摘要:

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摘要:三阴性乳腺癌是乳腺癌中恶性程度最高的亚型，其治疗仍以化疗为主，但容易出现耐药，且患者预后较差。随着蛋白质组学技术的发展，磷酸化蛋白质组学研究取得了长足的进步，并在肿瘤发生发展机制和诊治研究中得到了广泛的应用。同样，磷酸化蛋白质组学在三阴性乳腺癌的发生发展、靶向治疗和耐药机制研究等方面也发挥着重要作用。本文主要对目前磷酸化蛋白质组学在三阴性乳腺癌中的研究进展进行综述，旨在为基于磷酸化蛋白质组学的三阴性乳腺癌发生发展机制和诊治研究提供指导和帮助。

摘要:炎性小体是先天性免疫系统的受体和传感器，在许多疾病的发生和进展中起着关键的病理作用。近期研究表明，NOD样受体家族核苷酸结合寡聚化结构域样受体3 (NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)炎性小体参与了对公共健康具有高度影响的疾病的发生，如肌肉骨骼系统疾病。肌肉骨骼系统疾病是主要由工作和周围环境引起或加重的肌肉、关节、骨骼等运动系统疾病，以及相关神经、循环系统损伤的疾病。NLRP3小体的激活可以诱导炎症及引发焦亡，造成机体进一步损伤。因此，以NLRP3炎性小体为切入点，开展对肌肉骨骼系统疾病的预防和治疗具有重要意义。研究炎症性疾病中NLRP3炎性小体活动的机制及作用已然成为新的研究方向。本文对NLRP3炎性小体的激活途径及机制进行了概述，并分析了NLRP3炎性小体在肌少症、骨质疏松症和关节炎等肌肉骨骼系统疾病中的作用，以期为肌肉骨骼系统疾病的治疗提供理论依据。

摘要:纳米抗体(nanobody, Nb)是在骆驼科血清中发现的一种新型抗体，具有体积小、特异性强、稳定性高、易于表达和能识别隐藏的抗原表位等优势，在各个领域具有广泛的应用价值。本文介绍了纳米抗体筛选与优化过程，包括纳米抗体文库构建、体外展示和亲和力成熟3个重要技术阶段的分类与特点。其中，简要描述了天然、免疫及半合成/合成文库的制备方法与重要参数，并系统介绍了应用噬菌体、酵母、细菌、核糖体/mRNA和真核细胞等表面展示系统，以及酵母双杂交、高通量测序和质谱鉴定方法，共8种不同体外展示技术进行快速筛选的方法及其优缺点，汇总用于提升纳米抗体功能可靠性的体外及计算机辅助亲和力成熟技术平台，为综合运用各种技术手段快速获得稳定、可靠、特异的纳米抗体类药物或诊断制剂提供了参考。

摘要:CRISPR传感检测技术具有便宜、简单、便携、高灵敏和高特异等优点，被称为“下一代分子诊断技术”。由于CRISPR-Cas系统具有特异的识别、顺式切割和非特异性的反式切割能力，已经实现了对DNA和RNA等核酸靶标以及蛋白质、外泌体、细胞和小分子等非核酸靶标的检测。为了解不同CRISPR传感检测技术的优势和发展历程，促进该技术的发展和应用，本文根据不同Cas蛋白的活性特征，对目前的CRISPR传感检测技术进行了分类总结，并在此基础上根据检测的靶标类型，依次总结了各种CRISPR传感检测技术的应用情况，以期为开发新型CRISPR传感检测技术提供参考。

摘要:生物活性材料是一类经由材料表面或界面产生特殊生物或化学反应，从而影响组织和材料间的结合、诱发细胞活性或引导组织再生的生物材料。近年来，生物活性材料已广泛应用于牙周组织再生。本文对不同类型生物活性材料的特点及其在牙周组织再生中的作用进行综述，为推动其在牙周组织再生领域中的应用提供参考。

摘要:肿瘤是威胁人类健康和社会发展最为严重的疾病之一，也是全球第二大常见疾病死因。最新统计数据显示，恶性肿瘤在发达国家已取代心血管疾病成为第一大疾病死因。肿瘤的耐药、转移和复发，仍然是临床治疗中亟需解决的难题。肿瘤干细胞(tumor stem cells, TSCs)是一类具有自我更新、分化潜能、高致瘤性和高耐药性等特征的细胞亚群，能够抵抗放化疗等非特异性治疗手段，在肿瘤发生、转移、耐药和复发中发挥关键作用。肿瘤干细胞标志物、干性维持机制、微环境和代谢重编程等领域已成为了研究热点，最新研究成果为肿瘤干细胞的鉴定和靶向治疗提供了新的靶标和策略。本文对肿瘤干细胞的表面标志物(CD133和CD44等)、自我更新和上皮细胞间充质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)信号通路(Wnt/β-catenin和Hedgehog等)、微环境特征、代谢重编程(糖酵解和氧化磷酸化等)，及其在肿瘤的起始、发展、转移和耐药中的作用进行了综述。

摘要:冠状病毒能够引发多种传染性疾病，给动物和人类的健康带来严重危害。研发有效的疫苗和抗病毒药物成为防治疾病的重要手段。冠状病毒基因组能够编码多种蛋白质，包括结构蛋白、非结构蛋白和辅助蛋白。解旋酶非结构蛋白13 (nonstructural protein 13, NSP13)是冠状病毒编码的一种关键非结构蛋白，能够调控病毒复制和宿主先天免疫反应。因此，NSP13被认为是研发抗冠状病毒药物的重要靶点。本文结合国内外现有NSP13相关研究成果，对冠状病毒解旋酶NSP13的来源与结构、序列保守性、解旋机制、酶抑制剂、蛋白互作以及免疫调控等方面进行综述，并且分析了NSP13研究目前面临的问题，为研发靶向NSP13的广谱抗冠状病毒药物提供了理论依据。

摘要:蛋白质是构成生命体的基础，其在体内有多种存在形式，而这些形式之间如何维持动态平衡对细胞发挥正常功能来说至关重要。诸多因素会影响蛋白质稳态，包括一些内外源性的刺激、翻译过程中出现的问题以及一些调控因子的作用等。当错误折叠的蛋白在细胞中不断积累时，会导致蛋白质稳态失衡并无法发挥正常功能进而引发相关疾病。同时在错误发生后，机体的许多“监控”就会感知这些异常，并通过多种途径来帮助蛋白质维持稳态。本文旨在综述蛋白质动态平衡网络之间错综复杂的关系，以及各种因素在其中发挥的主要作用，并为一些由蛋白合成异常导致疾病的研究等提供新的思路。

摘要:近年来，微针作为一种新兴的经皮给药技术，具有微创、无痛、使用方便和高效的特点，逐渐成为一种极具研究价值和应用潜力的给药策略。微针技术在过去20年中得到迅速发展并呈现出多样化的趋势，已可根据不同需求来定制微针的形状、组成、机械性能和其他特殊功能等。由于微针能以微创方式穿越各种生物屏障，因此许多研究人员探索了微针在除皮肤外各类组织和器官中的药物递送应用。本文综述了微针技术及其近年来在眼睛、血管、心脏等组织和器官的药物递送中的应用研究，以期推动微针技术的应用发展。

摘要:实体瘤缺乏明确的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell, CAR-T)治疗靶点。因此，通过慢病毒将已经明确的靶点分子CD19带入实体瘤细胞系，研究CD19 CAR-T细胞对其的杀伤，能够为CAR-T细胞针对实体瘤的治疗提供潜在的支撑。本研究利用三质粒慢病毒系统构建了稳定表达CD19、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, FLUC)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的结肠癌CT26细胞系CT26-CD19-FLUC-GFP。该细胞系与CT26细胞系的生长活性一致。通过流式细胞术检测不同代次CT26-CD19-FLUC-GFP细胞，证实了CT26-CD19-FLUC-GFP细胞连续传代至第5、10、22代后CD19及GFP的稳定表达。进一步证实，连续传代至第22代的CT26-CD19-FLUC-GFP细胞中的CD19 mRNA及FLUC表达水平显著高于对照组CT26细胞。与T细胞相比，CD19 CAR-T细胞能够显著杀伤CT26-CD19-FLUC-GFP细胞及MC38-CD19细胞。CT26-CD19-FLUC-GFP细胞腹腔植入小鼠体内1周后，通过活体成像仪可以检测到腹腔区域的FLUC表达。上述结果表明，成功构建了稳定表达CD19-FLUC-GFP的CT26细胞系，且该细胞系能够被CD19 CAR-T细胞特异性杀伤。

摘要:腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是基因治疗领域最常使用的病毒载体之一，产量低、成本高是该产业面临的关键瓶颈问题。本研究旨在基于多基因缺失型杆状病毒，建立双病毒感染昆虫细胞以生产AAV的技术体系。首先，进行AAV生产用多基因缺失型重组杆状病毒的构建和扩增，并检测杆状病毒滴度及其感染细胞的效果；然后，使用双杆状病毒共感染昆虫细胞，并优化感染条件；最后，基于优化条件进行AAV生产，并检测评估产量、质量等相关指标。结果表明，AAV生产用多基因缺失型杆状病毒滴度较野生型无差异，感染后细胞存活率下降明显减缓。使用双病毒路线进行AAV优化生产，Bac4.0-1的基因组滴度为1.63×10¹¹ VG/mL，Bac5.0-2的基因组滴度为1.02×10¹¹ VG/mL，较野生型产量分别提升了240%和110%。电镜下，3组均具有正常的AAV病毒形态，且转导活性相近。本研究建立了基于多基因缺失型杆状病毒感染昆虫细胞的AAV生产体系，显著提高了AAV产量，具有一定的应用价值。

摘要:人博卡病毒1 (human bocaparvovirus 1, HBoV1)为感染人并引起疾病的两种细小病毒之一。其感染2−5岁婴幼儿，能引起轻度或重度急性呼吸道疾病，严重时可危及生命。HBoV1基因组末端含末端反向重复序列(repeat the sequence in reverse, ITR)，为病毒基因组复制所必需，但是难以进行PCR扩增合成。本研究通过分步合成末端ITR及分子克隆方法成功构建HBoV1的全长感染性克隆pSKHBoV1。经转染HEK293细胞后，分别从重要非结构蛋白的表达、病毒RNA转录后修饰与加工、病毒基因组复制水平以及子代病毒粒子基因组鉴定等方面，证实构建的感染性克隆在转染HEK293细胞后能够进入正常的复制周期并具有拯救出病毒粒子的潜力，这为后续研究HBoV1的复制增殖、病毒与宿主互作关系以及病毒疫苗的研发奠定了基础。

摘要:传统的新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)多肽底物具有制备成本高、稳定性差和合成工艺复杂等缺点，积极开发廉价稳定的新型底物具有重要意义。本研究基于二聚化红色荧光蛋白(dimerization-dependent red fluorescent protein, ddRFP)原理，以AVLQS为连接肽，利用基因工程技术制备Mpro特异性荧光底物ddRFP-M，用于Mpro抑制剂的药理活性评价。将连接肽基因插入到密码子优化的RFP-A₁与RFP-B₁基因之间，构建ddRFP-M基因，再将其克隆到pET-28a载体中构建重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，以卡那霉素抗性法筛选重组子。重组子经低温诱导后，在大肠杆菌中进行荧光底物ddRFP-M的可溶表达，并以HisTrap^TM层析柱进行分离纯化。以荧光动力学检测法和电泳法测定ddRFP-M的底物特异性，并利用荧光底物ddRFP-M评价恩赛特韦和黄芩素的药理活性。结果显示，荧光底物ddRFP-M在大肠杆菌中呈可溶表达并成功进行了分离纯化，其具有良好的底物特异性、灵敏性和可靠性。新冠病毒Mpro特异性荧光底物ddRFP-M的制备，为新冠病毒Mpro抑制剂的药理活性评价奠定了基础。

摘要:自1986年OKT3作为第一个治疗性单克隆抗体获批上市后，抗体技术及抗体药物迅猛发展。单克隆抗体、抗体片段、双(多)特异性抗体、融合蛋白、纳米抗体以及抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs)等推陈出新，在肿瘤、血液、免疫、呼吸和代谢等相关疾病的治疗领域发挥着举足轻重的作用。抗体药物的发现过程，是通过多轮生物学功能评估和可成药性评估，筛选出具有安全、有效、稳定和可工艺放大的最佳候选序列，从而提高药物开发和临床研究的效率及成功率。抗体药物发现阶段的“成药性筛选与评估”已日益受到关注和重视，从药物发现和设计、先导分子筛选到候选分子确认，可及时发现分子潜在的物理化学风险因素，并评估可控性，保证后续药物开发过程中的质量稳定性。本文对抗体发现阶段的成药性筛选评估流程进行了分类和定义，涉及单克隆抗体、双特异性抗体、纳米抗体和ADCs等相关技术和药物形式，同时总结了成药性筛选评估中应重点关注的质量属性和高通量检测技术；系统性地阐述成药性开发流程和策略，为不断涌现的创新型药物的成药性筛选评估提供参考，大幅提高抗体药物开发的效率和成功率。

摘要:α-1抗胰蛋白酶Z型突变体蛋白(α-1 antitrypsin Z-mutant protein, ATZ)是引发α-1抗胰蛋白酶缺陷症(α-1 antitrypsin deficiency, AATD)的主要原因，研究ATZ蛋白的泛素化修饰和降解对于治疗AATD具有重要意义。STUB1是一种重要的E3泛素连接酶，参与调节多种蛋白质的泛素化修饰。然而，STUB1是否参与ATZ的泛素化修饰尚未明确。本研究首先将ATZ和STUB1的编码基因克隆到pET28a质粒，构建了这2个蛋白的表达质粒。随后，将重组质粒转入大肠杆菌表达系统，在优化诱导条件实现了重组蛋白的异源表达。通过金属螯合亲和层析技术纯化得到目的蛋白，并通过蛋白质谱分析验证了其氨基酸序列的准确性。利用纯化的ATZ和STUB1重组蛋白，构建了一个体外泛素化修饰反应体系。实验结果显示，在ATP、E1泛素激活酶和E2泛素结合酶的协同作用下，STUB1成功催化了ATZ的泛素化修饰。本研究提供了一种体外获得Z型突变体ATZ纯化蛋白的方法，并确认了STUB1介导ATZ的泛素化修饰功能，推进了对α-1抗胰蛋白酶Z型突变体蛋白在细胞内降解过程的调控机制的理解。

摘要:胶质母细胞瘤属于浸润性的恶性肿瘤，目前其化疗新药物的寻找和治疗仍待突破。桑根酮C (Sanggenon C, SC)来源于桑白皮，在多种癌症中发挥着抗肿瘤功效。本研究利用显微镜拍摄、transwell实验和免疫荧光实验验证了SC对胶质母细胞瘤的迁移侵袭能力的影响；基因富集、实时荧光定量PCR (real-time qPCR)以及泛素化实验用于阐明SC抑制胶质母细胞瘤迁移侵袭能力的分子机制。显微镜拍摄结果显示，对胶质母细胞瘤进行加药处理后细胞形态明显回缩，细胞迁移侵袭能力被削弱；Transwell实验和免疫荧光实验也验证了SC能抑制胶质母细胞瘤迁移侵袭能力的猜测；基因富集实验结果表明SC可能调控迁移侵袭相关基因的表达，并且影响Wnt/β-catenin信号通路的活性；Western blotting揭示了SC可调控β-catenin的泛素化水平，并且抑制β-catenin及其下游蛋白的表达；Real-time qPCR实验结果在转录水平上佐证Western blotting的结果。SC通过调控β-catenin的泛素化水平抑制胶质母细胞瘤的迁移侵袭能力，为胶质母细胞瘤的治疗提供了新的思路。

摘要:本研究旨在探究草珊瑚叶和根中萜类化合物的组织特异性分布差异，解析其药效品质差异形成的分子机制。采用液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)和Illumina HiSeq^TM高通量测序技术获得草珊瑚[Sarcandra glabra (thunb) naka]叶和根的代谢组学和转录组学数据。代谢组学结果表明参与叶和根中萜类合成的差异代谢物有50个，包括法尼西基半胱氨酸、甘油醛-3-磷酸、甲羟戊酸-5-磷酸等。转录学结果表明差异代谢酶基因有57条，包括ACTC、HMGCR、MVK、DXS与KS等，并预测了MYB、C2H2、AP2/ERF-ERF等7个转录因子参与调控草珊瑚不同组织部位中萜类的合成和积累差异。实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)结果显示，随机选取的8个参与萜类合成的酶基因在草珊瑚不同组织部位中的表达趋势与转录组学测序结果一致。本研究有助于阐明草珊瑚叶和根临床疗效差异形成的分子机制，同时为草珊瑚的资源开发利用奠定基础。

摘要:光动力疗法与给药微针(microneedle, MN)相结合为治疗肿瘤提供了一种安全有效的途径。本文设计了一种基于壳聚糖搭载高能光子的可控缓释型载药微针贴片(LED-losartan-HEMA/ CS-MN, LLH-CSMN)，重点研究了其制备工艺，并且以氯沙坦为模型药物对微针阵列的形貌尺寸进行了表征，探究了LLH-CSMN的力学性能、皮肤穿刺性能、缓释性能以及高能光子在长时间工作下的光热性能。结果表明，基于壳聚糖搭载高能光子的微针贴片能够有效地在皮肤表面打开通道进行药物递送，并进行光动力治疗。同时，体外透皮扩散试验表明，以氯沙坦为模型药物制备的微针在1 h内释放了约30%的药物，在1 d内总共释放了约60%的药物，随后进行缓慢释放，在6 d后最终释放了93%的药物，LLH-CSMN具有可控缓释特性以及良好的长效光辅助治疗效果，为肿瘤治疗提供了一个新的安全有效途径。

摘要:信号肽(signal peptide, SP)参与调节嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)结构的分泌水平及跨膜易位过程，对嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)行使功能至关重要，本研究通过定点突变技术优化SP序列，并研究其对CD19-CAR-T杀伤功能的影响。首先，利用基因合成和分子克隆技术，构建含野生型SP (SP-wtY)、2种突变型SP (SP-muK或SP-muR)的靶向CD19的CAR载体；对构建成功的载体进行慢病毒包装，并使用慢病毒侵染T细胞，利用流式细胞术检测细胞的转染效率，钙黄绿素释放法检测对靶细胞的体外杀瘤能力，酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)技术检测2种细胞因子[干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)和干扰素-α (interferon-α, TNF-α)]的分泌水平。结果显示，构建了野生型和信号肽突变的重组慢病毒质粒，慢病毒转导T细胞后，携带3种信号肽(SP-wtY、SP-muK或SP-muR)的CD19-CAR转染效率分别为33.9%、35.5%、36.8%。进一步杀伤实验显示，与SP-muK和SP-wtY细胞相比，SP-muR细胞的肿瘤杀伤效果显著提高，当效靶比为10:1时共培养24 h后，SP-muR组CAR-T细胞的细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌水平显著高于SP-muK和SP-wtY组。本研究揭示信号肽N端正电荷数的增加可以提高CAR的表达效率和对CD19⁺靶细胞的杀伤作用，为CAR结构的优化改造和临床高效应用提供了科学依据。

摘要:本研究旨在检测BALB/c小鼠肿瘤注射部位溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒(oncolytic herpes simplex virus type 2, oHSV2)的持续时间和复制水平。同时检测血清中人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte macrophage colony-stimulating factor, hGM-CSF)的表达量和HSV-2抗体水平。小鼠经瘤内注射高、低两个剂量oHSV2-Fluc[萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)]，检测其荧光表达变化及持续时间。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)检测肿瘤组织中oHSV2基因拷贝数。酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清中hGM-CSF表达量以及HSV-2抗体水平。结果表明高剂量组肿瘤体积显著小于对照组(P<0.01)。瘤内注射oHSV2-Fluc表明病毒携带的Fluc可以在肿瘤中持续表达，于第11天仍能检测到荧光，直至第18天低于检测线。通过提取肿瘤组织RNA进行qPCR，表明第9天高、低剂量组肿瘤组织均存在oHSV2的mRNA。对血清进行ELISA检测，相较于对照组，高、低剂量组hGM-CSF及HSV2抗体水平显著提高(P<0.05)。这些发现表明，oHSV2能够在瘤内正常复制，同时所携带的外源因子可持续表达，对肿瘤产生杀伤作用。瘤内注射oHSV2后，小鼠血清中存在较高水平的hGM-CSF和HSV-2抗体。