摘要:RNA干扰（RNAi）技术是基因功能研究的有效工具，为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）次要结构蛋白GP2、GP3、GP4在病毒复制中的作用，针对各自的编码基因ORF2、ORF3、ORF4分别选取4个小干扰RNA（siRNA）位点（共12个），构建相应的短发夹RNA（shRNA）表达载体，转染MARC-145细胞后，通过荧光定量PCR和病毒滴度检测干扰效果。筛选了可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量的ORF2、ORF3、ORF4特异shRNA表达载体，病毒效价滴定表明shRNA表达载体处理细胞可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量，细胞培养上清中的病毒滴度比对照低184～4.65倍。

摘要:RNA干扰（RNAi）技术是基因功能研究的有效工具，为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）次要结构蛋白GP2、GP3、GP4在病毒复制中的作用，针对各自的编码基因ORF2、ORF3、ORF4分别选取4个小干扰RNA（siRNA）位点（共12个），构建相应的短发夹RNA（shRNA）表达载体，转染MARC-145细胞后，通过荧光定量PCR和病毒滴度检测干扰效果。筛选了可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量的ORF2、ORF3、ORF4特异shRNA表达载体，病毒效价滴定表明shRNA表达载体处理细胞可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量，细胞培养上清中的病毒滴度比对照低184～4.65倍。

摘要:SARS-CoV S蛋白特异的单克隆抗体2C5具有病毒中和作用。以单克隆抗体2C5为筛选靶分子，筛选噬菌体展示随机7肽库。经三轮淘洗后随机挑选20个噬菌体克隆进行ELISA分析和序列测定。在10个ELISA OD值大于0.2的阳性噬菌体克隆中，有8个噬菌体克隆展示有共同的7肽序列TPEQQFT。展示有该序列的噬菌体克隆能竞争抑制SARS-CoV S蛋白抗原与单抗2C5的结合。结果表明TPEQQFT为单克隆抗体2C5的模拟表位。该结果可对进一步研究S蛋白结构与功能和设计SARS疫苗有一定的参考意义。

摘要:参照已发表的SARS冠状病毒BJ01株基因序列 ,利用计算机软件预测并选取该病毒S、M、N三种主要结构蛋白部分抗原性优势区域 ,以编码Gly-Pro-Gly序列相连接合成两段嵌合基因A和B。并分别克隆于pGEX -6p- 1载体上用IPTG进行诱导表达 ,以纯化的嵌合蛋白A和B为抗原 ,分别免疫BALB c小鼠制备单克隆抗体。利用单克隆抗体亚型检测试剂盒和SARS CoV商品化ELISA检测试剂盒对其进行亚型和特异性鉴定。结果表明融合表达两段嵌合基因产物 ,其大小分别为 34kD和35kD ,Westernblot分析证实两种表达产物都能被SARS病人康复期血清所识别。获得了 6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞克隆株。亚型鉴定结果除D3C5为IgG2a外其他单抗均为IgG1,而且所有单抗的轻链均为κ链。特异性鉴定发现除D3D1外 ,其余的 5株单抗均能与SARS CoV商品化ELISA检测试剂盒发生特异性反应。将D3D1与灭活后经超声波裂解的SARS CoV进行Westernblot分析 ,发现它能特异性识别 180kD的蛋白带。分别融合表达了 6个S蛋白的寡肽 (S1- S6 ) ,并对筛选出的单克隆…

摘要:以高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的感染性分子克隆 (rHuN4-F112) 作为载体，将O型口蹄疫病毒 (FMDV) VP1基因的421~480nt (141~160aa) 和598~639nt (200~213aa) 两优势保护性抗原表位串联成的目的基因，通过突变PCR的方法插入Nsp2中的508~532位缺失区域，经体外转录后转染至BHK-21细胞中培养36 h，将上清接种至MARC-145细胞中培养，并在MARC-145细胞中连续传代，拯救重组病毒。经RT-PCR扩增，MluⅠ酶切及测序验证，结果表明插入的外源基因及人为突变的MluⅠ分子标记都正确，说明重组病毒拯救成功，且该重组病毒能够在MARC-145细胞中稳定传代，将此重组病毒命名为rPRRSV-F112-O/VP1ep。rPRRSV-F112-O/VP1ep能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变，间接免疫荧光检测表明外源基因在该病毒中成功获得了表达。经过生物学特性分析，该病毒的TCID50=-log10-6.75/0.1 mL, 且在MARC-145细胞中整体生长速度与其亲本病毒rHuN4-F112(△508-532) 相似，但明显高于rHuN4-F112病毒。

摘要:为了获得新型双价“自杀性”DNA疫苗, 将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) GP5基因克隆于此前构建的表达猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)E2基因的甲病毒复制子载体疫苗pSFV1CS-E2中。为了增强免疫效果, 在密码子优化的GP5基因中插入了泛DR表位(PADRE), 在CSFV E2基因后融合伪狂犬病病毒(PrV)UL49基因, 获得了6种重组质粒。间接免疫荧光试验显示, PRRSV GP5和CSFV E2基因在瞬时转染的293T细胞中得到同时表达。将6种重组质粒和空载体pSFV1CS分别免疫BALB/c小鼠, 用间接ELISA方法检测血清抗体水平, 通过基于CSFE/WST-8的淋巴细胞增殖试验和细胞因子ELISA评价疫苗诱导的细胞免疫。结果显示, 除pSFV1CS组外, 从各疫苗组小鼠血清中均可检测到低水平的针对GP5和E2蛋白的抗体; 各疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后均能诱导特异性的淋巴细胞增殖; 部分疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后可分泌较高水平的IFN-g和IL-4; 引入UL49的疫苗组细胞免疫应答显著高于其它疫苗组。结果表明, 这些共表达GP5和E2蛋白的自杀性DNA疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫, PrV UL49可以增强其细胞免疫应答。