摘要:为大量获取低成本的TEM-116超广谱β-内酰胺酶，并分析其降解环境中β-内酰胺类抗生素残留物的可行性，本研究在Escherichia coli BL21(DE3)菌株中表达了重组TEM-116超广谱β-内酰胺酶，经亲和层析纯化、柱复性与分子筛层析纯化，得到了高纯度的目的蛋白，对其理化性质进行了分析。结果表明，重组TEM-116超广谱β-内酰胺酶的分子量、比活性分别为30 kDa和476 IU/mg，与天然酶性质相近。重组酶在体内外对多种青霉素、头孢菌素类药物均具有较高降解效率：10 IU 酶可清除1 L发酵液中7000 mg的青霉素G；320 IU酶可清除1 L尿液中各200 mg的青霉素G、氨苄青霉素和头孢唑林混合抗生素；1.0~2.5 IU的酶可在4℃~37℃温度范围内清除1 L牛奶中80 U的青霉素G；2.0×104~2.3×104 IU/(kg?bw)的酶能够清除小鼠体内8.0×104 ~9.1×104 μg/(kg?bw)的青霉素G。

摘要:为构建一种敏感性强、特异性好的检测砷离子的大肠杆菌荧光报告菌株，本研究利用基因敲除技术，敲除了大肠杆菌中负责向胞外转运砷离子的arsB基因，构建对As3+敏感的菌株；利用egfp基因作为报告基因，构建融合检测载体pET28b-Pars-arsR-egfp。然后将检测载体pET28b-Pars-arsR-egfp转化至arsB基因敲除菌中完成敏感型As3+ 检测菌株的构建。接着对此微生物传感器进行了检测条件的优化，以及线性检测范围、最低检出限、特异性等性能的确定。研究结果表明，与利用野生大肠杆菌作为检测宿主相比，此敏感型砷检测菌株对检测As3+的灵敏度有显著提高，最适检测As3+浓度范围为0.013?42.71 μmol/L，最低检出下限为5.13 nmol/L。因此，本研究利用基因敲除技术对大肠杆菌进行改造，成功地提高了砷检测微生物传感器的灵敏度，为重金属微生物传感器的优化研究工作提供了有用方案。

摘要:为构建一种能够特异性检测镉离子的大肠杆菌荧光报告菌株，本研究通过对检测元件模式和荧光蛋白的筛选后，以蓝色荧光蛋白mTagBFP2基因作为报告基因，使用双启动子模式，构建融合报告载Pmer::merR-m-Pmer::mTagBFP2-pMD19-T。然后将报告载体转化至E. coli MC4100菌中，构建特异性检测镉离子的微生物传感器，并对此微生物传感器进行了最佳培养基、起始诱导浓度和时间、最适检测范围等相关参数的确定，以及对特异性进行了测定。研究表明，此微生物传感器检测镉离子背景信号低，选定起始菌液浓度为OD600=0.1，于IHMM培养基中诱导2 h为最佳检测条件，检测镉离子线性浓度范围为0.1?75 μmol/L，并且只对Cd2+响应，特异性较高。因此，本研究成功构建了能够特异性检测镉离子的生物传感器，为重金属微生物传感器的优化研究工作提供了有用方案。

摘要:本实验克隆了人的4种SENP(Sentrin-specific protease)C端催化结构域、3种SUMO(Small ubiquitin-like modifer)、ECFP(Enhanced cyan fluorescent protein)以及EYFP(Enhanced yellow fluorescent protein)的基因, 通过RecJoin克隆技术分别成功构建SENP和ECFP-SUMO-EYFP表达载体B28和B13。将表达载体转化大肠杆菌BL21, 经IPTG诱导表达, 通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化, 进一步采用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定, 并以酶切实验初步分析了SENP相对于底物ECFP-SUMO-EYFP的酶切特异性。最终, SENP3C(SENP3 catalytic domain)截短表达, SENP5C以包涵体形式表达, 其他蛋白均为可溶性表达, SDS-PAGE分析表明表达产物分子质量(Mr)与预期相符, Western blotting方法进一步证实其为目的蛋白。酶切实验初步鉴定了SENP1C和SENP2C的酶切特异性。以上蛋白的原核表达为荧光共振能量转移实验奠定了实验基础。

摘要:利用7.5 L生物反应器篮式贴壁培养和全悬浮批式培养CHO工程细胞株表达可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部 (sTNFRII-gAD) 融合蛋白，比较这两种培养方法的产率，以便优化高效表达sTNFRII-gAD融合蛋白的制备工艺。篮式贴壁培养首先小规模培养CHO工程细胞株，待细胞增殖到一定密度后以3×105~4×105 cells/mL密度接种生物反应器贴壁培养3 d，调换成不含血清的LK021培养基继续培养4 d。而全悬浮无血清批式培养则以3×105~4×105 cells/mL密度的CHO工程细胞株接种于生物反应器，连续培养7 d。培养过程实时监测培养条件，维持pH和DO的稳定。分别收集细胞上清，离心去细胞后用Pellicon切相流超滤系统对蛋白进行浓缩，并通过DEAE离子交换柱进行纯化。结果显示，篮式贴壁培养和全悬浮批式培养均成功表达了sTNFRII-gAD融合蛋白，产量分别为8.0 mg/L和7.5 mg/L、纯度分别为95％和98％，从而为sTNFRII-gAD融合蛋白的中试工艺研究提供了一定的基础。