科微学术
生物工程学报
ISSN 1000-3061
CN 11-1998/Q
主管单位： 中国科学院 创刊时间：1985年
主办单位： 中国科学院微生物研究所 出版刊期：月刊
中国微生物学会 邮发代号：82-13
主 编： 邓子新 院士 出版日期：每月25日
执行主编： 李寅
收录类型：北大中文核心期刊、中国科技核心期刊、CSCD核心期刊、中国知网、Medline/PubMed、Scopus、AJ、JST、CSA(NS)、IC、EMBASE
主要栏目：综述、动物及兽医生物技术、环境生物技术、工业生物技术、合成生物技术、农业生物技术、医药生物技术、组织工程与细胞培养、生物技术与方法、生物育种与工艺优化、高校生物学教学
- 2023年第39卷第3期
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2023,39(3):807-841, DOI: 10.13345/j.cjb.230097
摘要：
本文对2022年《生物工程学报》发表的与合成生物制造相关的综述和研究论文进行了评述,重点讨论了DNA测序、DNA合成、DNA编辑、基因表达调控和数学细胞模型等底层技术,酶的设计、改造和应用技术,化学品生物催化、氨基酸及其衍生物、有机酸、天然化合物、抗生素与活性肽、功能多糖、功能蛋白质等重要产品的生物制造技术,一碳化合物和生物质原料利用技术以及合成微生物组技术,以帮助读者从一个侧面了解合成生物制造相关技术和产业的发展情况。
本文对2022年《生物工程学报》发表的与合成生物制造相关的综述和研究论文进行了评述,重点讨论了DNA测序、DNA合成、DNA编辑、基因表达调控和数学细胞模型等底层技术,酶的设计、改造和应用技术,化学品生物催化、氨基酸及其衍生物、有机酸、天然化合物、抗生素与活性肽、功能多糖、功能蛋白质等重要产品的生物制造技术,一碳化合物和生物质原料利用技术以及合成微生物组技术,以帮助读者从一个侧面了解合成生物制造相关技术和产业的发展情况。
2023,39(3):842-857, DOI: 10.13345/j.cjb.220737
摘要：
现代生物发酵工业聚焦于设计和创制高效的微生物细胞工厂,以实现原料向目标产品的定向转化。评判微生物细胞工厂性能优劣的主要标准是其合成能力及稳定性。由于质粒系统存在拷贝数不稳定、易于丢失等局限性,在菌株改造中将基因或产物合成途径整合至染色体上实现稳定表达通常是更优的选择。因此,染色体的基因整合技术作为实现这一目标的重要手段已受到广泛关注,并得到快速发展。本综述梳理了近年来微生物染色体上的大片段DNA整合方法的研究进展,归纳了各种技术的原理和特点,尤其是新兴的CRISPR相关转座系统,同时对未来的发展重点和方向进行了展望。
现代生物发酵工业聚焦于设计和创制高效的微生物细胞工厂,以实现原料向目标产品的定向转化。评判微生物细胞工厂性能优劣的主要标准是其合成能力及稳定性。由于质粒系统存在拷贝数不稳定、易于丢失等局限性,在菌株改造中将基因或产物合成途径整合至染色体上实现稳定表达通常是更优的选择。因此,染色体的基因整合技术作为实现这一目标的重要手段已受到广泛关注,并得到快速发展。本综述梳理了近年来微生物染色体上的大片段DNA整合方法的研究进展,归纳了各种技术的原理和特点,尤其是新兴的CRISPR相关转座系统,同时对未来的发展重点和方向进行了展望。
2023,39(3):858-880, DOI: 10.13345/j.cjb.220773
摘要：
包括产电菌群和噬电菌群的人工电活性微生物菌群(synthetic electroactive microbial consortia)通过菌种间的物质能量级联反应介导化学能与(光)电能间的相互转化,其可利用底物来源广泛、双向电子传递速率快、环境稳定性强,在清洁电能开发、废水处理、环境修复、生物固碳固氮以及生物燃料、无机纳米材料、高聚物等高值化学品合成等多个领域具有广泛的应用前景。针对人工电活性微生物菌群设计、构建与应用,本文总结电活性微生物菌群界面电子传递和种间电子传递机制,概括基于"劳力分工"原理设计构建人工电活性微生物菌群物质能量级联反应基本架构,总结菌群关系与菌群生态位优化等人工电活性微生物菌群工程化策略,分类列举人工电活性微生物菌群在利用廉价生物质产电、生物光伏固碳产电,光驱噬电生物菌群固氮等相关应用。最后对人工电活性微生物菌群未来研究方向进行了展望。
包括产电菌群和噬电菌群的人工电活性微生物菌群(synthetic electroactive microbial consortia)通过菌种间的物质能量级联反应介导化学能与(光)电能间的相互转化,其可利用底物来源广泛、双向电子传递速率快、环境稳定性强,在清洁电能开发、废水处理、环境修复、生物固碳固氮以及生物燃料、无机纳米材料、高聚物等高值化学品合成等多个领域具有广泛的应用前景。针对人工电活性微生物菌群设计、构建与应用,本文总结电活性微生物菌群界面电子传递和种间电子传递机制,概括基于"劳力分工"原理设计构建人工电活性微生物菌群物质能量级联反应基本架构,总结菌群关系与菌群生态位优化等人工电活性微生物菌群工程化策略,分类列举人工电活性微生物菌群在利用廉价生物质产电、生物光伏固碳产电,光驱噬电生物菌群固氮等相关应用。最后对人工电活性微生物菌群未来研究方向进行了展望。
2023,39(3):881-897, DOI: 10.13345/j.cjb.220468
摘要：
面对日益严峻的能源紧缺与环境污染形势,电活性微生物(electroactive microorganisms)的电催化过程为实现绿色生产提供了新的思路。奥奈达希瓦氏菌具有独特的呼吸方式和电子传递能力,在微生物燃料电池、增值化学品的生物电合成、金属废物处理和环境修复系统等领域有着广泛的应用。奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1)电活性生物被膜是实现电活性微生物电子传递过程的优良载体,其形成过程十分复杂且受到多种因素的影响和调控,在增强细菌环境抗逆性、提高电子传递效率等多方面发挥着十分重要的作用。本文较为系统地综述了奥奈达希瓦氏菌生物被膜的形成过程、影响因素及其在生物能源、生物修复和生物传感中的相关应用,为进一步实现其在更多领域的应用提供了理论基础。
面对日益严峻的能源紧缺与环境污染形势,电活性微生物(electroactive microorganisms)的电催化过程为实现绿色生产提供了新的思路。奥奈达希瓦氏菌具有独特的呼吸方式和电子传递能力,在微生物燃料电池、增值化学品的生物电合成、金属废物处理和环境修复系统等领域有着广泛的应用。奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1)电活性生物被膜是实现电活性微生物电子传递过程的优良载体,其形成过程十分复杂且受到多种因素的影响和调控,在增强细菌环境抗逆性、提高电子传递效率等多方面发挥着十分重要的作用。本文较为系统地综述了奥奈达希瓦氏菌生物被膜的形成过程、影响因素及其在生物能源、生物修复和生物传感中的相关应用,为进一步实现其在更多领域的应用提供了理论基础。
2023,39(3):898-911, DOI: 10.13345/j.cjb.220484
摘要：
α-淀粉酶是一种内切糖苷水解酶,可以水解淀粉等多聚糖内部的α-1,4-糖苷键,生成低聚糖、糊精、麦芽三糖、麦芽糖和少量葡萄糖。由于α-淀粉酶在食品、人体健康监测和制药方面的重要作用,其活性检测广泛应用于工业生产菌株的选育、临床疾病的诊断、糖尿病药物的开发和食品质量的控制中。近年来,随着检测技术的发展,许多更加快速、灵敏的α-淀粉酶检测方法被开发出来。本文综述了近年来α-淀粉酶的检测方法和应用研究进展,分类介绍其检测原理和优缺点,并对未来α-淀粉酶检测方法提出展望,以期为α-淀粉酶检测方法的开发和应用提供参考。
α-淀粉酶是一种内切糖苷水解酶,可以水解淀粉等多聚糖内部的α-1,4-糖苷键,生成低聚糖、糊精、麦芽三糖、麦芽糖和少量葡萄糖。由于α-淀粉酶在食品、人体健康监测和制药方面的重要作用,其活性检测广泛应用于工业生产菌株的选育、临床疾病的诊断、糖尿病药物的开发和食品质量的控制中。近年来,随着检测技术的发展,许多更加快速、灵敏的α-淀粉酶检测方法被开发出来。本文综述了近年来α-淀粉酶的检测方法和应用研究进展,分类介绍其检测原理和优缺点,并对未来α-淀粉酶检测方法提出展望,以期为α-淀粉酶检测方法的开发和应用提供参考。
2023,39(3):912-929, DOI: 10.13345/j.cjb.220530
摘要：
壳聚糖酶是一类对壳聚糖具有较高催化活性而几乎不水解几丁质的糖苷水解酶,其可将高分子量的壳聚糖转化为低分子量的功能性壳寡糖。近年来,对壳聚糖酶的相关研究取得了显著进展,因此,本文对其生化性质、晶体结构、催化机制和蛋白质工程改造进行总结和探讨,并对酶法制备壳寡糖纯品进行展望,这将加深研究者对壳聚糖酶作用机制的认识,推动壳聚糖酶的工业应用。
壳聚糖酶是一类对壳聚糖具有较高催化活性而几乎不水解几丁质的糖苷水解酶,其可将高分子量的壳聚糖转化为低分子量的功能性壳寡糖。近年来,对壳聚糖酶的相关研究取得了显著进展,因此,本文对其生化性质、晶体结构、催化机制和蛋白质工程改造进行总结和探讨,并对酶法制备壳寡糖纯品进行展望,这将加深研究者对壳聚糖酶作用机制的认识,推动壳聚糖酶的工业应用。
2023,39(3):930-941, DOI: 10.13345/j.cjb.220623
摘要：
金属-有机框架(metal-organic frameworks, MOFs)作为酶固定化的优良载体,为生物催化反应提供优越的物理和化学保护。近年来,多级孔金属-有机框架(hierarchical porous metal-organic frameworks, HP-MOFs)由于其独特的结构优势,在固定化酶方面显示出更大的潜力。到目前为止,已经开发了各类具有原生多级孔或缺陷多级孔的HP-MOFs用于酶的固定化研究,并且使得固定化酶在催化活性、稳定性和重复利用性等方面得到了显著增强。本文系统总结了HP-MOFs用于固定化酶的各种策略,介绍了HP-MOFs固定化酶(enzyme@HP-MOFs)在催化合成、生物传感、生物医药等领域的最新应用进展。最后,讨论并展望了HP-MOFs固定化酶这一领域所面临的挑战和机遇。
金属-有机框架(metal-organic frameworks, MOFs)作为酶固定化的优良载体,为生物催化反应提供优越的物理和化学保护。近年来,多级孔金属-有机框架(hierarchical porous metal-organic frameworks, HP-MOFs)由于其独特的结构优势,在固定化酶方面显示出更大的潜力。到目前为止,已经开发了各类具有原生多级孔或缺陷多级孔的HP-MOFs用于酶的固定化研究,并且使得固定化酶在催化活性、稳定性和重复利用性等方面得到了显著增强。本文系统总结了HP-MOFs用于固定化酶的各种策略,介绍了HP-MOFs固定化酶(enzyme@HP-MOFs)在催化合成、生物传感、生物医药等领域的最新应用进展。最后,讨论并展望了HP-MOFs固定化酶这一领域所面临的挑战和机遇。
2023,39(3):942-960, DOI: 10.13345/j.cjb.220454
摘要：
胶原蛋白(collagen)是一类哺乳动物细胞外基质中的主要结构蛋白,广泛地存在于皮肤、骨骼、肌肉等组织中,主要参与细胞的增殖、分化、迁移和信号传递等生理生化行为,对组织细胞等起着支撑、修复、保护的作用。由于胶原蛋白具有良好的生物学特性,其在组织工程、临床医学、食品工业、包装材料、化妆品、医学美容、生物材料以及医疗器械等方面都有着广泛的应用。本文综述了胶原蛋白的生物学特性及其在国内外生物工程研究开发中的研究进展,并对胶原蛋白未来开发的前景进行了展望。
胶原蛋白(collagen)是一类哺乳动物细胞外基质中的主要结构蛋白,广泛地存在于皮肤、骨骼、肌肉等组织中,主要参与细胞的增殖、分化、迁移和信号传递等生理生化行为,对组织细胞等起着支撑、修复、保护的作用。由于胶原蛋白具有良好的生物学特性,其在组织工程、临床医学、食品工业、包装材料、化妆品、医学美容、生物材料以及医疗器械等方面都有着广泛的应用。本文综述了胶原蛋白的生物学特性及其在国内外生物工程研究开发中的研究进展,并对胶原蛋白未来开发的前景进行了展望。
2023,39(3):961-977, DOI: 10.13345/j.cjb.220486
摘要：
芳香族化合物是一类具有苯环结构的有机物,它们结构稳定,不易分解,并可通过食物链进行生物富集和生物放大,对生态环境及人类健康造成极大危害。细菌具有超强的分解代谢能力,能降解多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)等多种难降解芳香族污染物。吸附和转运是细菌进行芳香族化合物细胞内代谢的前提。虽然芳香族化合物的细菌降解已取得较为显著的研究进展,但吸附和转运机理仍不甚清楚。本文讨论了细菌对芳香族化合物的吸附有积极作用的细胞表面疏水性、生物被膜形成和细菌趋化性等影响因素,总结了FadL家族、TonB依赖性受体蛋白、OmpW家族等外膜转运系统和主要协同转运蛋白超家族(major facilitator superfamily, MFS)转运体、ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)转运蛋白等内膜转运系统对该类化合物跨膜运输作用,并对跨膜转运机制进行了讨论和阐述,旨在为芳香族污染物的防控和治理提供一定理论参考。
芳香族化合物是一类具有苯环结构的有机物,它们结构稳定,不易分解,并可通过食物链进行生物富集和生物放大,对生态环境及人类健康造成极大危害。细菌具有超强的分解代谢能力,能降解多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)等多种难降解芳香族污染物。吸附和转运是细菌进行芳香族化合物细胞内代谢的前提。虽然芳香族化合物的细菌降解已取得较为显著的研究进展,但吸附和转运机理仍不甚清楚。本文讨论了细菌对芳香族化合物的吸附有积极作用的细胞表面疏水性、生物被膜形成和细菌趋化性等影响因素,总结了FadL家族、TonB依赖性受体蛋白、OmpW家族等外膜转运系统和主要协同转运蛋白超家族(major facilitator superfamily, MFS)转运体、ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)转运蛋白等内膜转运系统对该类化合物跨膜运输作用,并对跨膜转运机制进行了讨论和阐述,旨在为芳香族污染物的防控和治理提供一定理论参考。
2023,39(3):978-992, DOI: 10.13345/j.cjb.220492
摘要：
人参皂苷Compound K (CK)是一种具有抗癌抗炎等药理活性的化合物。目前在天然人参中暂未鉴定出,工业上主要通过原人参二醇型皂苷的去糖基化进行制备。相对于传统的物理、化学的去糖基化法,利用原人参二醇型皂苷水解酶制备CK具有特异性强、绿色环保和高效稳定的优点。本文根据水解酶作用的糖基连接碳原子的差异将原人参二醇型皂苷水解酶分成了3类,发现大多数能制备CK的水解酶为Ⅲ型原人参二醇型皂苷水解酶。此外,对水解酶在制备CK中的应用进行了总结评估,旨在为人参皂苷CK的大规模制备及其在食品和药品行业中的开发提供参考。
人参皂苷Compound K (CK)是一种具有抗癌抗炎等药理活性的化合物。目前在天然人参中暂未鉴定出,工业上主要通过原人参二醇型皂苷的去糖基化进行制备。相对于传统的物理、化学的去糖基化法,利用原人参二醇型皂苷水解酶制备CK具有特异性强、绿色环保和高效稳定的优点。本文根据水解酶作用的糖基连接碳原子的差异将原人参二醇型皂苷水解酶分成了3类,发现大多数能制备CK的水解酶为Ⅲ型原人参二醇型皂苷水解酶。此外,对水解酶在制备CK中的应用进行了总结评估,旨在为人参皂苷CK的大规模制备及其在食品和药品行业中的开发提供参考。
2023,39(3):993-1008, DOI: 10.13345/j.cjb.220781
摘要：
合成生物学技术的快速发展极大提升了微生物细胞工厂的构建能力,为化学品的绿色高效生产提供了重要策略。然而,微生物细胞难以耐受高强度工业环境、抗逆性差,成为了限制其生产性能的关键因素。适应性进化是一种人为施加定向选择压力,使微生物经过长期或短期驯化,获得适应特定环境的表型或生理性能的重要方法。近年来,随着微流控、生物传感器、组学分析等技术的发展,适应性进化为提升微生物细胞在工业环境下的生产性能奠定了基础。本文论述了适应性进化的关键技术及在提高微生物细胞工厂环境耐受性和生产效率方面的重要应用,并展望了适应性进化实现微生物细胞工厂在工业环境下高效运行的重要前景。
合成生物学技术的快速发展极大提升了微生物细胞工厂的构建能力,为化学品的绿色高效生产提供了重要策略。然而,微生物细胞难以耐受高强度工业环境、抗逆性差,成为了限制其生产性能的关键因素。适应性进化是一种人为施加定向选择压力,使微生物经过长期或短期驯化,获得适应特定环境的表型或生理性能的重要方法。近年来,随着微流控、生物传感器、组学分析等技术的发展,适应性进化为提升微生物细胞在工业环境下的生产性能奠定了基础。本文论述了适应性进化的关键技术及在提高微生物细胞工厂环境耐受性和生产效率方面的重要应用,并展望了适应性进化实现微生物细胞工厂在工业环境下高效运行的重要前景。
2023,39(3):1009-1025, DOI: 10.13345/j.cjb.220634
摘要：
水体富营养化是当前水环境保护工作的重点关注问题,微生物修复富营养化水体具有高效、低耗且不产生二次污染等特点,已经成为富营养化水体生态修复的一种重要方式。近年来,对反硝化聚磷菌的研究及其在污水处理工艺中的应用越来越广泛。不同于传统的反硝化细菌联合聚磷菌去除氮磷工艺,反硝化聚磷菌在交替厌氧、缺氧/好氧条件下能同时进行脱氮除磷而被广泛关注与研究。值得注意的是,近几年报道的部分微生物仅在好氧条件下就可进行同时脱氮除磷,但是其脱氮除磷机理仍未理清。基于此,文中总结了目前发现的反硝化聚磷菌和同时硝化反硝化聚磷微生物的种类及特点,并对其脱氮与除磷的关系及其机理进行了系统性分析,对目前反硝化除磷存在的问题进行了梳理,最后对今后的研究方向进行了展望,以期为完善反硝化聚磷菌的脱氮除磷机理及工艺改进提供参考。
水体富营养化是当前水环境保护工作的重点关注问题,微生物修复富营养化水体具有高效、低耗且不产生二次污染等特点,已经成为富营养化水体生态修复的一种重要方式。近年来,对反硝化聚磷菌的研究及其在污水处理工艺中的应用越来越广泛。不同于传统的反硝化细菌联合聚磷菌去除氮磷工艺,反硝化聚磷菌在交替厌氧、缺氧/好氧条件下能同时进行脱氮除磷而被广泛关注与研究。值得注意的是,近几年报道的部分微生物仅在好氧条件下就可进行同时脱氮除磷,但是其脱氮除磷机理仍未理清。基于此,文中总结了目前发现的反硝化聚磷菌和同时硝化反硝化聚磷微生物的种类及特点,并对其脱氮与除磷的关系及其机理进行了系统性分析,对目前反硝化除磷存在的问题进行了梳理,最后对今后的研究方向进行了展望,以期为完善反硝化聚磷菌的脱氮除磷机理及工艺改进提供参考。
2023,39(3):1026-1039, DOI: 10.13345/j.cjb.220769
摘要：
ZnO和CuO纳米颗粒(nanoparticles, NPs)在研究、医学和工业等领域的广泛使用,已引起人们对其生物安全性的忧虑。相关学者已在污水处理系统中检测到ZnO NPs和CuO NPs,由于其独特的理化性质,低含量NPs就对微生物群落结构和生长代谢产生毒性,进而影响污水脱氮的稳定运行。本文综述了ZnO NPs和CuO NPs对生物脱氮系统中相关功能细菌的毒性及机制,并总结了通过调节水环境因素(如pH值、离子强度、离子类型和天然有机物等)缓解ZnO NPs和CuO NPs的细胞毒性,以期为今后缓解和应急调控金属纳米颗粒(metal oxide nanoparticles, MONPs)对污水处理系统的冲击提供理论基础和支撑。
ZnO和CuO纳米颗粒(nanoparticles, NPs)在研究、医学和工业等领域的广泛使用,已引起人们对其生物安全性的忧虑。相关学者已在污水处理系统中检测到ZnO NPs和CuO NPs,由于其独特的理化性质,低含量NPs就对微生物群落结构和生长代谢产生毒性,进而影响污水脱氮的稳定运行。本文综述了ZnO NPs和CuO NPs对生物脱氮系统中相关功能细菌的毒性及机制,并总结了通过调节水环境因素(如pH值、离子强度、离子类型和天然有机物等)缓解ZnO NPs和CuO NPs的细胞毒性,以期为今后缓解和应急调控金属纳米颗粒(metal oxide nanoparticles, MONPs)对污水处理系统的冲击提供理论基础和支撑。
2023,39(3):1040-1055, DOI: 10.13345/j.cjb.220789
摘要：
典型固体废物(废电器、废电池、污泥、焚烧飞灰、废催化剂等)含有大量金属资源,回收再利用的价值极高。微生物浸出典型固体废物受多因素影响。对不同微生物浸出金属的菌种筛选、浸出规律和机理的掌握,有助于典型固体废物中金属资源的绿色高效回收,可为我国"双碳"目标作出贡献。本文综述了从典型固体废物中浸出金属的各类微生物,分析了冶金微生物的作用机制,并展望了微生物冶金的应用前景,以期为微生物冶金技术在典型固体废物中的高效应用提供理论参考。
典型固体废物(废电器、废电池、污泥、焚烧飞灰、废催化剂等)含有大量金属资源,回收再利用的价值极高。微生物浸出典型固体废物受多因素影响。对不同微生物浸出金属的菌种筛选、浸出规律和机理的掌握,有助于典型固体废物中金属资源的绿色高效回收,可为我国"双碳"目标作出贡献。本文综述了从典型固体废物中浸出金属的各类微生物,分析了冶金微生物的作用机制,并展望了微生物冶金的应用前景,以期为微生物冶金技术在典型固体废物中的高效应用提供理论参考。
2023,39(3):1056-1069, DOI: 10.13345/j.cjb.220548
摘要：
甾体药物(steroid drugs)是一类具有重要生理和药理作用的药物。目前,甾药行业主要通过分枝杆菌(Mycobacteria)转化制备系列重要甾药中间体,再经过必要的化学修饰或酶法修饰获得高端甾体药物。较之前的"薯蓣皂素-双烯醇酮"体系具有原料廉价且来源丰富、生产成本低且反应路线短、收率高且环境友好等优点。基于基因组学和代谢组学进一步揭示分枝杆菌甾醇降解途径中关键酶系及其催化机理,使分枝杆菌作为底盘细胞成为可能。本文对不同物种类固醇转化酶的发现、分枝杆菌自源基因和异源基因过表达的改造以及分枝杆菌作为底盘细胞的优化和修饰等方面的研究进展进行了综述。
甾体药物(steroid drugs)是一类具有重要生理和药理作用的药物。目前,甾药行业主要通过分枝杆菌(Mycobacteria)转化制备系列重要甾药中间体,再经过必要的化学修饰或酶法修饰获得高端甾体药物。较之前的"薯蓣皂素-双烯醇酮"体系具有原料廉价且来源丰富、生产成本低且反应路线短、收率高且环境友好等优点。基于基因组学和代谢组学进一步揭示分枝杆菌甾醇降解途径中关键酶系及其催化机理,使分枝杆菌作为底盘细胞成为可能。本文对不同物种类固醇转化酶的发现、分枝杆菌自源基因和异源基因过表达的改造以及分枝杆菌作为底盘细胞的优化和修饰等方面的研究进展进行了综述。
2023,39(3):1070-1082, DOI: 10.13345/j.cjb.220540
摘要：
本研究旨在建立光发酵培养三角褐指藻高效生产岩藻黄素的技术体系。在5 L光发酵罐中,系统研究了兼养条件下初始光强、氮源种类和浓度以及光质对于三角褐指藻生物量浓度和岩藻黄素积累的效果。结果表明,在初始光强为100 μmol/(m2·s)红蓝(R:B=6:1)混合光、含氮量为0.02 mol/L的胰蛋白胨和尿素混合氮源(1:1, N mol/N mol)优化条件下,三角褐指藻生物量浓度、岩藻黄素含量和产率分别达到了最大值3.80 g/L、13.44 mg/g和4.70 mg/(L·d),比优化前分别提高了1.41、1.33和2.05倍。本研究开发了强化三角褐指藻光发酵生产岩藻黄素的关键技术,促进了海洋天然产物开发。
本研究旨在建立光发酵培养三角褐指藻高效生产岩藻黄素的技术体系。在5 L光发酵罐中,系统研究了兼养条件下初始光强、氮源种类和浓度以及光质对于三角褐指藻生物量浓度和岩藻黄素积累的效果。结果表明,在初始光强为100 μmol/(m2·s)红蓝(R:B=6:1)混合光、含氮量为0.02 mol/L的胰蛋白胨和尿素混合氮源(1:1, N mol/N mol)优化条件下,三角褐指藻生物量浓度、岩藻黄素含量和产率分别达到了最大值3.80 g/L、13.44 mg/g和4.70 mg/(L·d),比优化前分别提高了1.41、1.33和2.05倍。本研究开发了强化三角褐指藻光发酵生产岩藻黄素的关键技术,促进了海洋天然产物开发。
2023,39(3):1083-1095, DOI: 10.13345/j.cjb.220542
摘要：
秸秆生物炼制化学品是解决秸秆资源利用附加值低、减轻秸秆焚烧带来的环境污染的主要方法之一。本研究制备了结冷胶固定化保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus) T15凝胶珠(结冷胶-T15凝胶珠),并对其性质进行表征,建立了结冷胶-T15凝胶珠固定化细胞循环连续发酵产d-乳酸发酵工艺。结冷胶-T15凝胶珠的断裂应力为(91.68±0.11) kPa,较海藻酸钙固定化T15凝胶珠(海藻酸钙-T15凝胶珠) 提高了125.12%,表明结冷胶-T15凝胶珠的强度更强。以结冷胶-T15凝胶珠为出发菌株,葡萄糖为发酵基质,10批次循环(720 h)发酵,其d-乳酸最高批次产量为(72.90±2.79) g/L,较海藻酸钙-T15凝胶珠提高了33.85%,较游离T15提高了37.70%。将葡萄糖更换为玉米秸秆酶解液,使用结冷胶-T15凝胶珠进行10批次循环(240 h)发酵,d-乳酸生产强度可达(1.74±0.79) g/(L×h),远高于游离菌。10批次循环发酵后结冷胶-T15凝胶珠磨损率小于5%,表明结冷胶是一种细胞固定化的良好载体,可广泛应用于细胞固定化工业发酵领域。本研究为细胞循环发酵产d-乳酸工业化生产提供基础数据,为玉米秸秆生物炼制d-乳酸提供了新途径。
秸秆生物炼制化学品是解决秸秆资源利用附加值低、减轻秸秆焚烧带来的环境污染的主要方法之一。本研究制备了结冷胶固定化保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus) T15凝胶珠(结冷胶-T15凝胶珠),并对其性质进行表征,建立了结冷胶-T15凝胶珠固定化细胞循环连续发酵产d-乳酸发酵工艺。结冷胶-T15凝胶珠的断裂应力为(91.68±0.11) kPa,较海藻酸钙固定化T15凝胶珠(海藻酸钙-T15凝胶珠) 提高了125.12%,表明结冷胶-T15凝胶珠的强度更强。以结冷胶-T15凝胶珠为出发菌株,葡萄糖为发酵基质,10批次循环(720 h)发酵,其d-乳酸最高批次产量为(72.90±2.79) g/L,较海藻酸钙-T15凝胶珠提高了33.85%,较游离T15提高了37.70%。将葡萄糖更换为玉米秸秆酶解液,使用结冷胶-T15凝胶珠进行10批次循环(240 h)发酵,d-乳酸生产强度可达(1.74±0.79) g/(L
2023,39(3):1096-1106, DOI: 10.13345/j.cjb.220642
摘要：
l-天冬酰胺酶(l-asparaginase, l-ASN)广泛用于恶性肿瘤治疗及低丙烯酰胺食品生产,然而其较低的表达水平限制了应用推广。异源蛋白表达是提高目标酶表达水平的有效策略,芽胞杆菌广泛用于酶蛋白的高效生产,本研究拟通过表达元件及宿主优化提高芽胞杆菌(Bacillus)中l-天冬酰胺酶产量。首先,筛选了5种信号肽(SPSacC、SPAmyL、SPAprE、SPYwbN、SPWapA)用于l-天冬酰胺酶的分泌表达,其中SPSacC介导下l-天冬酰胺酶分泌效果最好,酶活达到157.61 U/mL。随后,选取了4种芽胞杆菌强启动子(P43、PykzA-P43、PUbay、PbacA),其中串联启动子PykzA-P43介导的l-天冬酰胺酶表达量最高,较对照菌株提高了52.94%。最后,筛选了3种芽胞杆菌表达宿主:地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis) Δ0F3和BL10、枯草芽胞杆菌(B. subtilis) WB800,其中,地衣芽胞杆菌BL10作为宿主时,l-天冬酰胺酶酶活最高,达到了438.3 U/mL,较对照菌株提高了81.83%,为目前报道的l-天冬酰胺酶摇瓶酶活最高水平。综上所述,本研究成功构建了一株高产l-天冬酰胺酶的地衣芽胞杆菌工程菌株BL10/PykzA-P43-SPsacC-ansZ,为l-天冬酰胺酶工业化生产奠定了基础。
l-天冬酰胺酶(l-asparaginase, l-ASN)广泛用于恶性肿瘤治疗及低丙烯酰胺食品生产,然而其较低的表达水平限制了应用推广。异源蛋白表达是提高目标酶表达水平的有效策略,芽胞杆菌广泛用于酶蛋白的高效生产,本研究拟通过表达元件及宿主优化提高芽胞杆菌(Bacillus)中l-天冬酰胺酶产量。首先,筛选了5种信号肽(SPSacC、SPAmyL、SPAprE、SPYwbN、SPWapA)用于l-天冬酰胺酶的分泌表达,其中SPSacC介导下l-天冬酰胺酶分泌效果最好,酶活达到157.61 U/mL。随后,选取了4种芽胞杆菌强启动子(P43、PykzA-P43、PUbay、PbacA),其中串联启动子PykzA-P43介导的l-天冬酰胺酶表达量最高,较对照菌株提高了52.94%。最后,筛选了3种芽胞杆菌表达宿主:地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis) Δ0F3和BL10、枯草芽胞杆菌(B. subtilis) WB800,其中,地衣芽胞杆菌BL10作为宿主时,l-天冬酰胺酶酶活最高,达到了438.3 U/mL,较对照菌株提高了81.83%,为目前报道的l-天冬酰胺酶摇瓶酶活最高水平。综上所述,本研究成功构建了一株高产l-天冬酰胺酶的地衣芽胞杆菌工程菌株BL10/PykzA-P43-SPsacC-ansZ,为l-天冬酰胺酶工业化生产奠定了基础。
2023,39(3):1107-1118, DOI: 10.13345/j.cjb.220805
摘要：
l-阿拉伯糖异构酶(l-arabinose isomerase, l-AI)是d-半乳糖异构化生成d-塔格糖的关键酶。为提高l-阿拉伯糖异构酶对d-半乳糖的活性及在生物转化中的转化率,本研究对发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) CGMCC2921来源的l-阿拉伯糖异构酶进行重组表达和生物转化应用,并对其底物结合口袋进行理性设计以提高酶对d-半乳糖亲和力和催化活性。结果显示,突变体F279I对d-半乳糖的转化率提高至野生型酶的1.4倍,进一步叠加获得的双突变体M185A/F279I的Km和kcat分别为530.8 mmol/L与19.9 s-1,底物亲和力显著提高,催化效率提高至野生型酶的8.2倍。以400 g/L乳糖为底物时,突变酶M185A/F279I转化率高达22.8%。本研究在乳糖高值化生产塔格糖方面具有重要的应用价值。
l-阿拉伯糖异构酶(l-arabinose isomerase, l-AI)是d-半乳糖异构化生成d-塔格糖的关键酶。为提高l-阿拉伯糖异构酶对d-半乳糖的活性及在生物转化中的转化率,本研究对发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) CGMCC2921来源的l-阿拉伯糖异构酶进行重组表达和生物转化应用,并对其底物结合口袋进行理性设计以提高酶对d-半乳糖亲和力和催化活性。结果显示,突变体F279I对d-半乳糖的转化率提高至野生型酶的1.4倍,进一步叠加获得的双突变体M185A/F279I的Km和kcat分别为530.8 mmol/L与19.9 s-1,底物亲和力显著提高,催化效率提高至野生型酶的8.2倍。以400 g/L乳糖为底物时,突变酶M185A/F279I转化率高达22.8%。本研究在乳糖高值化生产塔格糖方面具有重要的应用价值。
2023,39(3):1119-1130, DOI: 10.13345/j.cjb.220504
摘要：
血红素是一种广泛存在于生物体中的卟啉类化合物,具有多种生理功能。解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有易于培养、分泌表达能力较强等特点,是一种重要的工业菌株。为了筛选血红素合成的最优出发菌株,以不添加和添加5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)的方式,对实验室保藏菌株进行筛选,发现不添加ALA时,菌株BA、BAΔ6、BAΔ6ΔsigF的血红素产量无明显差别;然而添加ALA后,BAΔ6ΔsigF的血红素产量和比生产能力均为最高,分别达到200.77μmol/L和615.70 μmol/(L·g DCW)。因此,以BAΔ6ΔsigF为出发菌株,敲除编码细胞色素组装蛋白HemX的hemX基因,探究其在血红素合成途径中的作用,发现敲除菌株发酵液明显变红,且生长未受到明显影响;摇瓶发酵12 h时ALA浓度最高,为82.13 mg/L,略高于对照的75.11 mg/L;不添加ALA时,血红素产量和比生产能力分别为对照的1.99倍和1.45倍;添加ALA后,血红素产量和比生产能力分别为对照的2.08倍和1.72倍;实时定量荧光PCR (real-time quantitative fluorescent PCR, RT-qPCR)表明,hemA、hemL、hemB、hemC、hemD、hemQ基因的转录水平上调。说明hemX基因的缺失可提高血红素产量,这为高产血红素菌株的开发奠定了基础。
血红素是一种广泛存在于生物体中的卟啉类化合物,具有多种生理功能。解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有易于培养、分泌表达能力较强等特点,是一种重要的工业菌株。为了筛选血红素合成的最优出发菌株,以不添加和添加5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)的方式,对实验室保藏菌株进行筛选,发现不添加ALA时,菌株BA、BAΔ6、BAΔ6ΔsigF的血红素产量无明显差别;然而添加ALA后,BAΔ6ΔsigF的血红素产量和比生产能力均为最高,分别达到200.77μmol/L和615.70 μmol/(L·g DCW)。因此,以BAΔ6ΔsigF为出发菌株,敲除编码细胞色素组装蛋白HemX的hemX基因,探究其在血红素合成途径中的作用,发现敲除菌株发酵液明显变红,且生长未受到明显影响;摇瓶发酵12 h时ALA浓度最高,为82.13 mg/L,略高于对照的75.11 mg/L;不添加ALA时,血红素产量和比生产能力分别为对照的1.99倍和1.45倍;添加ALA后,血红素产量和比生产能力分别为对照的2.08倍和1.72倍;实时定量荧光PCR (real-time quantitative fluorescent PCR, RT-qPCR)表明,hemA、hemL、hemB、hemC、hemD、hemQ基因的转录水平上调。说明hemX基因的缺失可提高血红素产量,这为高产血红素菌株的开发奠定了基础。
2023,39(3):1131-1141, DOI: 10.13345/j.cjb.220848
摘要：
来源于鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium siyangensis)中的α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase, SAET),是目前发现的丙谷二肽催化合成能力最高的酶之一,能够以非保护的l-丙氨酸甲酯盐酸盐、l-谷氨酰胺合成l-丙氨酰-l-谷氨酰胺[即丙谷二肽(l-alanyl-l-glutamine, Ala-Gln)]。为了解决其在催化过程中的稳定问题,本研究在水相体系中采用"一步法"快速制备固定化细胞(SAET@ZIF-8),在构筑金属有机沸石咪唑骨架结构(ZIF-8)的同时,将表达有SAET的大肠杆菌(Escherichia coli)包裹在其内部空间中。在此基础上,对其结构、催化活性和重复使用性及储存稳定性等催化性能进行探究。结果表明,通过该方法制备的SAET@ZIF-8纳米颗粒与文献报道的ZIF-8材料的形貌基本相同,细胞的引入没有明显改变ZIF-8的形貌。重复使用7次后,SAET@ZIF-8仍能保持67%左右的初始酶活;室温下放置4 d时,固定化酶还保留有50%左右的初始酶活,表明SAET@ZIF-8具有较好的重复使用及储存稳定性。将SAET@ZIF-8用于丙谷二肽的催化实验中,当反应30 min后丙谷二肽的浓度达到62.83 mmol/L (13.65 g/L),时空产率达到0.455 g/(L·min),相对于谷氨酰胺的转化率为62.83%。以上结果表明,基于金属有机沸石咪唑骨架的固定化细胞是一种高效制备丙谷二肽的方法策略。
来源于鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium siyangensis)中的α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase, SAET),是目前发现的丙谷二肽催化合成能力最高的酶之一,能够以非保护的l-丙氨酸甲酯盐酸盐、l-谷氨酰胺合成l-丙氨酰-l-谷氨酰胺[即丙谷二肽(l-alanyl-l-glutamine, Ala-Gln)]。为了解决其在催化过程中的稳定问题,本研究在水相体系中采用"一步法"快速制备固定化细胞(SAET@ZIF-8),在构筑金属有机沸石咪唑骨架结构(ZIF-8)的同时,将表达有SAET的大肠杆菌(Escherichia coli)包裹在其内部空间中。在此基础上,对其结构、催化活性和重复使用性及储存稳定性等催化性能进行探究。结果表明,通过该方法制备的SAET@ZIF-8纳米颗粒与文献报道的ZIF-8材料的形貌基本相同,细胞的引入没有明显改变ZIF-8的形貌。重复使用7次后,SAET@ZIF-8仍能保持67%左右的初始酶活;室温下放置4 d时,固定化酶还保留有50%左右的初始酶活,表明SAET@ZIF-8具有较好的重复使用及储存稳定性。将SAET@ZIF-8用于丙谷二肽的催化实验中,当反应30 min后丙谷二肽的浓度达到62.83 mmol/L (13.65 g/L),时空产率达到0.455 g/(L·min),相对于谷氨酰胺的转化率为62.83%。以上结果表明,基于金属有机沸石咪唑骨架的固定化细胞是一种高效制备丙谷二肽的方法策略。
2023,39(3):1142-1162, DOI: 10.13345/j.cjb.220757
摘要：
裂解作为合成生物学中的常见功能模块单元,在基因线路设计方面具有广泛的运用。裂解主要通过诱导表达噬菌体的裂解基因盒子实现,不过,尚未有关于裂解基因的详细表征。本研究首先利用阿拉伯糖和鼠李糖诱导系统在大肠杆菌(Escherichia coli) Top10表达了5种裂解基因盒子(S105, A52G, C51S S76C,LKD, LUZ),通过OD600值的测量,表征了在不同生长阶段、诱导剂浓度、质粒拷贝数等条件下,含有不同裂解基因盒子的大肠杆菌菌株Top10的裂解行为。结果表明,虽然5种裂解基因盒子在大肠杆菌内都可以有效引起宿主的裂解,但是裂解行为在不同条件下有较大差异。进一步地,由于诱导系统在不同宿主之间背景表达水平的差异,导致在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PAO1中难以构建可诱导的裂解系统。经过筛选,通过基因组插入的方式,利用鼠李糖诱导系统对裂解基因盒子在铜绿假单胞菌中引起的裂解行为进行表征。结果显示,LUZ和LKD具有较强的使铜绿假单胞菌裂解的能力,而S105、A52G、C51S S76C对铜绿假单胞菌的裂解能力较差。最后,利用LUZ和光遗传学工具BphS,通过调整核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)的强度,构建了可在指定表面黏附并裂解的工程菌Q16,该菌株具有应用于表面修饰的巨大潜力。
裂解作为合成生物学中的常见功能模块单元,在基因线路设计方面具有广泛的运用。裂解主要通过诱导表达噬菌体的裂解基因盒子实现,不过,尚未有关于裂解基因的详细表征。本研究首先利用阿拉伯糖和鼠李糖诱导系统在大肠杆菌(Escherichia coli) Top10表达了5种裂解基因盒子(S105, A52G, C51S S76C,LKD, LUZ),通过OD600值的测量,表征了在不同生长阶段、诱导剂浓度、质粒拷贝数等条件下,含有不同裂解基因盒子的大肠杆菌菌株Top10的裂解行为。结果表明,虽然5种裂解基因盒子在大肠杆菌内都可以有效引起宿主的裂解,但是裂解行为在不同条件下有较大差异。进一步地,由于诱导系统在不同宿主之间背景表达水平的差异,导致在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PAO1中难以构建可诱导的裂解系统。经过筛选,通过基因组插入的方式,利用鼠李糖诱导系统对裂解基因盒子在铜绿假单胞菌中引起的裂解行为进行表征。结果显示,LUZ和LKD具有较强的使铜绿假单胞菌裂解的能力,而S105、A52G、C51S S76C对铜绿假单胞菌的裂解能力较差。最后,利用LUZ和光遗传学工具BphS,通过调整核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)的强度,构建了可在指定表面黏附并裂解的工程菌Q16,该菌株具有应用于表面修饰的巨大潜力。
2023,39(3):1163-1174, DOI: 10.13345/j.cjb.220810
摘要：
生物活材料的研究主要集中在利用单一细菌生产生物膜、水塑料等体外应用。由于菌株尺寸较小,当其应用于体内时,容易发生逃逸,导致滞留效果较差。为解决这一难题,本研究借助大肠杆菌(Escherichia coli)表面展示系统(Neae),在两个菌株表面分别展示SpyTag和SpyCatcher,构建一种双菌"锁扣"型生物活材料生产系统。两菌株之间通过SpyTag和SpyCatcher的结合,发生原位交联,从而长时间滞留在肠道部位。体外实验表明两菌株混合几分钟后,会发生明显的沉降。此外,利用共聚焦成像和微流控平台进一步证明了该系统在流动状态下的粘附效果。最后,为了验证该系统在体内应用的可行性,小鼠连续3 d口服A菌(p15A-Neae-SpyTag/sfGFP)和B菌(p15A-Neae-SpyCatcher/mCherry),收集肠道组织进行冷冻切片染色。结果表明,相较于未结合菌株,该双菌系统能更多滞留在小鼠肠道,为生物活材料进一步的体内应用奠定了基础。
生物活材料的研究主要集中在利用单一细菌生产生物膜、水塑料等体外应用。由于菌株尺寸较小,当其应用于体内时,容易发生逃逸,导致滞留效果较差。为解决这一难题,本研究借助大肠杆菌(Escherichia coli)表面展示系统(Neae),在两个菌株表面分别展示SpyTag和SpyCatcher,构建一种双菌"锁扣"型生物活材料生产系统。两菌株之间通过SpyTag和SpyCatcher的结合,发生原位交联,从而长时间滞留在肠道部位。体外实验表明两菌株混合几分钟后,会发生明显的沉降。此外,利用共聚焦成像和微流控平台进一步证明了该系统在流动状态下的粘附效果。最后,为了验证该系统在体内应用的可行性,小鼠连续3 d口服A菌(p15A-Neae-SpyTag/sfGFP)和B菌(p15A-Neae-SpyCatcher/mCherry),收集肠道组织进行冷冻切片染色。结果表明,相较于未结合菌株,该双菌系统能更多滞留在小鼠肠道,为生物活材料进一步的体内应用奠定了基础。
2023,39(3):1175-1187, DOI: 10.13345/j.cjb.220568
摘要：
为了明确鸡粪好氧堆肥过程中细菌群落结构和功能的变化,采用高通量测序技术测定了好氧堆肥前、中、后3个时期样品的16S rRNA基因序列,并进行了生物信息学分析。结果表明, 3个堆肥阶段中仅有10%左右的分类操作单元(operational taxonomic units, OTUs)具有阶段特异性;不同发酵阶段细菌α多样性指数ACE、Chao1和Simpson均呈现先升高后降低的趋势,但各阶段间差异不显著(P<0.05)。3个发酵阶段优势菌门类相同,但丰度存在差异。线性判别分析[line discriminant analysis (LDA) effect size, LEfSe]法对细菌生物标志分析表明,从门到属水平共有49个物种,堆肥前期样品组中显著富集的物种最多,后期最少。原核分类群功能注释(functional annotation of prokaryotic taxa,FAPROTAX)对细菌功能多样性分析表明,堆肥前期细菌功能多样性最高,而随着发酵进行细菌功能富集程度增加、多样性降低。该研究为畜禽粪污好氧堆肥过程调控提供理论支撑和技术指导。
为了明确鸡粪好氧堆肥过程中细菌群落结构和功能的变化,采用高通量测序技术测定了好氧堆肥前、中、后3个时期样品的16S rRNA基因序列,并进行了生物信息学分析。结果表明, 3个堆肥阶段中仅有10%左右的分类操作单元(operational taxonomic units, OTUs)具有阶段特异性;不同发酵阶段细菌α多样性指数ACE、Chao1和Simpson均呈现先升高后降低的趋势,但各阶段间差异不显著(P<0.05)。3个发酵阶段优势菌门类相同,但丰度存在差异。线性判别分析[line discriminant analysis (LDA) effect size, LEfSe]法对细菌生物标志分析表明,从门到属水平共有49个物种,堆肥前期样品组中显著富集的物种最多,后期最少。原核分类群功能注释(functional annotation of prokaryotic taxa,FAPROTAX)对细菌功能多样性分析表明,堆肥前期细菌功能多样性最高,而随着发酵进行细菌功能富集程度增加、多样性降低。该研究为畜禽粪污好氧堆肥过程调控提供理论支撑和技术指导。
2023,39(3):1188-1201, DOI: 10.13345/j.cjb.220761
摘要：
为探究聚苯乙烯纳米塑料-植物蛋白冠的形成过程以及蛋白冠的形成对植物可能造成的影响,本研究选用3种平均粒径为200 nm不同表面修饰的聚苯乙烯纳米塑料微球和新几内亚凤仙(Impatiens hawkeri)为对象,将3种聚苯乙烯纳米塑料分别与新几内亚凤仙的叶蛋白提取物进行反应,反应时间分别为2、4、8、16、24、36 h。利用扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)观察其形貌变化,原子力显微镜(atomic force microscopy, AFM)进行表面粗糙度测定,使用纳米粒度和zeta电位分析仪测定水合粒径及zeta电位,液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)鉴定蛋白冠的蛋白成分。从生物学过程、细胞组分以及分子功能3个方面对蛋白进行分类,研究不同表面修饰的纳米塑料对蛋白的吸附选择,探究聚苯乙烯纳米塑料-植物蛋白冠的形成与特征,预测蛋白冠对植物造成的可能影响。结果表明:随着反应时间增加,纳米塑料的形貌变化越发明显,表现为尺寸和粗糙度的增加和稳定性的增强,由此证明了蛋白冠的形成;在相同蛋白浓度条件下,3种聚苯乙烯纳米塑料与叶蛋白形成蛋白冠的过程中,由软蛋白冠到硬蛋白冠的转化速度基本一致;在与叶蛋白进行反应时,3种纳米塑料对不同等电点和分子量蛋白的吸附选择存在差异,最终形成的蛋白冠的粒径和稳定性也存在差异,氨基修饰纳米塑料对蛋白质的吸附能力更强,形成的硬蛋白冠的稳定性强于羧基修饰纳米塑料和无修饰纳米塑料;由于蛋白冠的蛋白组分中很大一部分参与植物的光合作用,由此推测,蛋白冠的形成可能对新几内亚凤仙的光合作用产生影响。
为探究聚苯乙烯纳米塑料-植物蛋白冠的形成过程以及蛋白冠的形成对植物可能造成的影响,本研究选用3种平均粒径为200 nm不同表面修饰的聚苯乙烯纳米塑料微球和新几内亚凤仙(Impatiens hawkeri)为对象,将3种聚苯乙烯纳米塑料分别与新几内亚凤仙的叶蛋白提取物进行反应,反应时间分别为2、4、8、16、24、36 h。利用扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)观察其形貌变化,原子力显微镜(atomic force microscopy, AFM)进行表面粗糙度测定,使用纳米粒度和zeta电位分析仪测定水合粒径及zeta电位,液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)鉴定蛋白冠的蛋白成分。从生物学过程、细胞组分以及分子功能3个方面对蛋白进行分类,研究不同表面修饰的纳米塑料对蛋白的吸附选择,探究聚苯乙烯纳米塑料-植物蛋白冠的形成与特征,预测蛋白冠对植物造成的可能影响。结果表明:随着反应时间增加,纳米塑料的形貌变化越发明显,表现为尺寸和粗糙度的增加和稳定性的增强,由此证明了蛋白冠的形成;在相同蛋白浓度条件下,3种聚苯乙烯纳米塑料与叶蛋白形成蛋白冠的过程中,由软蛋白冠到硬蛋白冠的转化速度基本一致;在与叶蛋白进行反应时,3种纳米塑料对不同等电点和分子量蛋白的吸附选择存在差异,最终形成的蛋白冠的粒径和稳定性也存在差异,氨基修饰纳米塑料对蛋白质的吸附能力更强,形成的硬蛋白冠的稳定性强于羧基修饰纳米塑料和无修饰纳米塑料;由于蛋白冠的蛋白组分中很大一部分参与植物的光合作用,由此推测,蛋白冠的形成可能对新几内亚凤仙的光合作用产生影响。
2023,39(3):1202-1216, DOI: 10.13345/j.cjb.220822
摘要：
由微生物介导的吡啶降解技术是解决高盐吡啶环境污染的经济有效方法之一,开发具有吡啶降解性能且能够耐受高盐分的微生物是该类研究的重要前提。本研究从山西太原钢铁公司焦化废水处理厂活性污泥中分离培养了一株耐盐吡啶降解菌,通过菌落形态和16S rDNA基因系统发育分析,鉴定其为红球菌属(Rhodococcus sp.)的细菌。耐盐性实验结果表明,菌株LV4能够在0%-6%盐度范围内生长,并完全降解初始浓度为500 mg/L的吡啶;但当盐度高于4%时,菌株LV4因其生长变缓而导致吡啶完全降解时间明显延长。扫描电镜结果显示,高盐环境会使菌株LV4的菌体细胞分裂变慢,诱导细胞表面分泌更多的颗粒状胞外聚合物(extracellular polymeric substance, EPS)。当盐度不高于4%时菌株LV4主要依靠EPS中蛋白含量的增加来响应高盐环境的冲击。单因素实验优化发现,菌株LV4在盐度为4%的高盐环境中降解吡啶的最佳条件为温度30 ºC、pH 7.0、转速为120 r/min (DO 10.30 mg/L)。最优条件下菌株LV4对于初始浓度为500 mg/L的吡啶,在经过12 h的适应期后,能以(29.10±0.18) mg/(L·h)的最大速率将吡啶完全降解,总有机碳(total organic carbon, TOC)去除率最高可达88.36%,表明菌株LV4对吡啶的矿化效果较好。利用液质联用仪检测到11种吡啶代谢中间产物,推测菌株LV4主要通过环羟基化和环加氢还原2种代谢路径将吡啶完全降解。菌株LV4在高盐环境对吡啶的快速降解,意味着其在高盐吡啶环境污染治理上具有实际应用的潜力。
由微生物介导的吡啶降解技术是解决高盐吡啶环境污染的经济有效方法之一,开发具有吡啶降解性能且能够耐受高盐分的微生物是该类研究的重要前提。本研究从山西太原钢铁公司焦化废水处理厂活性污泥中分离培养了一株耐盐吡啶降解菌,通过菌落形态和16S rDNA基因系统发育分析,鉴定其为红球菌属(Rhodococcus sp.)的细菌。耐盐性实验结果表明,菌株LV4能够在0%-6%盐度范围内生长,并完全降解初始浓度为500 mg/L的吡啶;但当盐度高于4%时,菌株LV4因其生长变缓而导致吡啶完全降解时间明显延长。扫描电镜结果显示,高盐环境会使菌株LV4的菌体细胞分裂变慢,诱导细胞表面分泌更多的颗粒状胞外聚合物(extracellular polymeric substance, EPS)。当盐度不高于4%时菌株LV4主要依靠EPS中蛋白含量的增加来响应高盐环境的冲击。单因素实验优化发现,菌株LV4在盐度为4%的高盐环境中降解吡啶的最佳条件为温度30 ºC、pH 7.0、转速为120 r/min (DO 10.30 mg/L)。最优条件下菌株LV4对于初始浓度为500 mg/L的吡啶,在经过12 h的适应期后,能以(29.10±0.18) mg/(L·h)的最大速率将吡啶完全降解,总有机碳(total organic carbon, TOC)去除率最高可达88.36%,表明菌株LV4对吡啶的矿化效果较好。利用液质联用仪检测到11种吡啶代谢中间产物,推测菌株LV4主要通过环羟基化和环加氢还原2种代谢路径将吡啶完全降解。菌株LV4在高盐环境对吡啶的快速降解,意味着其在高盐吡啶环境污染治理上具有实际应用的潜力。
2023,39(3):1217-1231, DOI: 10.13345/j.cjb.220663
摘要：
高效稳定的乳杆菌表达载体的构建是实现其菌种改良和个性化菌株开发的关键。本研究从副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei) ZY-1中分离出4个内源性质粒并进行功能分析。通过将pLPZ3与pLPZ4的复制子rep,与pNZ5319质粒的氯霉素乙酰转移酶报告基因cat、pUC19的复制子ori构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pLPZ3N与pLPZ4N,进一步加上启动子Pldh3和mCherry红色荧光蛋白,获得表达载体pLPZ3E与pLPZ4E。pLPZ3与pLPZ4质粒大小分别为 6 289 bp和5 087 bp,GC含量分别为40.94%和39.51%。2个穿梭载体可成功转化至乳酪杆菌属中,pLPZ4N的转化效率(5.23×102-8.93×102 CFU/μg)略高于pLPZ3N。乳酸菌表达载体pLPZ3E与pLPZ4E转化至副干酪乳酪杆菌S-NB后,成功获得了mCherry红色荧光蛋白的表达。以Pldh3为启动子构建的重组表达载体pLPZ4E-lacG转化得到的重组菌,其β-半乳糖苷酶酶活性高于野生型菌株。本研究成功构建了大肠杆菌-乳酪杆菌穿梭载体和表达载体,为乳酪杆菌基因工程菌株的研发提供了新的工具。
高效稳定的乳杆菌表达载体的构建是实现其菌种改良和个性化菌株开发的关键。本研究从副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei) ZY-1中分离出4个内源性质粒并进行功能分析。通过将pLPZ3与pLPZ4的复制子rep,与pNZ5319质粒的氯霉素乙酰转移酶报告基因cat、pUC19的复制子ori构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pLPZ3N与pLPZ4N,进一步加上启动子Pldh3和mCherry红色荧光蛋白,获得表达载体pLPZ3E与pLPZ4E。pLPZ3与pLPZ4质粒大小分别为 6 289 bp和5 087 bp,GC含量分别为40.94%和39.51%。2个穿梭载体可成功转化至乳酪杆菌属中,pLPZ4N的转化效率(5.23×102-8.93×102 CFU/μg)略高于pLPZ3N。乳酸菌表达载体pLPZ3E与pLPZ4E转化至副干酪乳酪杆菌S-NB后,成功获得了mCherry红色荧光蛋白的表达。以Pldh3为启动子构建的重组表达载体pLPZ4E-lacG转化得到的重组菌,其β-半乳糖苷酶酶活性高于野生型菌株。本研究成功构建了大肠杆菌-乳酪杆菌穿梭载体和表达载体,为乳酪杆菌基因工程菌株的研发提供了新的工具。
2023,39(3):1232-1246, DOI: 10.13345/j.cjb.220709
摘要：
东莨菪素是一种香豆素类化合物,有消肿抗炎、镇痛、抗菌、杀螨等生物活性。从植物中提取东莨菪素由于东莨菪苷及其他成分的干扰常导致提取率低、纯化困难。本研究对黑曲霉(Aspergillus niger)来源的β-葡萄糖苷酶基因An-bgl3进行异源表达、纯化及表征,分析了该酶与东莨菪苷的构效关系,并研究其对植物粗提物中东莨菪苷的转化作用。结果表明,纯化后β-葡萄糖苷酶An-bgl3的比活力为15.22 IU/mg;表观分子量约为120 kDa;最适反应温度和pH分别为55℃和4.0。10 mmol/L的金属离子Fe2+和Mn2+可使该酶活力活分别提高1.74倍和1.20倍;10 mmol/L的Tween-20、Tween-80和Triton X-100对于该酶的抑制效果均为30%;能够耐受10%浓度的甲醇和乙醇溶剂。东莨菪苷与An-bgl3具有较好的亲和作用。该酶处理丁公藤(Erycibe obtusifolia Benth)粗提物,能够专一性地将东莨菪苷水解为东莨菪素,使东莨菪素含量增加47.8%。本研究表明黑曲霉β-葡萄糖苷酶An-bgl3对东莨菪苷具有专一性,且酶学性质良好。该研究为使用β-葡萄糖苷酶资源从植物材料中提取东莨菪素提供了参考。
东莨菪素是一种香豆素类化合物,有消肿抗炎、镇痛、抗菌、杀螨等生物活性。从植物中提取东莨菪素由于东莨菪苷及其他成分的干扰常导致提取率低、纯化困难。本研究对黑曲霉(Aspergillus niger)来源的β-葡萄糖苷酶基因An-bgl3进行异源表达、纯化及表征,分析了该酶与东莨菪苷的构效关系,并研究其对植物粗提物中东莨菪苷的转化作用。结果表明,纯化后β-葡萄糖苷酶An-bgl3的比活力为15.22 IU/mg;表观分子量约为120 kDa;最适反应温度和pH分别为55℃和4.0。10 mmol/L的金属离子Fe2+和Mn2+可使该酶活力活分别提高1.74倍和1.20倍;10 mmol/L的Tween-20、Tween-80和Triton X-100对于该酶的抑制效果均为30%;能够耐受10%浓度的甲醇和乙醇溶剂。东莨菪苷与An-bgl3具有较好的亲和作用。该酶处理丁公藤(Erycibe obtusifolia Benth)粗提物,能够专一性地将东莨菪苷水解为东莨菪素,使东莨菪素含量增加47.8%。本研究表明黑曲霉β-葡萄糖苷酶An-bgl3对东莨菪苷具有专一性,且酶学性质良好。该研究为使用β-葡萄糖苷酶资源从植物材料中提取东莨菪素提供了参考。
2023,39(3):1247-1259, DOI: 10.13345/j.cjb.220675
摘要：
本研究旨在利用常压室温等离子体(atmospheric pressure room temperature plasma, ARTP)诱变技术构建叶绿素合成缺陷型凯式小球藻突变株,筛选出极低叶绿素、适用于发酵生产蛋白质的新藻种。首先经优化诱变处理时间后建立了野生型兼养细胞的致死率曲线,在高于95%致死率条件下处理对数早期兼养细胞,基于可视化藻落颜色变化初筛获得4株突变株。随后在摇瓶中异养培养突变株,系统评价了蛋白生产性能,发现在含有30 g/L葡萄糖和5 g/L NaNO3的Basal培养基中,突变株P. ks 4表现最优,蛋白含量及产率分别为39.25%干重及1.15 g/(L·d),氨基酸评分达101.34,叶绿素a含量下降98.78%且不含叶绿素b,含有叶黄素0.62 mg/g而使藻体呈金黄色。本研究为微藻替代蛋白的发酵生产提供了高性能、高品质的新种质P. ks 4。
本研究旨在利用常压室温等离子体(atmospheric pressure room temperature plasma, ARTP)诱变技术构建叶绿素合成缺陷型凯式小球藻突变株,筛选出极低叶绿素、适用于发酵生产蛋白质的新藻种。首先经优化诱变处理时间后建立了野生型兼养细胞的致死率曲线,在高于95%致死率条件下处理对数早期兼养细胞,基于可视化藻落颜色变化初筛获得4株突变株。随后在摇瓶中异养培养突变株,系统评价了蛋白生产性能,发现在含有30 g/L葡萄糖和5 g/L NaNO3的Basal培养基中,突变株P. ks 4表现最优,蛋白含量及产率分别为39.25%干重及1.15 g/(L·d),氨基酸评分达101.34,叶绿素a含量下降98.78%且不含叶绿素b,含有叶黄素0.62 mg/g而使藻体呈金黄色。本研究为微藻替代蛋白的发酵生产提供了高性能、高品质的新种质P. ks 4。
2023,39(3):1260-1268, DOI: 10.13345/j.cjb.220637
摘要：
线上线下混合式教学是未来高校实验教学模式改革的方向之一。混合式教学具有体系性强、知识点可重复、学生自主学习及师生互动多等特点。浙江大学线上线下混合式教学生物化学实验课程包含大型开放式网络课程(massive open online course, MOOC)、线下综合性系列实验和自主实验设计与实践。该课程的混合式教学建设与实践表明,实验课程的混合式教学有助于扩充实验教学内涵,建设标准化的实验教学预习、过程与考核机制,并推动实验课程的共享应用。
线上线下混合式教学是未来高校实验教学模式改革的方向之一。混合式教学具有体系性强、知识点可重复、学生自主学习及师生互动多等特点。浙江大学线上线下混合式教学生物化学实验课程包含大型开放式网络课程(massive open online course, MOOC)、线下综合性系列实验和自主实验设计与实践。该课程的混合式教学建设与实践表明,实验课程的混合式教学有助于扩充实验教学内涵,建设标准化的实验教学预习、过程与考核机制,并推动实验课程的共享应用。
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摘要：
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
摘要：
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
摘要：
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
摘要：
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
摘要：
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
摘要：
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
摘要：
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
摘要：
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
摘要：
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
摘要：
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
摘要：
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
摘要：
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
摘要：
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。
摘要：
通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的三聚氰胺抗原检测方法，对奶制品及饲料中的三聚氰胺残留水平监测提供参考。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金，标记纯化的三聚氰胺单克隆抗体，喷于试纸的金标垫。将MEL-OVA （三聚氰胺和卵清白蛋白的偶练物） 和纯化的羊抗鼠IgG 分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (质控线) 处，通过挑选试纸条材料和调试工艺参数，并最终组装成试纸条。结果显示，制备的试纸监测体系方法检出限为50 mg/L。试纸条对牛奶、奶粉和饲料中的三聚氰胺残留的检出限分别为100?mg/L、1
通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的三聚氰胺抗原检测方法，对奶制品及饲料中的三聚氰胺残留水平监测提供参考。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金，标记纯化的三聚氰胺单克隆抗体，喷于试纸的金标垫。将MEL-OVA （三聚氰胺和卵清白蛋白的偶练物） 和纯化的羊抗鼠IgG 分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (质控线) 处，通过挑选试纸条材料和调试工艺参数，并最终组装成试纸条。结果显示，制备的试纸监测体系方法检出限为50 mg/L。试纸条对牛奶、奶粉和饲料中的三聚氰胺残留的检出限分别为100?mg/L、1
摘要：
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
摘要：
Lipase production by Candida rugosa was carried out in submerged fermentation. Plackett-Burman statistical experimental design was applied to evaluate the fermentation medium components. The effect of twelve medium components was studied in sixteen experimental trials. Glucose, olive oil, peptone and FeCl3?6H2O were found to have more significance on lipase production by Candida rugosa. Maximum lipase activity of 3.8 u mL-1 was obtained at 50 h of fermentation period. The fermentation was carried out at optimized temperature of 30oC, initial pH of 6.8 and shaking speed of 120 r/min. Unstructured kinetic models were used to simulate the experimental data. Logistic model, Luedeking-Piret model and modified Luedeking-Piret model were found suitable to efficiently predict the cell mass, lipase production and glucose consumption respectively with high determination coefficient(R2). From the estimated values of the Luedeking-Piret kinetic model parameters, α and β, it was found that the lipase production by Candida rugosa is growth associated.
Lipase production by Candida rugosa was carried out in submerged fermentation. Plackett-Burman statistical experimental design was applied to evaluate the fermentation medium components. The effect of twelve medium components was studied in sixteen experimental trials. Glucose, olive oil, peptone and FeCl3?6H2O were found to have more significance on lipase production by Candida rugosa. Maximum lipase activity of 3.8 u mL-1 was obtained at 50 h of fermentation period. The fermentation was carried out at optimized temperature of 30oC, initial pH of 6.8 and shaking speed of 120 r/min. Unstructured kinetic models were used to simulate the experimental data. Logistic model, Luedeking-Piret model and modified Luedeking-Piret model were found suitable to efficiently predict the cell mass, lipase production and glucose consumption respectively with high determination coefficient(R2). From the estimated values of the Luedeking-Piret kinetic model parameters, α and β, it was found that the lipase production by Candida rugosa is growth associated.
摘要：
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
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