摘要:

摘要:蛋白质是机体进行生命活动的主要承担者，研究蛋白质的亚细胞定位及蛋白质之间的相互作用对了解蛋白质功能、阐述机体内分子机制至关重要。邻近标记技术是最新发展的能够在活细胞中检测蛋白质相互作用的有效方法之一。相较于传统研究蛋白质相互作用的方法，邻近标记技术具有灵敏度高、特异性强和背景低等优势，被广泛应用于病原与宿主间蛋白质的相互作用研究中。本文对近些年生物素连接酶BirA及其突变体的发展和应用进行了综述，阐述了几种经典生物素连接酶的作用原理，以期进一步明确基于BirA及其突变体的邻近标记技术在病原-宿主间蛋白质相互作用鉴定中的重要作用。

摘要:淋巴细胞的葡萄糖摄取依赖于葡萄糖转运蛋白家族(glucose transporters, GLUTs)中的易化性葡萄糖转运蛋白(GLUT1、GLUT3、GLUT4、GLUT6)和Na⁺偶联葡萄糖转运蛋白家族(Na⁺-coupled glucose transporters, SGLTs)中的SGLT1。GLUTs和SGLTs在哺乳动物细胞中广泛表达，其表达和功能可能会影响细胞的发育、稳态及激活和分化。本文详细介绍了几种GLUTs和SGLTs在淋巴细胞中的重要功能，指出葡萄糖转运蛋白在淋巴细胞能量供应中扮演的关键角色，以及在维持细胞内葡萄糖稳态的机制、改善免疫应答的效率和信号转导中的关键作用。深入揭示葡萄糖转运蛋白对淋巴细胞功能的影响将有助于进一步了解淋巴细胞在疾病中的作用机制。本文从分子生物学角度出发，展望葡萄糖转运蛋白在淋巴细胞中的潜在应用价值，以期为淋巴细胞相关疾病的临床治疗提供更好的策略，帮助针对性靶向治疗药物的研发。

摘要:D-阿洛糖(D-allose)是一种稀有糖，具有抗氧化、抗炎、抗癌、免疫抑制等多种生理学功能，成为近年来的研究热点。本文对D-阿洛糖的理化性质、合成方法、体内代谢和其生理功能以及在食品和医疗领域的应用等方面进行了综述，以期促进D-阿洛糖的功能研究，为D-阿洛糖在食品领域及临床治疗中的应用提供参考。

摘要:CpxA是革兰氏阴性细菌中普遍存在的包膜双组分系统Cpx的关键成员，负责信号感应，兼具磷酸酶和激酶双重活性，参与多种细菌耐药及致病性等重要生理过程的调控。近年来，靶向CpxA的新型抗菌药物开发引起研究者的关注，基于其磷酸酶活性抑制功能的药物在大肠杆菌所致尿路感染的治疗中初显成效。本文梳理了细菌包膜应激感应蛋白CpxA的结构、功能域及其激活CpxR的通路，总结分析了其参与细菌耐药性形成及毒力调控的机制，同时综述了当前针对该靶点研发的抗菌药物的最新进展，以期助力临床严重耐药菌抗感染治疗新策略的研发。

摘要:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的致病菌，但由于抗生素的滥用，多重耐药金黄色葡萄球菌(multiple drug-resistant S. aureus, DR S. aureus)大量出现，严重威胁人类健康。DR S. aureus通常具有生物被膜，它是细菌黏附于接触物表面，生长并分泌多糖、蛋白质和脂质等大分子物质，将其自身包裹其中而形成的具有复杂结构的聚集体，能够有效保护细菌免受外界不良因素影响。同时生物被膜还可保护DR S. aureus躲避宿主免疫系统的攻击并减弱药物的渗透和杀伤作用，是影响细菌耐药性的关键结构。因此深入认识DR S. aureus生物被膜的形成过程对治疗耐药菌相关感染疾病具有重要意义。本文综述了近年来关于DR S. aureus生物被膜的形成机制、耐药机理及抑制与清除策略的研究进展，并对未来的研究方向进行展望。

摘要:脂联素是脂肪组织细胞因子之一，也是一种新定义的脂肪细胞因子，可以参与胰岛素、葡萄糖和脂肪细胞代谢过程。脂联素水平降低会增加发生代谢综合征(metabolic syndrome, MS)的风险。脂联素因其具有抗动脉粥样硬化和有效的胰岛素增敏作用而被认为是治疗2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)和MS的重要工具。因此，准确测定人血浆中的脂联素浓度对T2DM和MS的预测及治疗决策具有重要的意义。目前，已经开发了许多生物传感器用于检测脂联素等生物标志物。本文综述了电化学传感器、表面增强拉曼散射传感器以及化学发光微流控传感器在脂联素检测领域中的应用，阐述了近年来脂联素传感器的研究进展，以期为脂联素传感器的进一步研究及其在医疗领域中的应用提供参考。

摘要:蛋白质与配体的结合在生命过程中发挥重要作用，计算蛋白质-配体结合亲和力(protein-ligand binding affinity, PLBA)有助于解析蛋白质功能、筛选与蛋白靶点结合的药物以及进行酶的改造等。近年来，人工智能(artificial intelligence, AI)发展迅速，因其特征提取能力强、算法准确度高、计算速度快等优势，已广泛应用于PLBA预测。本文介绍了AI预测的建立过程、相关资源、应用场景以及面临的挑战和潜在解决办法，为相关研究提供借鉴。

摘要:随着计算能力的增加和生物数据的快速扩展，利用生物信息学解决一些生物学问题逐渐成为主流的解决方案。蛋白质功能预测是生物医学和药物研究领域的重要任务。利用生物信息学进行蛋白质功能预测成为研究热点。本文将基于生物信息学的蛋白质功能预测方法归纳为3类：基于蛋白质序列的方法、基于蛋白质结构的方法和基于蛋白质相互作用网络的方法，并进一步分析和总结了这些方法的具体算法以及最新研究进展，为生物医学和药物研究领域深入探索预测蛋白质功能提供重要参考。

摘要:合成生物学的主要目标之一是自下而上地构建人工细胞。它不仅能深入理解生命的起源和细胞功能，还能在人工细胞底盘、组织模型、工程治疗递送系统和药物筛选工具等领域发挥关键作用。然而，这一目标的实现极具挑战，细胞结构的复杂性、基础模块的微型化和多样性对构建方法提出了极高要求。微流控芯片作为一种先进的分析系统，为人工细胞的构建提供了一种有效工具，能够更精确地控制其结构及局部微环境，成为当前研究的首选途径。本文综述了基于微流控芯片的人工细胞构建、操作与分析方法，强调了微环境对生命系统和人工自我维持体系的重要性，展示了人工细胞在多个关键生物医学领域的广泛应用。通过探讨不同微流控方法的优缺点及其在各种应用中的表现，帮助研究人员更深入地理解人工细胞相关研究。最后，对基于微流控技术的人工细胞研究的未来发展进行了展望，期待这一领域能够取得更大突破和进步。

摘要:抗生素作为一类新污染物，在地表水中频繁检出，其引发的抗性基因风险已引起人们的广泛关注。然而，关于我国地表水中抗生素的污染现状及其对水生生物的生态风险尚未见详细论述。本研究建立了2018–2022年间我国地表水抗生素污染的数据集，包括124份文献报道的128种抗生素的3 368个浓度数据。分析结果表明，抗生素的检出浓度主要在ng/L–μg/L级别，最高可达26 μg/L。其中磺胺甲噁唑等磺胺类抗生素、环丙沙星等喹诺酮类抗生素报道次数多且检出浓度高。以磺胺甲噁唑、环丙沙星、罗红霉素和四环素为例，不同年份的抗生素污染程度并无显著区别，但夏季的污染程度相比春、秋季更低，且呈现明显不同的空间分布特征。基于水生生物生态风险评估模型和风险加权频率计算，我们提出了包括克拉霉素、红霉素、磺胺甲噁唑、氧氟沙星和氧四环素等地表水中优先管控抗生素的名单。最后，本文指出了我国地表水中抗生素的环境分布及生态风险的研究中的不足，并提出了建议和展望。

摘要:非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一种动物疫病。2018年传入我国后迅速波及国内多个省份，给我国养猪业带来了巨大的冲击。由于对ASFV致病机制了解有限，导致ASF疫苗及抗病毒药物的研发遇到了极大挑战。本课题组前期研究发现，ASFV感染能引起宿主细胞内的氧化损伤应答，并且DNA氧化损伤修复酶在ASFV的感染中发挥重要作用，因此本研究采用RNA干扰、RT-qPCR、Western blotting、红细胞吸附(hemadsorption, HAD)、流式细胞技术等生物学方法，验证8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1 (8-oxoguanine DNA glycosylase 1, OGG1)/8-羟基鸟嘌呤核苷酸酶1 (8-oxoguanine nucleoside triphos-phatase, MTH1)小分子抑制剂对ASFV复制的影响，以评估靶向DNA氧化损伤修复酶的抗ASFV感染效果。本研究为抗非洲猪瘟药物的研发提供了借鉴及参考。

摘要:为了研发出一种可同时预防猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)两种病毒病的有效二联亚单位疫苗，本研究将PDCoV的受体结合域(receptor binding domain, RBD)与PEDV的RBD基因进行串联，构建至真核表达载体pCDNA3.1(+)中，利用哺乳动物细胞ExpiCHO^TM表达系统表达纯化出PDCoV-RBD-PEDV-RBD (简写为pdRBD-peRBD)融合蛋白，以3种不同剂量(10、20和30 μg)免疫小鼠，利用ELISA和流式细胞术评估该融合蛋白诱导的体液免疫反应和细胞免疫反应，利用病毒微量中和试验测定免疫小鼠血清对PDCoV或PEDV的中和效价。结果表明，3个不同剂量组在加强免疫后均诱发了高水平的IgG抗体，不同剂量组间抗体水平没有明显差异，说明10 μg的免疫剂量即可达到较好免疫效果。流式细胞术检测结果显示，免疫组的CD₃⁺CD₄⁺ T细胞比例显著升高，CD₃⁺CD₈⁺ T细胞比例相对较低，这符合亚单位疫苗主导机体产生体液免疫反应的预期。同时，对血清中细胞因子白细胞介素-2 (interleukin-2, IL-2)、白细胞介素-4 (interleukin-4, IL-4)和干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)的含量进行了检测，结果表明该融合蛋白诱导了良好的体液免疫效果，同时还产生了一定的细胞免疫应答。中和试验结果表明，10 μg免疫剂量所诱导的抗体即可在体外有效中和PDCoV和PEDV两种病毒，效价分别为1:179.25和1:141.21。上述研究结果表明，pdRBD-peRBD融合蛋白10 μg免疫剂量即可诱导高水平的体液免疫反应，诱导的抗体可同时中和PDCoV和PEDV两种病毒，说明pdRBD-peRBD融合蛋白有希望成为一种能同时预防PDCoV和PEDV的有效二联亚单位疫苗。

摘要:本研究旨在筛选调控牛下丘脑可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide, CART)表达的长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)小核仁RNA宿主基因3 (small nucleolar RNA host gene 3, SNHG3)，明确lncRNA SNHG3调控牛下丘脑CART表达的作用机制。利用StarBase v2.0、NCBI、DIANA tools数据库预测分别与极显著抑制CART表达的miR-381、miR-491存在靶向关系的lncRNAs，分析其结合位点；选取3头健康成年西门塔尔母牛，提取其下丘脑组织总RNA，通过半定量RT-PCR技术鉴定所筛选的lncRNAs内源表达情况；双荧光素酶报告基因技术检测miR-381/491与lncRNAs间的靶向结合关系；构建lncRNAs、CART过表达载体及miR-381/491 mimics，分别转染至293T细胞，分析lncRNAs对CART基因表达的调控作用机制；利用动物活体实验对在细胞水平调控作用效果最强的lncRNA进行功能分析。lncRNA TUG1、SNHG3与miR-381存在结合位点，lncRNA H19、SNHG12、DANCR与miR-491存在结合位点，且lncRNA TUG1、SNHG3、H19、SNHG12、DANCR均在牛下丘脑中有表达；双荧光素酶检测结果显示，miR-381显著抑制TUG1-WT重组荧光质粒的相对荧光活性(P<0.05)，极显著抑制SNHG3-WT重组荧光质粒的相对荧光活性(P<0.01)；miR-491显著抑制DANCR-WT和H19-WT的荧光素酶活性表达(P<0.05)，极显著抑制SNHG12-WT荧光素酶活性表达(P<0.01)；在细胞水平，lncRNA SNHG3通过特异性结合miR-381极显著提高CART表达(P<0.001)，lncRNA SNHG12通过特异性结合miR-491极显著提高CART表达(P<0.01)，其中，lncRNA SNHG3调控CART表达效果最强；动物实验结果表明，lncRNA SNHG3通过特异性结合miR-381显著提高CART mRNA和蛋白表达。本研究证实了lncRNA SNHG3作为miR-381的竞争性内源RNA (competing endogenous RNAs, ceRNA)，在转录和转录后水平均显著上调CART表达，为进一步研究牛下丘脑CART的分子网络调控机制奠定了基础。

摘要:为了探究黑线姬鼠睾丸下降的功能与机制，分析其基因及代谢物水平的变化规律。本研究使用高通量测序技术和超高效液相色谱技术对黑线姬鼠下降期和正常期睾丸分别进行了转录组学和代谢组学分析。转录组学中基因本体数据库(gene ontology, GO)富集分析得到240个差异基因，包括Spesp1、Izumo1、Hyal5和Fabp9等，京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析得到52个差异表达基因，包括Pcyt1、Pla2g4e、Gpd1l和Lypla3等。实时荧光定量PCR结果表明，随机选取的6个基因在黑线姬鼠下降期和正常期睾丸中的表达模式与转录组结果一致。代谢组学结果表明，差异代谢集中与睾丸功能相关差异代谢物有28个，包括3-脱氢奎宁酸、α-亚麻酸、磷酸二羟丙酮和1,6-二磷酸果糖等。联合分析结果显示，甘油磷脂代谢、α-亚麻酸代谢和花生四烯酸代谢可能是调控黑线姬鼠睾丸下降及功能发生关键代谢通路。本研究将有助于解读黑线姬鼠睾丸下降对其功能的影响机制，也可为后续深入探究黑线姬鼠种群数量变化机制及实验动物资源开发奠定理论基础。

摘要:近年来，多种新型抗人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)疗法如基因治疗、广谱中和抗体以及衍生的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor modified T cell, CAR-T)疗法均迫切需要理想的动物模型及用于精准定量病毒基因组的方法。本研究通过双标HIV假病毒构建及感染获得HIV- ∆ENV-Jurkat-EGFP-mCherry稳转细胞，并以该细胞基因组作为整合前病毒的标准品，建立巢式荧光定量PCR (nested quantitative polymerase chain reaction, nested-qPCR)定量HIV整合前病毒。通过尾静脉注射健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)到NOD/Prkdcscid/IL2rgnull (NPG)小鼠，通过监测小鼠外周血中hCD45+、hCD3+、hCD4+和hCD8+人源化细胞的比例来判断人源化小鼠模型构建是否成功。腹腔注射HIV NL4-3-NanoLuc病毒，随后通过小动物活体成像及分子病毒学评价HIV体内复制，结果表明，尾静脉注射正常人PBMC细胞至小鼠内3−5周后，实验组小鼠体内均检测到人源免疫细胞的浸润，建模5周后的人源化小鼠外周血中hCD45大于25%，即人源化小鼠模型构建成功。感染27 d后小动物活体成像能检测到病毒相关萤光素酶蛋白表达，分子病毒学结果表明在脾脏中病毒总DNA、RNA和整合前病毒DNA分别达到了18 000 copies/10⁶ cells、15 000 copies/μg RNA、15 000 copies/10⁶ cell。本研究证明了通过尾静脉注射正常人PBMC，可成功建立HuPBMC-NPG/严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)人源化小鼠模型，并且HIV病毒可成功感染该模型。本研究建立了有效测定HIV整合前病毒DNA的方法，为艾滋病体内复制水平及病毒库大小和对多种新型抗HIV疗法的治疗效果的评价奠定了基础。

摘要:肾盂癌是一种较为常见的上尿路上皮癌，由于缺乏理想的体外模型，严重阻碍了该类疾病治疗策略研究的进展。本研究基于肾盂癌患者来源肿瘤组织样本，建立肾盂癌类器官培养方法，并基于肾盂癌类器官构建肿瘤化疗药物反应模型。通过免疫组化和荧光实验证实，培养获得的肾盂癌类器官核异型性明显，与亲本肾盂癌组织一致；肾盂癌类器官中肿瘤标志分子CD44和细胞增殖标志分子Ki67均呈强阳性，表明类器官富集肿瘤干细胞，具有较强增殖能力。药物反应实验显示肾盂癌类器官对吡柔比星高度敏感，杀伤作用明显。本研究成功建立了肾盂癌类器官体外培养体系，并进行了初步体外药敏试验，为以肾盂癌为代表的上尿路上皮癌的个体化诊疗提供了新的体外实验模型。

摘要:异质性细胞叠套(heterotypic cell-in-cell, heCIC)结构是细胞间一种独特的相互作用方式，其中肿瘤细胞可内化免疫细胞形成heCIC结构，从而提升免疫细胞的杀伤效率。然而，调节heCIC结构形成的机制尚未阐明。本研究聚焦于上皮膜蛋白3 (epithelial membrane protein 3, EMP3)，一种在肝癌患者组织表达增加并伴随不良预后的PMP-22/EMP/MP20蛋白家族成员，探讨了其在调节自然杀伤细胞-肝癌细胞形成heCIC结构中的作用。通过分析课题组前期分选出的具有不同heCIC形成能力的单克隆肝癌细胞株，发现heCIC形成能力高的细胞株中EMP3表达较低，而heCIC形成能力低的细胞株中EMP3表达较高。利用基因编辑技术敲低EMP3表达可以促进heCIC结构的形成，而EMP3的过度表达则显著抑制了这一过程。通过检测与heCIC结构形成相关的分子表达水平发现，EMP3通过调节肿瘤细胞的黏附能力和细胞骨架来抑制肝癌细胞heCIC结构的形成。本研究为靶向EMP3促进肝癌细胞heCIC结构介导的肿瘤免疫增强提供了研究基础。

摘要:近年来精准医学在癌症治疗中得到了广泛的应用，其重点在于如何准确地预测不同的患者对药物治疗的反应。本研究设计了一种基于基因组学特征分布对齐和药物结构信息的癌症药物敏感性预测方法，该方法首先对齐来自细胞系的基因组学特征与来自患者的基因组学特征的分布并去除基因表达数据中的噪声，之后融合药物结构信息，使用多任务学习的方式进行患者药物敏感性预测。结果表明，在癌症相关药物敏感性基因组学数据集(genomics of drug sensitivity in cancer, GDSC)上，此方法的预测结果中均方误差降至0.905 2，相关系数提升至0.875 4，准确率提升至0.836 0，显著优于最近发表的方法，在癌症基因组图谱数据集(the cancer genome atlas, TCGA)上，此方法预测药物敏感性的平均召回率提升至0.571 4，F1-分数提升至0.658 0，表现出优秀的泛化性能。这展现了本方法未来用于辅助选择临床治疗方案的潜力。

摘要:全球肥胖/超重人数急剧上升，逐步成为一个全球公共卫生难题，因此迫切需要有效的治疗手段。本研究设计了一种新型治疗肥胖的西他列汀模型药物速溶型聚合物微针阵列贴片(sitagliptin-PVP/PVA-microneedles, SGN-PVP/PVA-MN)，重点研究了该贴片的制备工艺，对微针阵列的形貌尺寸进行了表征，并探究了SGN-PVP/PVA-MN的力学性能、皮肤穿刺性能、溶解性能以及药物扩散性能。结果表明SGN-PVP/PVA-MN具备良好的形貌和力学性能，能够有效穿透皮肤角质层并开启微通道，实现药物的迅速透皮扩散。体外药物透皮扩散试验表明SGN-PVP/PVA-MN在2 min内释放了64.5%的药物，在10 min内释放95.7%的药物。SGN-PVP/PVA-MN具有快速溶解特性和较高药物扩散效率，可为肥胖症患者提供一种有效、安全的治疗选择。

摘要:本研究旨在制备抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (glypican-3, GPC3)单链抗体的细菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)，分析其在体内外对Hep G2肝癌细胞及组织的靶向效果。通过合成Hbp-hGC 33-scFv基因并连接至pET28a表达载体，构建重组表达质粒pET28a-Hbp-hGC 33-scFv；采用免疫印迹法检测原核表达的融合蛋白Hbp-hGC 33-scFv，确定其最适诱导条件；采用超滤浓缩法收集重组表达菌株分泌的外膜囊泡(Hbp-hGC 33-OMVs)并进行表征；采用免疫电镜技术分析Hbp-hGC 33-scFv在细菌及Hbp-hGC 33-OMVs的定位情况；采用免疫荧光法观察其与Hep G2细胞的结合效果。建立Hep G2荷瘤小鼠模型，通过活体荧光成像系统观察Hbp-hGC 33-OMVs在小鼠肿瘤部位的靶向滞留情况。结果显示，融合蛋白的实际分子量为175.3 kDa，最佳诱导条件为在OD₆₀₀=0.5 时加入0.5 mmol/L IPTG于16 ℃低温诱导过夜。Hbp-hGC 33-OMVs平均粒径为(112.3±4.6) nm，具有不规则球形结构，表达外膜囊泡标记蛋白OmpC、OmpA和融合蛋白Hbp-hGC 33-scFv。与野生型wtOMVs相比，Hbp-hGC 33-OMVs组对Hep G2细胞的结合效果更强(P=0.008)。活体成像显示，Hbp-hGC 33-OMVs组能快速精准地靶向肿瘤部位。抗GPC3单链抗体细菌外膜囊泡的成功制备为肝细胞癌的特异性靶向治疗奠定了实验基础。

摘要:松脂醇-落叶松脂素还原酶(pinoresinol-lariciresinol reductase, PLR)是植物中木脂素生物合成的关键酶，能连续催化两步反应分别生成落叶松脂素和开环异落叶松脂素。落叶松脂素等木脂素类成分是中药板蓝根发挥抗病毒活性的有效成分。为了研究板蓝根基原植物菘蓝中落叶松脂素生物合成关键酶PLR的功能，从菘蓝(Isatis indigotica)中克隆得到IiPLR2基因序列，全长954 bp，编码317个氨基酸；多序列比对分析显示IiPLR2具有保守的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)结合基序；进化树分析显示IiPLR2与来自拟南芥的AtPrR1聚在同一分支；构建原核表达载体pET32a-IiPLR2，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达纯化；体外酶活实验检测发现IiPLR2能够催化松脂醇生成落叶松脂素，并能进一步催化落叶松脂素生成开环异落叶松脂素。IiPLR2编码基因的克隆、序列分析及催化功能研究丰富了菘蓝中该类功能蛋白的认识，完善了菘蓝木脂素生物合成途径，为开展木脂素类成分的代谢调控和合成生物学研究提供了功能元件，也为深入研究该类蛋白的空间结构与催化功能的关系等奠定了基础。

摘要:泛素/蛋白酶体系统(ubiquitin/proteasome system, UPS)在调控细胞内蛋白质稳态过程中发挥重要功能，UPS中蛋白酶体的催化活性受β1 (PSMB6)、β2 (PSMB7)和β5 (PSMB5)亚基调控，在干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、炎症反应、氧化应激等条件诱导下，β1、β2和β5可被相应的β1i (PSMB9)、β2i (PSMB10)和β5i (PSMB8)替换，组装形成免疫蛋白酶体(immunoproteasome)。与标准蛋白酶体相比，免疫蛋白酶体具有更强的免疫调节作用，如加工递呈MHC Ⅰ抗原、调节促炎细胞因子的产生及T细胞分化、增殖等。免疫蛋白酶体的异常聚集会导致帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化等神经退行性疾病的发生。为探究PSMB9在细菌感染后发挥的功能，本研究通过构建过表达PSMB9-eGFP-His的慢病毒质粒，利用三质粒系统转染HEK293T包装慢病毒，嘌呤霉素筛选，获得稳定表达PSMB9融合蛋白的人髓系白血病单核细胞THP-1细胞系，利用蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)及荧光显微镜验证了PSMB9融合蛋白的表达，通过实时荧光定量PCR (quantitative PCR, qPCR)计算了稳转细胞系中PSMB9-eGFP基因的拷贝数。免疫荧光结果发现eGFP-His不会影响PSMB9的亚细胞定位，镍柱亲和纯化实验证实PSMB9融合蛋白可组装至20S免疫蛋白酶体中，且具有底物切割活性。上述结果证明PSMB9-eGFP基因成功整合入THP-1细胞基因组并稳定表达，可用于探究PSMB9亚基在活细胞模型中不同感染条件及疾病进程中的细胞定位、动态表达和活性的变化，并为其他2个免疫蛋白酶体亚基PSMB8和PSMB10的稳转细胞系构建提供了参考。

摘要:抑冰纳米材料被广泛研究以提高对细胞、组织或器官等的冷冻保存效率。不同组分、尺寸、形貌的抑冰纳米材料可有效抑制冰晶的形成和生长，从而减少对生物样品冻存的损伤。本研究通过水热法制备出不同尺寸的碳复合体微粒(carbon composite particles, CCPs)和特殊形貌的微纳米材料。结果显示随着碳复合体微粒粒径尺寸减小，细胞冻存保护效果增强。而相较于球形结构的碳复合体微粒，不对称纳米粒子(Janus nanoparticles)和纳米花(WSP nanoflower)材料对细胞冻存的保护作用明显增强。另外，将适当浓度微纳米抑冰材料与商品化冷冻保护剂联合使用，可进一步提高对细胞冷冻保护的效果。本文制备的微纳米防冻材料可有效提高细胞的冷冻保存效率，在生物医学研究和低温保存应用中具有巨大的潜力。

摘要:为探究3种雌激素受体(estrogen receptor) Esr1、Esr2和Gper1在红耳龟早期胚胎性腺分化中的作用，本研究在分析受体基因表达特征的基础上，通过向性腺分化启动前的产雄温度(male-producing temperature, MPT)龟胚分别注射Esr1、Esr2和Gper1激动剂PPT、WAY 200070和G-1，从性腺形态结构、生殖细胞分布模式、性别分化关键基因和蛋白表达分布方面对处理后的胚胎性腺进行了性逆转分析。表达分析结果显示，esr1在性别分化关键时期性腺中的表达量显著高于esr2和gper1 (表达极低)，且呈现产雌温度(female-producing temperature, FPT)性腺高表达。功能验证实验显示，PPT处理后的MPT性腺形态结构明显雌性化，生殖细胞呈现雌性分布模式；雄性分化关键基因dmrt1、amh和sox9 mRNA表达明显下降，雌性分化关键基因foxl2和cyp19a1 mRNA表达则显著上升；Amh和Sox9蛋白表达的荧光信号几乎消失，Foxl2和Arom蛋白被激活出现大量表达，表明性腺由雄性逆转为雌性(性逆转率：70.27%)。而WAY 200070和G-1处理后的MPT性腺仍分化为睾丸，雌雄基因和蛋白的表达及分布与雄性性腺类似。结果表明在红耳龟中，单独激活Esr1能够充分启动早期性腺的雌性分化过程，提示雌激素可能通过其受体1 (Esr1)诱导早期卵巢分化。本研究为进一步解析雌激素在龟性别决定和分化中的调控机制提供了参考。

摘要:本研究拟建立一种高特异性的猪肺炎支原体酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)抗体检测方法。首先，构建重组菌大肠杆菌BL21(DE3)-pET-32a(+)-mhp336，诱导重组蛋白Mhp336表达并纯化，获得的纯化蛋白作为包被抗原；然后，确定ELISA方法的抗原包被浓度、封闭液和封闭时间、血清和二抗稀释比例和孵育时间、显色时间和判定标准；之后进行重复性试验、与猪的其他主要病原抗血清的交叉反应性和确定血清最大稀释倍数；最后，用建立的方法检测226份猪血清样品，并与商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒和猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法进行比较，确定检测方法的灵敏性和特异性。最终确定Mhp336纯化蛋白的最佳包被浓度为0.05 μg/mL，封闭液为含2.5%脱脂奶粉的PBS，封闭时间为1 h，血清稀释比例为1:500，孵育时间为0.5 h，二抗稀释比例为1:10 000，孵育时间为1 h，显色时间为5 min。检测方法的cut off值为0.332。试剂盒的批内和批间变异系数均低于7%。猪血清样品的检测结果表明，本研究建立的检测方法的灵敏性和特异性均优于商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒和猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法。本研究成功建立了基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法，灵敏性和特异性均较好，为猪场猪支原体肺炎的净化提供了检测方法。

摘要:本研究旨在建立一种快速构建猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)感染性克隆的方法。以临床分离的PCV2 LX株为模板，利用DNA无缝克隆技术成功构建了PCV2环状感染性克隆。同时，在基因组体外自连接的构建过程以及拯救病毒的生长特性上，将本方法与常规酶切连接方法进行了比较。本方法无须分析和引入限制性内切酶位点，避免了传统酶切连接的繁琐，能更高效地进行PCV2基因组的编辑。构建的感染性克隆经脂质体转染细胞，成功拯救获得可以稳定传代的重组病毒，并且重组病毒在PK-15细胞和3D4/31细胞(猪肺泡巨噬细胞系)上具有更强的增殖能力。综上所述，本研究构建了一种基于体外自连接的PCV2反向遗传操作系统，为PCV2基因工程疫苗的研发提供新策略，为其他新发圆环病毒(PCV3和PCV4)感染性克隆的构建提供借鉴。

摘要:为了实现饲料中恩拉霉素的快速检测，本研究开发了基于抗恩拉霉素A单克隆抗体(anti-enramycin A monoclonal antibody, anti-Er.A-mAb)的竞争抑制胶体金免疫层析试纸条。以实验室制备的高纯度抗恩拉霉素A单克隆抗体制备胶体金探针，并考察了标记pH、抗体标记量、检测线浓度对恩拉霉素胶体金免疫层析试纸条的影响。在碳酸钾添加量为8 μL、抗体标记量为4 μg/mL、检测线划膜浓度为1.0 mg/mL、金标抗体使用量为3 μL的条件下制备得到的胶体金试纸条特异性好、检出限低。经胶体金读数仪测定，恩拉霉素A检出限为25 ng/mL、线性范围为25-300 ng/mL。选用畜禽饲料进行阳性样本添加实验，结果显示检测结果重复性好，比高效液相色谱法更为灵敏，适合大批量饲料样本的恩拉霉素快速检测。

摘要:

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