物膜模型是体外模拟口腔微生态环境的重要手段，因其成本低、通量高、可靠性好、操作容易等优点，已成为研究各种口腔疾病的发病机制，测试各种药物、口腔护理用品、食品的重要工具。建立口腔静态生物膜模型，可根据研究目的，选择不同的装置、接种源、培养基、基质和培养条件，并通过测定生物量、代谢活性、群落结构以及进行可视化分析等多种方法评价生物膜的生长情况。本文汇总了近年来报道的口腔静态生物膜模型建立和评价的方法学要素，并分析讨论了各种方法的适用范围，希望有助于相关领域研究和生产实践的开展。

摘要:白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)是免疫系统的关键调控因子，其在免疫刺激和免疫抑制过程中均发挥重要作用。作为第一个上市的肿瘤免疫疗法药物，IL-2因疗效不足及严重不良反应导致其临床应用受到很大限制。通过对IL-2进行修饰，可延长药物半衰期，提高细胞特异性，使之更加特异地作用于效应T细胞或调节性T细胞，用于肿瘤或自身免疫病的治疗，是目前免疫治疗领域的研发热点之一。其中聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰IL-2分子与PD-1单抗联用，在黑色素瘤治疗上显现出很好的潜力；同时，还有更多用于肿瘤和自身免疫病治疗的IL-2修饰分子也已进入临床研究阶段。相信将有IL-2修饰分子获得监管部门批准，成为人类对抗免疫相关疾病的有力武器。

摘要:细菌常受到数量众多的噬菌体感染，宿主细菌在和噬菌体竞赛中进化出多样化的分子策略，流产感染(abortive infection,Abi)是其中之一。毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TA)会在细菌受到压力胁迫时表达并介导细菌的低代谢甚至休眠，还能直接减少子代噬菌体形成。此外，部分毒素序列和结构与Cas蛋白高度同源，噬菌体甚至会编码抗毒素类似物来阻遏对应毒素的活性。这表明流产感染中细菌死亡过程导致的噬菌体感染失败与TA功能高度重合，TA可能是噬菌体侵染宿主的主要阻力和防御力量之一。文中基于TA系统的分类和功能，对参与噬菌体流产感染的TA系统进行了综述，并预测具有流产功能的TA系统和其在抗生素开发和疾病治疗中的应用前景。这有助于认识细菌-噬菌体相互作用，并指导噬菌体治疗和合成生物学。

摘要:微针经皮免疫借助微针刺破皮肤的角质层，使疫苗高效地被抗原提呈细胞识别后引起特异性免疫应答，从而实现疫苗的经皮免疫。由于微针的经皮免疫所具有的高效诱导免疫应答、低痛感、易储存等优点，近年来被广泛应用于多种疫苗免疫接种。本综述对用于经皮免疫的各类微针(固体微针、空心微针、涂层微针和可溶性微针)的制备材料、在经皮免疫的应用、领域的研究热点与尚需要解决的问题进行探讨，以期为研究者的制备和应用提供参考和借鉴。

摘要:胰腺β细胞生成和分泌的胰岛素对维持人体正常血糖起到关键作用，胰岛素分泌不足或利用缺陷将会导致糖尿病(diabetes mellitus,DM)的发生。经典的DM治疗方法包括药物治疗和胰岛移植，新兴的胰腺β细胞替代疗法可以使患者摆脱对药物的依赖并且可以缓解胰岛移植供体缺乏的难题。通过重编程技术或者定向诱导干细胞分化等方法可以获得胰腺β样细胞，相关功能已经在体外细胞和动物体内水平得以验证。有些医院已开展了β细胞替代疗法的临床试验。体外获取具有功能的胰腺β样细胞有望成为临床DM细胞治疗的可靠来源。文中总结了胰腺β细胞主要获取方式，讨论了现有方法存在的问题，为将来获取和应用功能胰腺β细胞提供了思路。

摘要:为了探讨鸡干扰素γ(chicken interferon-γ,ChIFN-γ)与白介素2(chicken interleukin-2,ChIL-2)对1型辅助性T细胞(type 1 helper T lymphocytes,Th1)分化的影响，本研究原核表达、纯化了ChIFN-γ与ChIL-2，并以不同浓度刺激刀豆球蛋白A (concanavalin A,Con A)活化的鸡外周血淋巴细胞，检测其对Th1细胞分化相关细胞因子表达的影响。结果表明，不同浓度的ChIFN-γ与ChIL-2均可上调Th1细胞分化相关细胞因子的转录水平，最佳刺激浓度分别为12.5μg/mL和25.0 μg/mL。然后将ChIFN-γ和ChIL-2分别与H9N2灭活疫苗联用，以口服或肌肉注射方式免疫无特定病原体(specific pathogen free,SPF)鸡，检测其对Th1细胞分化相关细胞因子表达的影响。结果表明，与单独使用H9N2疫苗相比，ChIFN-γ和ChIL-2均能显著上调H9N2疫苗诱导的Th1细胞分化相关细胞因子的转录水平，且肌肉注射的效果优于口服。本研究通过对Th1细胞分化相关细胞因子进行检测，从体外和体内水平证实了ChIFN-γ与ChIL-2能够增强ConA或H9N2灭活疫苗诱导的Th1细胞分化，为其作为疫苗佐剂使用提供了理论依据。

摘要:锌转运蛋白8(zinc transporter 8,ZnT8)是Ⅰ型糖尿病的重要候选抗原，基于ZnT8所开发的自身抗体检测试剂盒可用于帮助诊断Ⅰ型糖尿病，相关产品已在欧美国家上市。目前，国内正在积极开发Ⅰ型糖尿病检测试剂盒，由于国内尚未建立活性ZnT8的重组生产体系，因此这一关键原料严重依赖进口。本研究主要利用酿酒酵母系统开展了ZnT8的重组表达研究。首先，设计了ZnT8的多种抗原形式，分别为C端单倍体蛋白(C)、C端二倍体(C-C)以及N端和C端串联体蛋白(N-C)，并使用酿酒酵母系统对上述蛋白进行了重组表达与纯化。随后，通过桥连法ELISA对纯化蛋白进行了抗原性测试，检测13位Ⅰ型糖尿病病人血清及16位健康志愿者血清后发现：C、N-C、C-C蛋白具有相似的检出率，分别为53.8%(7/13)、61.5%(8/13)及53.8%(7/13)；3组的特异性均为100%(16/16)；N-C蛋白相对其他2个蛋白而言，其在P3、P4、P8阳性样本上的检测值提高90%以上，表明具有更好的血清抗体识别能力。最后，选取N-C蛋白做进一步的血清样本测试，并将测试结果用ROC曲线进行敏感性及特异性表征，结果表明，与进口金标抗原相比，本方法敏感性无明显差异，特异性有待提高。综上可见，本研究基于酿酒酵母表达生产的ZnT8 N-C串联体蛋白有潜力作为Ⅰ型糖尿病体外诊断试剂开发中的国产替代原料。

摘要:制备含破伤风毒素肽(tetanus toxin,TT)、促吞噬肽(tuftsin)和新型冠状病毒刺突蛋白(spike,S蛋白)受体结合域(receptor-binding domain,RBD)的融合蛋白，探讨分子内佐剂对RBD蛋白体液免疫和细胞免疫效果的影响。将破伤风毒素肽、促吞噬肽与S蛋白RBD区域通过柔性多肽串联，密码子优化后构建重组载体，原核表达纯化制备重组S-TT-tuftsin蛋白，与铝佐剂混合后免疫BALB/c小鼠，对其体液及细胞免疫效果进行评价。重组S-TT-tuftsin蛋白以包涵体形式表达，离子交换层析纯化后采用梯度透析进行复性，复性蛋白经Dot blotting鉴定，可与新冠亚单位疫苗(安徽智飞公司)免疫后人血清发生反应。小鼠免疫实验结果表明，免疫35 d时抗体水平到达平台期，含分子内佐剂重组蛋白(铝佐剂)免疫小鼠后血清ELISA抗体效价高达1︰66 240，显著高于S-RBD蛋白(铝佐剂)免疫小鼠抗体效价(P<0.05)。同时，含分子内佐剂重组蛋白刺激小鼠产生更强的淋巴细胞增殖能力，刺激指数可达4.71±0.15，相较于S-RBD蛋白的刺激指数1.83±0.09具有显著性差异(P<0.000 1)。分子内佐剂破伤风毒素肽和促吞噬肽可显著增强新冠S蛋白RBD域的体液免疫和细胞免疫效果，可为新冠亚单位疫苗和其他病毒亚单位疫苗的研制提供理论基础和参考。

摘要:乳腺癌是女性恶性肿瘤中发病率最高的肿瘤，严重威胁女性生命健康。其中三阴性乳腺癌因其特殊的生理学特点，成为乳腺癌中预后最差的亚型，因此急需寻找新的靶点进行治疗来提高患者预后及生存率。多项研究表明，热休克蛋白gp96在多种癌细胞的膜表面过表达，且胞膜gp96与乳腺癌的恶性程度与不良预后密切相关，因此其可能是乳腺癌治疗的新靶点。前期研究根据gp96的结构，开发一种靶向胞膜gp96 ATP结合区的α螺旋肽p37。虽然p37多肽作用位点专一，但其在体内容易被降解，因此本研究将多肽的N端或C端分别偶联PEG₂₀₀₀或PEG₅₀₀₀，得到4个具有抑瘤功能的PEG多肽：mPEG₂₀₀₀CY、mPEG₅₀₀₀CY、mPEG₂₀₀₀LC和mPEG₅₀₀₀LC。它们可以抑制乳腺癌细胞SK-BR-3的增殖和侵袭，其中抑制效果最明显的是mPEG₂₀₀₀CY。经测定，mPEG₂₀₀₀CY在体内的半衰期较多肽p37明显延长，且有效抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231小鼠移植瘤的生长。这为研发新型抗乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌的靶向药物提供了依据。

摘要:为构建一种非复制型mRNA平台并探究电穿孔介导的mRNA对小鼠健康状况的影响及蛋白的表达情况，以荧光素酶作为靶标基因，用T7 RNA聚合酶体外转录及酶法加帽加尾的策略制备mRNA，用活体基因导入仪通过电穿孔的方式体内递送mRNA，借助小动物活体成像系统观测荧光素酶蛋白在小鼠体内的表达强度和持续时间。结果表明，使用该非复制型mRNA平台得到的mRNA成功在体内外表达，电穿孔介导的mRNA对小鼠健康体征无明显影响，所有的小鼠均成功表达了荧光素酶蛋白，蛋白表达在电穿孔后第1天达到峰值，在第4天迅速下降，但蛋白表达强度和持续时间存在较大的小鼠个体间差异。研究对非复制型mRNA的构建及其应用于疫苗或肿瘤药物研发具有重要参考价值。

摘要:B型流感病毒(influenza B virus,IBV)比A型流感病毒(influenza A virus,IAV)更易引发并发症，在一定季节内造成的疾病负担甚至超过IAV，但目前人们对IBV的关注较少。为了分析IBV临床毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的遗传进化特点，本研究构建了系统进化树，并以世界卫生组织推荐的疫苗株为参考，对其血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)进行了氨基酸序列同源性及突变位点分析。分析结果发现B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018毒株无谱系间重配现象，与同年疫苗株B/Colorado/06/2017匹配性较差。另外，测定了B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018毒株感染小鼠的半数致死量(median lethal dose,LD₅₀)及其对小鼠的致病性。结果表明，B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018毒株感染小鼠的LD₅₀为10^5.9TCID₅₀(median tissue culture infective dose)，小鼠肺脏中病毒滴度在感染后1 d达到高峰，炎性细胞因子的mRNA水平在感染后12 h达到高峰，且感染后肺脏中的肺泡损伤严重，有大量炎性细胞浸润。本研究证明了IBV临床毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018可以感染小鼠并诱发典型的肺脏炎症，为研究IBV致病及传播机制奠定了基础，为评价新型流感疫苗、抗病毒和抗炎症药物提供了理想的动物模型。

摘要:长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是包括细胞增殖在内的许多细胞过程的重要调节因子。虽然已有研究表明多种lncRNA在造血系统恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，但是缺少一个更全面和无偏倚的方法同时研究多个lncRNA中对白血病细胞系产生功能性影响的lncRNA。在此，我们利用短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)文库结合高通量测序的方法，筛选对白血病细胞系增殖有影响的lncRNA，确定了74个候选lncRNAs。从中选取lncRNA C20orf204-203作为验证研究对象，发现C20orf204-203在K562和THP-1细胞系中均定位于胞质，敲降C20orf204-203的K562和THP-1细胞系增殖能力降低，早期凋亡细胞增加，BAD基因在mRNA水平上表达量增加，TP53、BCL2蛋白表达量下降，在THP-1细胞系中Caspase 3蛋白表达量减少，激活型Caspase 3蛋白表达量上升，但是二者变化在两种细胞系中不一致。结果表明，在白血病细胞系中敲降lncRNA C20orf204-203会使细胞增殖能力降低。但其在不同细胞系作用途径和机制可能存在差异。这一研究表明了利用shRNA文库结合高通量测序大规模研究lncRNA在白血病细胞系中发挥作用的可行性。

摘要:人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,hFGF21)已成为改善血糖和脂质代谢的候选药物，但却存在半衰期短和易被体内代谢等缺点，导致靶组织利用率低，限制了其临床应用。本研究通过柔性连接肽(GGGGS)₃将hFGF21的N端连接至人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）的C端，经过毕赤酵母密码子优化后，将重组基因片段rHSA-hFGF21连入pPIC9k和pPICZαA两种载体，并转化到X33、GS115和SMD1168三种不同酵母菌株中。通过加压筛选得到高表达的X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21工程菌株，并优化摇瓶诱导条件如OD值、甲醇浓度和诱导时间进一步提高rHSA-hFGF21的表达效率。培养上清经中空纤维膜切向流技术粗分离、Blue亲和层析和Q离子交换层析纯化获得纯度约98.18%的rHSA-hFGF21蛋白。与hFGF21相比，rHSA-hFGF21具有更好的热稳定性和抗胰蛋白酶降解的能力，其血浆半衰期也延长了约27.6倍；中高浓度条件下rHSA-hFGF21刺激HepG2细胞摄取葡萄糖的能力优于hFGF21；在2型糖尿病动物中rHSA-hFGF21比hFGF21具有更好的长效降糖效果。本研究将为FGF21蛋白的大规模生产奠定基础。

摘要:本研究通过共沉淀法制备了胰岛素(insulin,INS)/Ca₃PO₄复合物和葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOx)/Cu₃(PO₄)₂复合物，得到的矿化胰岛素(mineralized insulin,m-INS)呈现不规则结晶团簇状，矿化葡萄糖氧化酶(m-Gox)呈花球状形貌，直径约1–2 μm。体外模拟释放实验表明，m-INS会随介质pH值降低而释放出INS，pH为4.5时其释放量达到96.68%；酶活力检测实验表明m-GOx的酶活力稳定性高于游离的GOx，在室温放置10 d后仍保持较高活力，而GOx活力小于60%。通过配制葡萄糖溶液模拟正常血糖(5.6 mmol/L)和高血糖(22.2 mmol/L)状态，在葡萄糖溶液中加入m-INS和m-GOx，INS的释放量呈现显著的葡萄糖浓度依赖性，即葡萄糖浓度越高，INS释放量和释放速率越大。最后，将m-INS、m-GOx与透明质酸(hyaluronic acid，HA)溶液混合，制备负载m-INS和m-GOx的HA微针阵列，构建1型糖尿病模型鼠，通过微针给药的方式评估载药HA微针对糖尿病大鼠的血糖控制效果。结果表明：负载m-INS/m-GOx的HA微针能有效递送药物，糖尿病大鼠的平均血糖浓度在1 h内下降到约7 mmol/L，并能维持10 h的正常血糖，使血糖浓度低于给药前水平长达36 h。与仅负载INS的HA微针相比，m-INS微针具有更好的葡萄糖耐受性、更持久的控糖效果和更小的低血糖风险。相对于其他的缓释系统，本研究中的核心成分制备流程简单、效率高和安全有效，具备较大的商业化潜力。

摘要:镉(cadmium,Cd)是环境中常见的一种重金属，Cd²⁺可以通过穿透血脑屏障，产生神经毒性，从而诱发各种神经退行性疾病，雷公藤红素是雷公藤的一种有效成分，具有抗癌、抗炎等一系列药理作用，本文探究雷公藤红素对Cd²⁺诱导的相应神经毒性的影响作用。通过细胞增殖实验、细胞膜完整性实验、细胞形态实验探索了Cd²⁺对小胶质细胞HMC3活力的影响；通过一氧化氮(NO)检测实验、脂质过氧化(malondialdehyde,MDA)检测实验、蛋白免疫印迹实验分析了Cd²⁺的神经毒性以及雷公藤红素对Cd²⁺诱导的相应神经毒性的影响。结果表明：与对照组相比，当Cd²⁺浓度达到40 μmol/L时，对HMC3细胞增殖抑制率为(57.17±8.23)%(P<0.01,n=5)，继续增大Cd²⁺浓度，细胞活性将进一步降低；当Cd²⁺浓度达到40 μmol/L以上时，HMC3的细胞膜明显受到破坏，并且破坏作用与浓度呈剂量依赖性关系；随着Cd²⁺浓度的增加，细胞形态开始变化，贴壁效果变差。Cd²⁺使HMC3细胞释放的NO量显著增加，而雷公藤红素能够有效地抑制Cd²⁺诱导的HMC3细胞NO的释放；Cd²⁺使HMC3细胞脂质过氧化水平显著增加，加入10^–7 mol/L雷公藤红素后，MDA的释放量显著减少；Cd²⁺会使p-PI3K蛋白含量增加，而加入了雷公藤红素(10^–7、10^–6 mol/L)后，p-PI3K蛋白和p-AKT蛋白的激活均被抑制，从而抑制了细胞凋亡。综上所述，雷公藤红素能够抑制Cd²⁺诱导的小胶质细胞毒性，从而起到神经保护作用。

摘要:中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是生产复杂重组药物蛋白的首选宿主细胞，腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase,APRT)催化腺嘌呤与磷酸核糖缩合形成腺苷一磷酸，是嘌呤生物合成步骤中的关键酶。采用基因编辑技术敲除CHO细胞中aprt基因，验证获得的APRT缺陷型CHO细胞系的生物学特性；构建两种真核表达载体：对照载体(含有目的基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和弱化载体(含有启动子和起始密码子突变的aprt弱化表达盒及EGFP)，分别转染APRT缺陷型和野生型CHO细胞并筛选获得稳定转染的细胞池；重组CHO细胞传代培养60代并用流式细胞术检测EGFP表达的平均荧光强度，并比较不同实验组重组蛋白EGFP的表达稳定性。PCR扩增和测序结果表明，CHO细胞aprt基因成功敲除；获得的APRT缺陷型CHO细胞系在细胞形态、生长增殖、倍增时间等生物学特性方面与野生CHO细胞无显著差异。目的蛋白瞬时表达结果表明，与野生型CHO细胞相比，转染对照载体和弱化载体的APRT缺陷型CHO细胞系中EGFP的表达分别提高了42%±6%和56%±9%；特别是长期传代培养时，转染弱化载体的APRT缺陷型细胞中EGFP表达量显著高于野生型CHO细胞(P<0.05)；构建的基于APRT缺陷型CHO细胞系能够明显提高重组蛋白的长期表达稳定性。研究结果为建立高效稳定的CHO细胞表达系统提供了一种有效的细胞工程策略。

摘要:来源于大肠杆菌的4-羟基苯乙酸酯3-羟化酶(4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase,4HPA3H)可以催化对香豆酸生物合成咖啡酸。为了实现4HPA3H的扩大生产和咖啡酸的高效生物合成，首先构建过表达4HPA3H的大肠杆菌工程菌，其次使用5 L发酵罐进行高密度发酵生产4HPA3H，再而优化采用工程菌株进行全细胞催化产咖啡酸的条件。最终实现了在5 L发酵罐中发酵，工程菌株生物量达到干重34.80 g/L。通过使用5 L发酵罐作为生物反应器进行全细胞催化，经过6 h的催化可产生18.74 g/L (0.85 g/(L·OD₆₀₀))咖啡酸，摩尔转化率为78.81%，是目前文献报道4HPA3H以对香豆酸为底物合成咖啡酸的最高水平。初步实现了高密度培养大肠杆菌表达4HPA3H并高效生物合成咖啡酸，为工业化生产奠定了基础。

摘要:在临床应用上，一种能够持续递送药物的微针(microneedle,MN)系统对于一些疫苗、激素类药物的递送具有重要价值。本文研究设计了一种基于壳聚糖的可控缓释型微针阵列(PVA/CS-MN)，将微针贴片与药物相结合用于药物的可控长效缓释。重点研究了PVA/CS-MN的制备优化工艺，并对MN阵列外观形貌、力学性能、溶解与溶胀性能以及体外刺入性能进行了表征。实验结果表明，使用最优工艺制备的PVA/CS-MN具有良好的形貌以及力学性能，可以顺利在皮肤上打开微通道，并实现可控的溶解与溶胀功能。同时，体外透皮扩散实验表明，以抗坏血酸(l-ascorbic acid)为模型药物制备的Vc-PVA/CS-MN在1 h内即释放了约57%的药物，随后12 h内缓慢释放了约66.7%的药物，7 d后最终释放了92%的药物。PVA/CS-MN具备可控的缓释特性以及优良的药物递送效率，为药物的持续透皮递送提供了一个新选择。

摘要:真核翻译起始因子4B (eukaryotic translation initiation factor 4B,eIF4B)在mRNA翻译起始、细胞存活和增殖过程中发挥着关键作用，然而其在生物体内的生物学功能仍存在许多疑问。本研究利用eIF4B基因敲除小鼠模型，结合苏木精和伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、流式细胞术、Western blotting和免疫组化等一系列实验技术手段，探究了eIF4B在胚胎发育过程中的功能及作用机理。结果显示，eIF4B敲除小鼠胚胎的肝脏呈现严重病理损伤，主要表现为胚肝细胞的凋亡和坏死，而小鼠胚胎的肺脏、脑、胃和胰腺则发育正常。进一步研究发现，在eIF4B敲除小鼠的胚胎肝脏中活化型caspase 3(cleaved-caspase 3)的表达水平显著升高。此外，eIF4B敲除小鼠的胚胎成纤维细胞和胚胎肝脏中mTOR通路下游信号分子p70S6K的表达和磷酸化水平以及4EBP1的磷酸化水平显著升高。综上所述，eIF4B敲除导致cleaved-caspase 3表达增加和mTOR信号通路过度活化，促进胚肝细胞的凋亡，致使小鼠胚肝发育异常，最终引发小鼠胚胎死亡。本研究揭示了eIF4B在胚胎发育过程中的重要作用，为深入了解eIF4B在生物体内的生物学功能提供了新的科学依据。

摘要:Lnc-HUR1是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)上调的长链非编码RNA，具有促进肝癌细胞增殖和促进肝癌发生发展的功能。为探究lnc-HUR1对肝癌细胞凋亡的影响，通过免疫印迹、实时荧光定量PCR、双荧光素酶报告基因、免疫共沉淀、流式细胞术等实验方法，检测lnc-HUR1对肝癌细胞凋亡的影响。转化生长因子-β(tansforming growth factor-β,TGF-β)、五氟尿嘧啶和星孢菌素诱导肝癌细胞凋亡的实验结果显示，过表达lnc-HUR1能够显著降低caspase3/7的活性以及PARP-1的剪切，而敲低lnc-HUR1则能够显著增加caspase3/7的活性，促进PARP-1的剪切；Annexin-Ⅴ和PI联合染色实验也表明过表达lnc-HUR1能够抑制细胞凋亡，敲低lnc-HUR1能够促进细胞的凋亡。同时过表达lnc-HUR1能够在RNA水平和蛋白水平上调凋亡抑制因子Bcl-2(B cell lymphoma-2)、下调促凋亡因子BAX (B cell lymphoma-2-associated x)，从而抑制细胞的凋亡。在CCL4诱导的小鼠急性肝损伤模型中，lnc-HUR1转基因小鼠肝组织中Bcl-2的表达高于对照小鼠。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验也证实lnc-HUR1能够降低p53在Bcl-2和BAX启动子区的富集。以上结果说明，lnc-HUR1通过促进凋亡抑制因子Bcl-2及抑制凋亡促进因子BAX的表达抑制肝癌细胞的凋亡。进一步的实验表明，在HCT116细胞中lnc-HUR1能够调控Bcl-2和BAX的转录，而在HCT116 p53^−/−细胞中，lnc-HUR1对Bcl-2和BAX的表达没有影响，说明lnc-HUR1对肝癌细胞凋亡的抑制作用依赖于p53的活性。综上所述，HBV上调的lnc-HUR1具有抑制肝癌细胞凋亡的作用，lnc-HUR1通过抑制p53转录活性，上调凋亡抑制因子Bcl-2、抑制凋亡促进因子BAX的转录，从而抑制细胞凋亡。上述结果提示Lnc-HUR1在HBV相关肝癌发生发展中发挥重要作用。

摘要:融合了跨膜肽的抗氧化酶可进入细胞，保护细胞免受放射损伤。然而跨膜肽的跨膜能力没有靶向性，其也可把抗氧化酶带入肿瘤细胞进而保护肿瘤细胞，降低放疗的效果。为此，根据多数肿瘤细胞微环境中存在活性基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2或MMP-9的特点，在细胞跨膜肽R9与人铜、锌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1,SOD1)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)之间融合MMP-2/9的底物肽X，设计了融合蛋白GST-SOD1-X-R9。该蛋白在肿瘤微环境中可因MMP-2/9酶切底物肽X而失去跨膜肽，从而无法进入肿瘤细胞，进而只能进入正常细胞。全基因合成SOD1-X-R9序列，并将其插入原核表达载体pGEX-4T-1中，得到表达质粒，并实现了GST-SOD1-X-R9融合蛋白的可溶表达。GST-SOD1-X-R9经硫酸铵沉淀和GST亲和层析纯化，分子量约为47 kDa，与理论值一致。纯化的融合蛋白的SOD活性和GST活性分别为2 954 U/mg和328 U/mg。GST-SOD1-X-R9的SOD活性或GST活性在生理条件下几乎没有变化。该融合蛋白在溶液中可被胶原酶Ⅳ部分水解。分别建立了2D和3D培养的HepG2细胞模型来检验肿瘤微环境中的MMP-2活力对该蛋白跨膜能力的影响。在2D培养模型中，HepG2的MMP-2活力极低，但在3D培养模型中，随着培养时间的增加，HepG2肿瘤球的体积变大，其胞外MMP-2活力也随之增强。GST-SOD1-X-R9在2D培养的HepG2细胞中具有和GST-SOD1-R9蛋白一样的跨膜效率，但在3D培养的HepG2细胞球中的跨膜能力大大降低。本研究为后续深入研究GST-SOD1-X-R9靶向防护正常细胞的氧化损伤效应奠定了基础。

摘要:为筛选和验证条纹斑竹鲨肝脏中环形RNA (circRNA)及探究其在肝癌细胞HepG2中过表达对肝癌细胞增殖、迁移能力的影响，本研究主要进行了两项实验：对条纹斑竹鲨肝脏circRNA进行高通量测序和预测，随后设计正、反向引物验证其真实性；构建circRNA过表达载体，将其瞬时转染进肝癌细胞HepG2，进行CCK-8和划痕实验来评价其对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响。结果显示：预测到有4 558条circRNAs，并确认了14条circRNAs的真实性；qRT-PCR实验表明在肝癌细胞HepG2中能瞬时过表达circRNA 13-566、circRNA 4-475、circRNA 5-402、circRNA 294-177、circRNA 30-219；且CCK-8和划痕实验显示，这5条circRNAs过表达后，均能不同程度地抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力，其中circRNA 4-475、circRNA 294-177作用尤为显著。上述结果为深入研究条纹斑竹鲨肝脏中circRNA及其在肝再生、肝癌治疗方面的功能提供了新思路和基础。

摘要:肠道微生物群落结构和多样性与人体疾病密切相关。然而，相关群落结构分析结果可能受到DNA提取质量等实验因素影响。因此，评估不同DNA提取方法对肠道特定种属的提取效果，对于全面、准确获取人体肠道微生物谱，深入探究肠道微生物群落结构具有指导意义。本研究旨在借助实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction,RT qPCR)技术，以DNA提取纯度、浓度，以及对肠道中特定种属微生物基因组DNA的提取丰度为指标，对5种DNA提取方法进行比较分析。结果表明，试剂盒Q的提取效果最佳，特别是对乳杆菌属和双歧杆菌属等革兰氏阳性菌的提取效果较好。N试剂盒的平均DNA提取浓度较Q试剂盒低，但在纯度方面，二者无显著性差异。与其他3种商用试剂盒(M、PSP、TG)相比，N方法对肠道内指定微生物基因组的提取效果仅次于Q试剂盒，位居第二。相比之下，M试剂盒提取所得DNA，质量较高，但浓度偏低，对于肠道内革兰氏阳性菌的提取效果不很理想。TG试剂盒和PSP试剂盒提取所得DNA在浓度、质量以及细菌丰度方面均不及其他验证的试剂盒。综上，Q试剂盒可作为肠道微生态研究相关实验中获取高质量基因组DNA的提取方法。本研究结果为肠道微生态研究相关实验中基因组DNA提取方法的选择提供参考依据。

摘要:本研究旨在构建能够表达人表皮生长因子EGFRvIII胞外区基因的重组腺病毒，并通过免疫骆驼构建噬菌体单域抗体库，筛选和制备EGFRvIII胞外区特异性单域抗体并对其进行鉴定。从人前列腺癌细胞系PC-3细胞中提取总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板扩增EGFRvIII胞外区基因，并连接pAdTrack-CMV质粒载体，转化含有pAdEasy-1的大肠杆菌(Escherichia coli) BJ5183感受态细胞，获得同源重组质粒转染HEK293A细胞，得到表达EGFRvIII胞外区蛋白的重组腺病毒。利用重组腺病毒免疫双峰驼，构建EGFRvIII胞外区特异性噬菌体单域抗体库，并以EGFRvIII蛋白为筛选抗原，对其进行筛选，对筛选得到的单域抗体进行诱导表达、纯化及鉴定。结果表明获得了表达EGFRvIII胞外区基因的重组腺病毒。构建得到的EGFRvIII特异性噬菌体单域抗体库的库容为1.4×10⁹；经过3轮富集和筛选，通过噬菌体ELISA筛选出31个与EGFRvIII胞外区蛋白结合的阳性克隆，并对OD₄₅₀值较高的重组单域抗体E14进行了表达和纯化。经ELISA鉴定，重组单域抗体E14可与EGFRvIII胞外区蛋白产生抗原抗体结合反应，具有较高的亲和力。说明制备的EGFRvIII特异性噬菌体单域抗体库具有较高的库容和多样性，且筛选得到的单域抗体具有较高的抗原活性和免疫学反应性，为今后以EGFRvIII为靶点的恶性肿瘤的诊断和治疗提供新的实验依据。