科微学术
生物工程学报
ISSN 1000-3061
CN 11-1998/Q
主管单位： 中国科学院 创刊时间：1985年
主办单位： 中国科学院微生物研究所 出版刊期：月刊
中国微生物学会 邮发代号：82-13
主 编： 邓子新 院士 出版日期：每月25日
执行主编： 李寅
收录类型：北大中文核心期刊、中国科技核心期刊、CSCD核心期刊、中国知网、Medline/PubMed、Scopus、AJ、JST、CSA(NS)、IC、EMBASE
主要栏目：综述、动物及兽医生物技术、环境生物技术、工业生物技术、合成生物技术、农业生物技术、医药生物技术、组织工程与细胞培养、生物技术与方法、生物育种与工艺优化、高校生物学教学
- 2023年第39卷第9期
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2023,39(9):3556-3565, DOI: 10.13345/j.cjb.220960
摘要：
研制能同时诱导有效黏膜免疫和系统免疫的疫苗是预防黏膜感染病原体的理想目标。消化道具有许多产生黏膜免疫的位点，包括口腔、胃和小肠等。理想的口服病毒疫苗不仅能诱导较好的局部及远端黏膜免疫，也能产生较好的系统免疫，而且还因为具有无痛接种、可自行服用等优势而备受关注。由于人消化道环境及黏膜免疫的复杂性，目前成功上市的人口服病毒疫苗仅限于3种减毒活疫苗。本文将从消化道黏膜免疫的特点、当前口服病毒疫苗种类及研究现状、口服病毒疫苗所面临的挑战等方面进行综述，期望对我国人口服病毒疫苗的研究和开发提供参考和借鉴。
研制能同时诱导有效黏膜免疫和系统免疫的疫苗是预防黏膜感染病原体的理想目标。消化道具有许多产生黏膜免疫的位点，包括口腔、胃和小肠等。理想的口服病毒疫苗不仅能诱导较好的局部及远端黏膜免疫，也能产生较好的系统免疫，而且还因为具有无痛接种、可自行服用等优势而备受关注。由于人消化道环境及黏膜免疫的复杂性，目前成功上市的人口服病毒疫苗仅限于3种减毒活疫苗。本文将从消化道黏膜免疫的特点、当前口服病毒疫苗种类及研究现状、口服病毒疫苗所面临的挑战等方面进行综述，期望对我国人口服病毒疫苗的研究和开发提供参考和借鉴。
2023,39(9):3566-3578, DOI: 10.13345/j.cjb.220888
摘要：
作为专性的细胞内寄生物，病毒没有独立代谢的能力，因此完全依赖于宿主细胞的代谢机制。病毒利用宿主细胞代谢网络提供的能量和生物合成前体物质来驱动其复制、装配和释放。因此，病毒挟持宿主细胞代谢以实现自身的复制和增殖。此外，病毒还可以通过编码辅助代谢基因(auxiliary metabolic genes, AMGs)调控宿主的细胞代谢，影响碳、氮、磷、硫循环，参与微生物驱动的生物地球化学循环。本文主要从细胞葡萄糖代谢、谷氨酰胺代谢、脂肪酸代谢、病毒AMGs调控宿主代谢影响生物地球化学循环4个方面总结病毒感染对宿主核心代谢途径影响的研究，以期为深入理解病毒-宿主相互作用提供参考，也将为通过代谢干预治疗病毒性疾病提供一定的理论依据。
作为专性的细胞内寄生物，病毒没有独立代谢的能力，因此完全依赖于宿主细胞的代谢机制。病毒利用宿主细胞代谢网络提供的能量和生物合成前体物质来驱动其复制、装配和释放。因此，病毒挟持宿主细胞代谢以实现自身的复制和增殖。此外，病毒还可以通过编码辅助代谢基因(auxiliary metabolic genes, AMGs)调控宿主的细胞代谢，影响碳、氮、磷、硫循环，参与微生物驱动的生物地球化学循环。本文主要从细胞葡萄糖代谢、谷氨酰胺代谢、脂肪酸代谢、病毒AMGs调控宿主代谢影响生物地球化学循环4个方面总结病毒感染对宿主核心代谢途径影响的研究，以期为深入理解病毒-宿主相互作用提供参考，也将为通过代谢干预治疗病毒性疾病提供一定的理论依据。
2023,39(9):3579-3593, DOI: 10.13345/j.cjb.230079
摘要：
数据非依赖采集(data-independent acquisition, DIA)是一种高通量、无偏性的质谱数据采集方法，具有定量结果重现性好，对低丰度蛋白质友好的特点，是近年来进行大队列蛋白质组研究的首选方法之一。由于DIA产生的二级谱是混合谱，包含了多个肽段的碎片离子信息，使得蛋白质鉴定和定量更加困难。目前，DIA数据分析方法分为两大类，即以肽为中心和以谱图为中心。其中，以肽为中心的分析方法鉴定更灵敏，定量更准确，已成为DIA数据解析的主流方法。其分析流程包括构建谱图库、提取色谱峰群、特征打分和结果质控4个关键步骤。本文综述了以肽为中心的DIA数据分析流程，介绍了基于此流程的数据分析软件及相关比较评估工作，进一步总结了已有的算法改进工作，最后对未来发展方向进行了展望。
数据非依赖采集(data-independent acquisition, DIA)是一种高通量、无偏性的质谱数据采集方法，具有定量结果重现性好，对低丰度蛋白质友好的特点，是近年来进行大队列蛋白质组研究的首选方法之一。由于DIA产生的二级谱是混合谱，包含了多个肽段的碎片离子信息，使得蛋白质鉴定和定量更加困难。目前，DIA数据分析方法分为两大类，即以肽为中心和以谱图为中心。其中，以肽为中心的分析方法鉴定更灵敏，定量更准确，已成为DIA数据解析的主流方法。其分析流程包括构建谱图库、提取色谱峰群、特征打分和结果质控4个关键步骤。本文综述了以肽为中心的DIA数据分析流程，介绍了基于此流程的数据分析软件及相关比较评估工作，进一步总结了已有的算法改进工作，最后对未来发展方向进行了展望。
2023,39(9):3594-3604, DOI: 10.13345/j.cjb.220865
摘要：
急性高原病(acute mountain sickness, AMS)是人体急性暴露于高原低压低氧环境后出现多系统生理紊乱的临床综合征。定量蛋白质组学技术可以系统定量并描述机体蛋白质组成和动态变化规律，近年来在多种疾病的预防、诊断、治疗和发生机制等方面研究应用广泛。本文系统综述了定量蛋白质组学技术及其在AMS的预防、诊断、治疗和急进高原习服机制研究中的应用进展，以期为AMS的发病机制、提前干预、临床治疗和AMS的蛋白质组学研究提供参考。
急性高原病(acute mountain sickness, AMS)是人体急性暴露于高原低压低氧环境后出现多系统生理紊乱的临床综合征。定量蛋白质组学技术可以系统定量并描述机体蛋白质组成和动态变化规律，近年来在多种疾病的预防、诊断、治疗和发生机制等方面研究应用广泛。本文系统综述了定量蛋白质组学技术及其在AMS的预防、诊断、治疗和急进高原习服机制研究中的应用进展，以期为AMS的发病机制、提前干预、临床治疗和AMS的蛋白质组学研究提供参考。
2023,39(9):3605-3614, DOI: 10.13345/j.cjb.221006
摘要：
Brasilicardin A (BraA)是从致病性放线菌巴西诺卡菌(Nocardia brasiliensis) IFM 0406中发现的具有显著免疫抑制作用(IC50=0.057μg/mL)的二萜糖苷类化合物。BraA发挥免疫抑制活性的作用机制与现有临床常用的免疫抑制剂不同，BraA通过抑制氨基酸转运体L系统的转运进而影响T-淋巴细胞对氨基酸的摄入而发挥免疫抑制作用。相比目前已知的免疫抑制剂环孢菌素A、子囊霉素和他克莫司等，BraA在小鼠混合淋巴细胞反应中显示低毒、高效的优势。因此，BraA作为新型的免疫抑制剂，极具开发潜力，已成为全球免疫抑制剂发现新领域。但其结构复杂、合成困难，原菌种产率低且具有致病性，BraA及其类似物的获得已成为此类新型免疫抑制剂研究的瓶颈。本文综述了BraA的分子特征、药理活性、作用机制、目前获得的BraA类似物和衍生化方面的研究进展，以期为BraA及其类似物的高效生产提供参考。
Brasilicardin A (BraA)是从致病性放线菌巴西诺卡菌(Nocardia brasiliensis) IFM 0406中发现的具有显著免疫抑制作用(IC50=0.057μg/mL)的二萜糖苷类化合物。BraA发挥免疫抑制活性的作用机制与现有临床常用的免疫抑制剂不同，BraA通过抑制氨基酸转运体L系统的转运进而影响T-淋巴细胞对氨基酸的摄入而发挥免疫抑制作用。相比目前已知的免疫抑制剂环孢菌素A、子囊霉素和他克莫司等，BraA在小鼠混合淋巴细胞反应中显示低毒、高效的优势。因此，BraA作为新型的免疫抑制剂，极具开发潜力，已成为全球免疫抑制剂发现新领域。但其结构复杂、合成困难，原菌种产率低且具有致病性，BraA及其类似物的获得已成为此类新型免疫抑制剂研究的瓶颈。本文综述了BraA的分子特征、药理活性、作用机制、目前获得的BraA类似物和衍生化方面的研究进展，以期为BraA及其类似物的高效生产提供参考。
2023,39(9):3615-3627, DOI: 10.13345/j.cjb.221040
摘要：
蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimera, PROTAC)是一种可以同时结合E3连接酶和靶蛋白的异双功能小分子，能够借助泛素-蛋白酶体系统特异性降解靶蛋白。目前PROTAC药物大多处于临床试验阶段，配体主要为非共价化合物，具有克服耐药性、降解“不可用药”靶蛋白的优势，但非共价配体会使PROTAC产生钩效应(hook effect)，影响药效发挥。而共价配体凭借自身优势，可以避免该现象的发生，对于PROTAC的发展具有极大的帮助。本文总结了临床前及临床研究阶段，PROTAC分子在核内蛋白、跨膜蛋白和胞浆蛋白3种蛋白靶点中的应用，并以此为基础进行了讨论与展望，以期为今后PROTAC的发展提供一定的研究思路和参考。
蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimera, PROTAC)是一种可以同时结合E3连接酶和靶蛋白的异双功能小分子，能够借助泛素-蛋白酶体系统特异性降解靶蛋白。目前PROTAC药物大多处于临床试验阶段，配体主要为非共价化合物，具有克服耐药性、降解“不可用药”靶蛋白的优势，但非共价配体会使PROTAC产生钩效应(hook effect)，影响药效发挥。而共价配体凭借自身优势，可以避免该现象的发生，对于PROTAC的发展具有极大的帮助。本文总结了临床前及临床研究阶段，PROTAC分子在核内蛋白、跨膜蛋白和胞浆蛋白3种蛋白靶点中的应用，并以此为基础进行了讨论与展望，以期为今后PROTAC的发展提供一定的研究思路和参考。
2023,39(9):3628-3643, DOI: 10.13345/j.cjb.230006
摘要：
小分子抗癌药物通过靶向特定蛋白来抑制肿瘤生长，但大部分致病蛋白被认为是“不可成药”的。蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimeras, PROTAC)通过靶向降解目标蛋白来抑制肿瘤细胞生长，是一项非常有潜力的新技术。本文在介绍传统多肽型PROTAC和小分子型PROTAC基础上，详细总结了靶向递送型PROTAC的最新研究进展，主要包括识别分子介导靶向PROTAC、纳米材料介导靶向PROTAC和可控激活小分子PROTAC前药。研究表明，靶向递送型PROTAC在提高肿瘤细胞特异性、减少脱靶效应和降低生物毒性等方面具有潜在应用价值。最后，本文对PROTAC的成药性进行了展望。
小分子抗癌药物通过靶向特定蛋白来抑制肿瘤生长，但大部分致病蛋白被认为是“不可成药”的。蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimeras, PROTAC)通过靶向降解目标蛋白来抑制肿瘤细胞生长，是一项非常有潜力的新技术。本文在介绍传统多肽型PROTAC和小分子型PROTAC基础上，详细总结了靶向递送型PROTAC的最新研究进展，主要包括识别分子介导靶向PROTAC、纳米材料介导靶向PROTAC和可控激活小分子PROTAC前药。研究表明，靶向递送型PROTAC在提高肿瘤细胞特异性、减少脱靶效应和降低生物毒性等方面具有潜在应用价值。最后，本文对PROTAC的成药性进行了展望。
2023,39(9):3644-3669, DOI: 10.13345/j.cjb.230048
摘要：
肿瘤是严重威胁人类健康的疾病。目前肿瘤治疗策略以手术切除、放化疗、靶向治疗和免疫治疗为主。单克隆抗体药物因具备高效性和低毒性等特点，逐渐成为肿瘤临床治疗中不可或缺的药物类型。噬菌体抗体库技术(phage antibody library technology, PALT)是一种新型的单克隆抗体制备技术，其将免疫球蛋白可变区 VH (variable region of heavy chain)/VL (variable region of lightchain)基因重组后整合在噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式将抗体表达到噬菌体表面，从而获得多样性抗体库。抗体库经过“吸附-洗脱-扩增”过程即可筛选获得到特异结合抗原的抗体分子及其基因序列。 PALT 具有抗体生产周期短、抗体结构可塑性强、抗体产量大、多样性高和可直接生产人源化抗体等优点，已应用于乳腺癌、胃癌、肺癌和肝癌等肿瘤标志物的筛选和抗体药物的制备等领域。文中综述了 PALT 在肿瘤治疗中的研究进展及应用。
肿瘤是严重威胁人类健康的疾病。目前肿瘤治疗策略以手术切除、放化疗、靶向治疗和免疫治疗为主。单克隆抗体药物因具备高效性和低毒性等特点，逐渐成为肿瘤临床治疗中不可或缺的药物类型。噬菌体抗体库技术(phage antibody library technology, PALT)是一种新型的单克隆抗体制备技术，其将免疫球蛋白可变区 VH (variable region of heavy chain)/VL (variable region of lightchain)基因重组后整合在噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式将抗体表达到噬菌体表面，从而获得多样性抗体库。抗体库经过“吸附-洗脱-扩增”过程即可筛选获得到特异结合抗原的抗体分子及其基因序列。 PALT 具有抗体生产周期短、抗体结构可塑性强、抗体产量大、多样性高和可直接生产人源化抗体等优点，已应用于乳腺癌、胃癌、肺癌和肝癌等肿瘤标志物的筛选和抗体药物的制备等领域。文中综述了 PALT 在肿瘤治疗中的研究进展及应用。
2023,39(9):3670-3680, DOI: 10.13345/j.cjb.220811
摘要：
具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum, Fn)是一种口腔厌氧菌，最近被发现在人类结直肠癌(colorectal cancer, CRC)细胞表面聚集，其富集程度与癌症治疗预后呈高度负相关。大量研究表明，Fn参与CRC的发生与发展过程，Fn与肿瘤微环境中多种组分相互作用从而增强肿瘤的耐药性。近年来，开始有研究利用纳米材料抑制Fn在肿瘤部位的增殖或通过直接靶向Fn治疗CRC。因此，本综述一方面将对近年来Fn在CRC中促肿瘤的机制进行梳理总结，另一方面将归纳整理不同纳米材料应用于Fn相关CRC治疗的最新研究进展，最后对纳米材料在Fn介导的CRC治疗中的应用前景进行了展望。
具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum, Fn)是一种口腔厌氧菌，最近被发现在人类结直肠癌(colorectal cancer, CRC)细胞表面聚集，其富集程度与癌症治疗预后呈高度负相关。大量研究表明，Fn参与CRC的发生与发展过程，Fn与肿瘤微环境中多种组分相互作用从而增强肿瘤的耐药性。近年来，开始有研究利用纳米材料抑制Fn在肿瘤部位的增殖或通过直接靶向Fn治疗CRC。因此，本综述一方面将对近年来Fn在CRC中促肿瘤的机制进行梳理总结，另一方面将归纳整理不同纳米材料应用于Fn相关CRC治疗的最新研究进展，最后对纳米材料在Fn介导的CRC治疗中的应用前景进行了展望。
2023,39(9):3681-3694, DOI: 10.13345/j.cjb.220911
摘要：
单链抗体(single chain antibody fragment, scFv)是由抗体重链可变区(variable region of heavy chain, VH)和轻链可变区(variable region of light chain, VL)通过柔性短肽连接组成的小分子，是具有完整抗原结合活性的最小功能片段，包含抗体识别及抗原结合部位。相比于其他抗体，scFv具有分子量小、穿透性强、免疫原性弱、易构建表达等优点。目前，scFv最常用的展示系统主要有噬菌体展示系统、核糖体展示系统、mRNA展示系统、酵母细胞表面展示系统和哺乳动物细胞展示系统等。近年来，随着scFv在医学、生物学、食品安全学等领域的发展，使得其在生物合成和应用研究方面备受关注。本文对近年来scFv展示系统的研究进展作一综述，以期为scFv的筛选及应用提供理论基础。
单链抗体(single chain antibody fragment, scFv)是由抗体重链可变区(variable region of heavy chain, VH)和轻链可变区(variable region of light chain, VL)通过柔性短肽连接组成的小分子，是具有完整抗原结合活性的最小功能片段，包含抗体识别及抗原结合部位。相比于其他抗体，scFv具有分子量小、穿透性强、免疫原性弱、易构建表达等优点。目前，scFv最常用的展示系统主要有噬菌体展示系统、核糖体展示系统、mRNA展示系统、酵母细胞表面展示系统和哺乳动物细胞展示系统等。近年来，随着scFv在医学、生物学、食品安全学等领域的发展，使得其在生物合成和应用研究方面备受关注。本文对近年来scFv展示系统的研究进展作一综述，以期为scFv的筛选及应用提供理论基础。
2023,39(9):3695-3709, DOI: 10.13345/j.cjb.220899
摘要：
尿苷是生物体内必需的营养物之一，需将尿苷浓度维持在一定浓度水平才能维持胞内正常的生长代谢。近年来，有研究发现尿苷可通过多种机制缓解生物体炎症反应，并能参与胞内糖酵解等代谢途径，且可调节胞内糖基化、乙酰化等蛋白修饰作用。此外，其还能通过减轻胞内氧化应激、促进高能化合物合成等方式保护细胞免受缺氧性损伤。研究表明，这些保护作用与尿苷对线粒体功能的调节作用息息相关。因此，本文主要综述了尿苷及其代谢反应(物)对线粒体功能的研究进展。
尿苷是生物体内必需的营养物之一，需将尿苷浓度维持在一定浓度水平才能维持胞内正常的生长代谢。近年来，有研究发现尿苷可通过多种机制缓解生物体炎症反应，并能参与胞内糖酵解等代谢途径，且可调节胞内糖基化、乙酰化等蛋白修饰作用。此外，其还能通过减轻胞内氧化应激、促进高能化合物合成等方式保护细胞免受缺氧性损伤。研究表明，这些保护作用与尿苷对线粒体功能的调节作用息息相关。因此，本文主要综述了尿苷及其代谢反应(物)对线粒体功能的研究进展。
2023,39(9):3710-3723, DOI: 10.13345/j.cjb.221050
摘要：
作为细胞结构与功能的中心参与者，蛋白质一直是生命科学研究的中心主题。分析蛋白质序列变异对其结构、功能的影响，是研究蛋白的重要手段之一。近年一种称为深度突变扫描(deep mutational scanning, DMS)的技术被广泛应用于蛋白研究领域，其通过高丰度DNA文库在蛋白特定区域平行引入成千上万种突变，经筛选后，利用高通量测序为每一种突变打分，从而揭示序列与功能之间的相关性。深度突变扫描以其高通量、快速简易、节省人工等特点，已经成为蛋白质功能研究以及蛋白工程改造的一种重要方法，目前已在蛋白进化、抗体改造、致病突变鉴定等蛋白研究的多个领域广泛应用。本综述简要概括了深度突变扫描技术的原理，重点介绍了其在哺乳动物细胞中的应用，同时分析了目前的技术瓶颈，旨在为相关研究提供参考。
作为细胞结构与功能的中心参与者，蛋白质一直是生命科学研究的中心主题。分析蛋白质序列变异对其结构、功能的影响，是研究蛋白的重要手段之一。近年一种称为深度突变扫描(deep mutational scanning, DMS)的技术被广泛应用于蛋白研究领域，其通过高丰度DNA文库在蛋白特定区域平行引入成千上万种突变，经筛选后，利用高通量测序为每一种突变打分，从而揭示序列与功能之间的相关性。深度突变扫描以其高通量、快速简易、节省人工等特点，已经成为蛋白质功能研究以及蛋白工程改造的一种重要方法，目前已在蛋白进化、抗体改造、致病突变鉴定等蛋白研究的多个领域广泛应用。本综述简要概括了深度突变扫描技术的原理，重点介绍了其在哺乳动物细胞中的应用，同时分析了目前的技术瓶颈，旨在为相关研究提供参考。
2023,39(9):3724-3737, DOI: 10.13345/j.cjb.220871
摘要：
骨组织工程通过联合利用种子细胞、生物活性因子和支架材料等要素来构建骨组织再生微环境，从而促进骨缺损的修复重建来诱导骨再生。明胶微球具有多孔性、生物降解性、生物相容性及生物安全性等优势，是一种极具应用潜能的骨修复材料。明胶微球用于体外培养种子细胞时可实现高效扩增。多官能团结构使其可作为促血管再生因子、促骨再生因子及抗感染因子等多种药物的递送载体，缓释药物的同时也可实现微球的多功能化。在构建明胶微球支架时与其他生物材料复合及血管化性能的赋予可提高支架材料的综合性能，但目前支架的设计还存在如何兼顾材料多孔结构和力学性能的问题。本文主要综述了明胶微球的常见制备技术及其近年来在骨组织工程中的应用，并对未来的发展前景进行展望。
骨组织工程通过联合利用种子细胞、生物活性因子和支架材料等要素来构建骨组织再生微环境，从而促进骨缺损的修复重建来诱导骨再生。明胶微球具有多孔性、生物降解性、生物相容性及生物安全性等优势，是一种极具应用潜能的骨修复材料。明胶微球用于体外培养种子细胞时可实现高效扩增。多官能团结构使其可作为促血管再生因子、促骨再生因子及抗感染因子等多种药物的递送载体，缓释药物的同时也可实现微球的多功能化。在构建明胶微球支架时与其他生物材料复合及血管化性能的赋予可提高支架材料的综合性能，但目前支架的设计还存在如何兼顾材料多孔结构和力学性能的问题。本文主要综述了明胶微球的常见制备技术及其近年来在骨组织工程中的应用，并对未来的发展前景进行展望。
2023,39(9):3738-3746, DOI: 10.13345/j.cjb.220656
摘要：
临床研究表明着丝粒蛋白F (centromere protein F, CENPF)与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生相关。由于CENPF蛋白的分子量高达358 kDa，目前有关CENPF致癌机制研究使用的体内外模型主要基于CENPF表达敲低，尚缺乏将CENPF过表达以探究其与癌变因果关系的研究，CENPF过表达改变到底是“因”还是“果”仍不清楚。本研究旨在利用包括lentiMPHv2和lentiSAMv2两个载体的CRISPR/dCas9转录激活协同激活介体(synergistic activation mediator, SAM)系统构建内源性CENPF稳定过表达的细胞模型，为阐明CENPF过表达与HCC发生发展的因果关系提供有效工具。首先设计并合成能够特异性识别CENPF基因转录起始位点的单向导核糖核酸(single guide RNAs, sgRNA)，并将其插入lentiSAMv2质粒中。利用慢病毒载体将lentiMPHv2质粒导入Huh-7和HCCLM3细胞株中，用潮霉素B筛选后再用慢病毒载体将连接好的携带sgRNA序列的lentiSAMv2质粒导入细胞中，并用杀稻瘟菌素S继续筛选。对2种抗生素筛选获得的Huh-7和HCCLM3细胞株样品进行CENPF mRNA和蛋白表达水平的检测，结果显示sgRNA1和sgRNA4序列均能够激活内源CENPF的表达，其中sgRNA4诱导转录效果更加明显。本研究利用CRISPR/dCas9系统成功构建内源性CENPF稳定过表达的HCC细胞模型，为研究CENPF过表达与肿瘤发生的因果关系奠定基础，并为构建大分子量蛋白过表达的细胞模型提供参考方案。
临床研究表明着丝粒蛋白F (centromere protein F, CENPF)与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生相关。由于CENPF蛋白的分子量高达358 kDa，目前有关CENPF致癌机制研究使用的体内外模型主要基于CENPF表达敲低，尚缺乏将CENPF过表达以探究其与癌变因果关系的研究，CENPF过表达改变到底是“因”还是“果”仍不清楚。本研究旨在利用包括lentiMPHv2和lentiSAMv2两个载体的CRISPR/dCas9转录激活协同激活介体(synergistic activation mediator, SAM)系统构建内源性CENPF稳定过表达的细胞模型，为阐明CENPF过表达与HCC发生发展的因果关系提供有效工具。首先设计并合成能够特异性识别CENPF基因转录起始位点的单向导核糖核酸(single guide RNAs, sgRNA)，并将其插入lentiSAMv2质粒中。利用慢病毒载体将lentiMPHv2质粒导入Huh-7和HCCLM3细胞株中，用潮霉素B筛选后再用慢病毒载体将连接好的携带sgRNA序列的lentiSAMv2质粒导入细胞中，并用杀稻瘟菌素S继续筛选。对2种抗生素筛选获得的Huh-7和HCCLM3细胞株样品进行CENPF mRNA和蛋白表达水平的检测，结果显示sgRNA1和sgRNA4序列均能够激活内源CENPF的表达，其中sgRNA4诱导转录效果更加明显。本研究利用CRISPR/dCas9系统成功构建内源性CENPF稳定过表达的HCC细胞模型，为研究CENPF过表达与肿瘤发生的因果关系奠定基础，并为构建大分子量蛋白过表达的细胞模型提供参考方案。
2023,39(9):3747-3756, DOI: 10.13345/j.cjb.220870
摘要：
为研发一种用于治疗2型糖尿病的新型生物药物，本研究运用实验室前期构建的10rolglp-1基因和CRISPR/Cas9基因组编辑技术创建了重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌株。构建了向导RNA (guide RNA, gRNA)表达载体pyES2-gRNA、供体载体pNK1-L-PGK- 10rolGLP-1-R和Cas9表达载体pGADT7-Cas9，将这些表达载体共转化酿酒酵母INVSc1菌株，通过同源重组途径敲入PGK-10rolGLP-1表达单元，最终得到具有降血糖功能、高表达10rolGLP-1的酿酒酵母。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹，筛选出2种稳定表达10rolGLP-1的酿酒酵母重组菌株。降血糖实验结果表明，重组降血糖酿酒酵母对糖尿病小鼠模型具有显著的降血糖作用，其血糖下降平缓，可避免引起低血糖风险。体重变化和多尿等其他症状也明显改善，表明本研究构建的口服降血糖酿酒酵母有望成为一种简单有效、经济实用的糖尿病生物药物。
为研发一种用于治疗2型糖尿病的新型生物药物，本研究运用实验室前期构建的10rolglp-1基因和CRISPR/Cas9基因组编辑技术创建了重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌株。构建了向导RNA (guide RNA, gRNA)表达载体pyES2-gRNA、供体载体pNK1-L-PGK- 10rolGLP-1-R和Cas9表达载体pGADT7-Cas9，将这些表达载体共转化酿酒酵母INVSc1菌株，通过同源重组途径敲入PGK-10rolGLP-1表达单元，最终得到具有降血糖功能、高表达10rolGLP-1的酿酒酵母。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹，筛选出2种稳定表达10rolGLP-1的酿酒酵母重组菌株。降血糖实验结果表明，重组降血糖酿酒酵母对糖尿病小鼠模型具有显著的降血糖作用，其血糖下降平缓，可避免引起低血糖风险。体重变化和多尿等其他症状也明显改善，表明本研究构建的口服降血糖酿酒酵母有望成为一种简单有效、经济实用的糖尿病生物药物。
2023,39(9):3757-3771, DOI: 10.13345/j.cjb.220882
摘要：
为应对治疗性抗体快速增长的市场需求，抗体上游细胞培养规模和表达量水平已显著提高，而下游纯化工艺的生产效率则相对落后，下游处理能力已成为限制抗体产能的瓶颈。本研究以单克隆抗体mab-X为实验材料，优化了细胞培养液、低pH病毒灭活收集液2种模式的正辛酸(caprylic acid, CA)沉淀工艺条件，并研究了CA处理去除聚体、CA处理灭活病毒等2种应用，在小试的基础上，采用低pH病毒灭活收集液CA沉淀的模式进行了500 L细胞培养规模生产放大研究，对沉淀前后的产品质量和收率进行了检测和对比。结果显示，两种模式的CA沉淀均可显著降低宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)残留和聚体含量，在聚体去除实验中CA沉淀可去除约15%的聚体，病毒灭活研究显示CA对逆转录模型病毒具有完全的病毒灭活能力。在放大生产规模中，下游依次进行了深层过滤收获、亲和层析、低pH病毒灭活、CA沉淀及深层过滤、阳离子交换层析，CA沉淀过程中混合时间和搅拌速度显著影响CA沉淀效果，CA沉淀处理后低pH病毒灭活液中的HCP残留量降低了895倍，沉淀后产品纯度和HCP残留均已控制在单克隆抗体质量要求范围内，CA沉淀可以减少传统纯化工艺中的一个精纯步骤。总之，下游工艺中采用CA沉淀，能够精简传统纯化工艺，并完全满足mab-X的纯化质量要求，而且能提高生产效率、降低生产成本。本研究结果将推动CA沉淀在单克隆抗体下游纯化生产中的应用，为解决目前传统纯化工艺的问题提供参考。
为应对治疗性抗体快速增长的市场需求，抗体上游细胞培养规模和表达量水平已显著提高，而下游纯化工艺的生产效率则相对落后，下游处理能力已成为限制抗体产能的瓶颈。本研究以单克隆抗体mab-X为实验材料，优化了细胞培养液、低pH病毒灭活收集液2种模式的正辛酸(caprylic acid, CA)沉淀工艺条件，并研究了CA处理去除聚体、CA处理灭活病毒等2种应用，在小试的基础上，采用低pH病毒灭活收集液CA沉淀的模式进行了500 L细胞培养规模生产放大研究，对沉淀前后的产品质量和收率进行了检测和对比。结果显示，两种模式的CA沉淀均可显著降低宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)残留和聚体含量，在聚体去除实验中CA沉淀可去除约15%的聚体，病毒灭活研究显示CA对逆转录模型病毒具有完全的病毒灭活能力。在放大生产规模中，下游依次进行了深层过滤收获、亲和层析、低pH病毒灭活、CA沉淀及深层过滤、阳离子交换层析，CA沉淀过程中混合时间和搅拌速度显著影响CA沉淀效果，CA沉淀处理后低pH病毒灭活液中的HCP残留量降低了895倍，沉淀后产品纯度和HCP残留均已控制在单克隆抗体质量要求范围内，CA沉淀可以减少传统纯化工艺中的一个精纯步骤。总之，下游工艺中采用CA沉淀，能够精简传统纯化工艺，并完全满足mab-X的纯化质量要求，而且能提高生产效率、降低生产成本。本研究结果将推动CA沉淀在单克隆抗体下游纯化生产中的应用，为解决目前传统纯化工艺的问题提供参考。
2023,39(9):3772-3786, DOI: 10.13345/j.cjb.220886
摘要：
背根神经节(dorsal root ganglia, DRG)是重要的外周神经系统组成部分，是外周感觉传入中枢的枢纽。背根神经节在发育过程中神经元细胞及其基因表达的动态变化已有研究进行过单细胞转录组的解析，而关于非神经元细胞的动态变化尚无系统研究。为了探究出生后不同发育时间点大鼠DRG内非神经元细胞的变化，本研究选取10只7日龄(7 day, 7D)大鼠的DRG和3只3月龄(3 month, 3M)大鼠的DRG，制备单细胞悬液，使用10×Genomics平台进行测序，从单细胞水平解析了出生后发育中DRG非神经元细胞的转录图谱。结果表明，7D和3M各类非神经元细胞在细胞数目的分布比例上存在显著差异性。对拥有4个亚型的施旺细胞整体进行拟时分析，Ⅱ型施旺细胞是最早出现的施旺细胞亚型，Ⅲ型和Ⅳ型施旺细胞出现较晚。进一步对2个不同发育时间点细胞占比数差异显著的Ⅳ型施旺细胞进行了基因本体(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encylopaedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析。从7D到3M的差异基因的GO分析结果表明，Ⅳ型施旺细胞的状态逐渐趋于稳定。KEGG分析结果发现酪氨酸代谢通路的显著上调影响了细胞内的信号转导，进而影响了细胞稳态的维持。从7D到3M，基因Col3a1、Col4a1显著下调，且与细胞外基质的构建密切相关，这表明Ⅳ型施旺细胞的细胞基质环境随着发育过程趋于稳定。上述结果提示Ⅳ型施旺细胞是一类趋于成熟且维持施旺细胞稳态的细胞。本研究关于DRG在发育过程中细胞类型和基因表达差异的分析结果为躯体感觉在发育过程中成熟机制的研究提供了重要参考信息。
背根神经节(dorsal root ganglia, DRG)是重要的外周神经系统组成部分，是外周感觉传入中枢的枢纽。背根神经节在发育过程中神经元细胞及其基因表达的动态变化已有研究进行过单细胞转录组的解析，而关于非神经元细胞的动态变化尚无系统研究。为了探究出生后不同发育时间点大鼠DRG内非神经元细胞的变化，本研究选取10只7日龄(7 day, 7D)大鼠的DRG和3只3月龄(3 month, 3M)大鼠的DRG，制备单细胞悬液，使用10×Genomics平台进行测序，从单细胞水平解析了出生后发育中DRG非神经元细胞的转录图谱。结果表明，7D和3M各类非神经元细胞在细胞数目的分布比例上存在显著差异性。对拥有4个亚型的施旺细胞整体进行拟时分析，Ⅱ型施旺细胞是最早出现的施旺细胞亚型，Ⅲ型和Ⅳ型施旺细胞出现较晚。进一步对2个不同发育时间点细胞占比数差异显著的Ⅳ型施旺细胞进行了基因本体(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encylopaedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析。从7D到3M的差异基因的GO分析结果表明，Ⅳ型施旺细胞的状态逐渐趋于稳定。KEGG分析结果发现酪氨酸代谢通路的显著上调影响了细胞内的信号转导，进而影响了细胞稳态的维持。从7D到3M，基因Col3a1、Col4a1显著下调，且与细胞外基质的构建密切相关，这表明Ⅳ型施旺细胞的细胞基质环境随着发育过程趋于稳定。上述结果提示Ⅳ型施旺细胞是一类趋于成熟且维持施旺细胞稳态的细胞。本研究关于DRG在发育过程中细胞类型和基因表达差异的分析结果为躯体感觉在发育过程中成熟机制的研究提供了重要参考信息。
2023,39(9):3787-3799, DOI: 10.13345/j.cjb.230013
摘要：
本研究分析了共表达白细胞介素-15 (interleukin-15, IL-15)和趋化因子配体19 (C-C chemokine ligand 19, CCL19)的EGFRvⅢ CAR-T细胞的功能特性及其体外特异性杀伤效果，旨在优化CAR-T细胞多项功能，提高靶向EGFRvⅢ 的CAR-T细胞对胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)的治疗效果。通过基因工程技术获得重组慢病毒质粒，转染293T细胞获得慢病毒并感染T细胞获得靶向EGFRvⅢ的第四代CAR-T细胞(EGFRvⅢ-IL-15-CCL19 CAR-T)。利用流式细胞仪、细胞计数仪、趋化小室、凋亡试剂盒等检测了第四代和第二代CAR-T细胞(EGFRvⅢ CAR-T)的CAR分子表达率、增殖、趋化能力、体外特异性杀伤能力及抗凋亡能力等。结果表明，与EGFRvⅢ CAR-T细胞相比，EGFRvⅢ-IL-15-CCL19 CAR-T细胞能成功分泌IL-15和CCL19，具有更强的体外增殖能力、趋化能力以及抗凋亡能力(P值均<0.05)，而体外特异性杀伤能力无显著差异。因此，靶向EGFRvⅢ且同时分泌IL-15和CCL19的CAR-T细胞有望提高胶质母细胞瘤的治疗效果，为临床试验提供一定的参考依据。
本研究分析了共表达白细胞介素-15 (interleukin-15, IL-15)和趋化因子配体19 (C-C chemokine ligand 19, CCL19)的EGFRvⅢ CAR-T细胞的功能特性及其体外特异性杀伤效果，旨在优化CAR-T细胞多项功能，提高靶向EGFRvⅢ 的CAR-T细胞对胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)的治疗效果。通过基因工程技术获得重组慢病毒质粒，转染293T细胞获得慢病毒并感染T细胞获得靶向EGFRvⅢ的第四代CAR-T细胞(EGFRvⅢ-IL-15-CCL19 CAR-T)。利用流式细胞仪、细胞计数仪、趋化小室、凋亡试剂盒等检测了第四代和第二代CAR-T细胞(EGFRvⅢ CAR-T)的CAR分子表达率、增殖、趋化能力、体外特异性杀伤能力及抗凋亡能力等。结果表明，与EGFRvⅢ CAR-T细胞相比，EGFRvⅢ-IL-15-CCL19 CAR-T细胞能成功分泌IL-15和CCL19，具有更强的体外增殖能力、趋化能力以及抗凋亡能力(P值均<0.05)，而体外特异性杀伤能力无显著差异。因此，靶向EGFRvⅢ且同时分泌IL-15和CCL19的CAR-T细胞有望提高胶质母细胞瘤的治疗效果，为临床试验提供一定的参考依据。
2023,39(9):3800-3813, DOI: 10.13345/j.cjb.220907
摘要：
外泌弹性蛋白酶是桔黄赛多孢霉(Scedosporium aurantiacum)主要毒性蛋白酶之一，本文在前期研究的基础上，对这种蛋白酶的序列、结构和酶学特性进行了研究。首先通过柱层析技术将S. aurantiacum培养上清液中的蛋白进行了分离，然后通过酶谱电泳纯化得到了弹性蛋白酶条带。从凝胶中提取了弹性蛋白酶，通过质谱技术对其序列进行了检测，并对其反应特性、活力和反应动力学参数进行了研究。结果显示，S. aurantiacum外泌弹性蛋白酶对弹性蛋白和牛跟腱胶原蛋白(bovine achilles tendon collagen, BATC)具有较好的水解性能，对鱼皮胶原蛋白(fish skin collagen, FSC)的水解效率高于对鱼鳞明胶的水解效率，对酪蛋白的水解性最差。作用于弹性蛋白时，其催化效率小于猪胰腺弹性蛋白酶。Zn2+对酶活力有提升作用，而Ca2+、Mg2+、Na+、(2S)-2-[(4S)-2-氨基-1,4,5,6-四羟基4-嘧啶基]-N-[[[(1S)-1-羰基-3-甲基丁基]氨基]羰基]甘氨酰- N1-[(1S)-1-甲基-2-氧乙基]-l-谷氨酸甲酰胺(elastatinal)和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)均对酶活有抑制作用。该蛋白酶和青霉(Paecilomyces lilacinus)外泌丝氨酸蛋白酶(PDB Entry: c3f7oB_)的序列最相似，且有多段保守序列的氨基酸个数多于7个，可以作为PCR反应引物设计的模板。酶学特性实验表明，S. aurantiacum外泌弹性蛋白酶对肺组织中的弹性蛋白具有降解作用，其蛋白表达和毒性机制需要进一步的研究。
外泌弹性蛋白酶是桔黄赛多孢霉(Scedosporium aurantiacum)主要毒性蛋白酶之一，本文在前期研究的基础上，对这种蛋白酶的序列、结构和酶学特性进行了研究。首先通过柱层析技术将S. aurantiacum培养上清液中的蛋白进行了分离，然后通过酶谱电泳纯化得到了弹性蛋白酶条带。从凝胶中提取了弹性蛋白酶，通过质谱技术对其序列进行了检测，并对其反应特性、活力和反应动力学参数进行了研究。结果显示，S. aurantiacum外泌弹性蛋白酶对弹性蛋白和牛跟腱胶原蛋白(bovine achilles tendon collagen, BATC)具有较好的水解性能，对鱼皮胶原蛋白(fish skin collagen, FSC)的水解效率高于对鱼鳞明胶的水解效率，对酪蛋白的水解性最差。作用于弹性蛋白时，其催化效率小于猪胰腺弹性蛋白酶。Zn2+对酶活力有提升作用，而Ca2+、Mg2+、Na+、(2S)-2-[(4S)-2-氨基-1,4,5,6-四羟基4-嘧啶基]-N-[[[(1S)-1-羰基-3-甲基丁基]氨基]羰基]甘氨酰- N1-[(1S)-1-甲基-2-氧乙基]-l-谷氨酸甲酰胺(elastatinal)和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)均对酶活有抑制作用。该蛋白酶和青霉(Paecilomyces lilacinus)外泌丝氨酸蛋白酶(PDB Entry: c3f7oB_)的序列最相似，且有多段保守序列的氨基酸个数多于7个，可以作为PCR反应引物设计的模板。酶学特性实验表明，S. aurantiacum外泌弹性蛋白酶对肺组织中的弹性蛋白具有降解作用，其蛋白表达和毒性机制需要进一步的研究。
2023,39(9):3814-3826, DOI: 10.13345/j.cjb.221035
摘要：
Xanthocillin具有显著的抗菌活性，结构中含有独特的异腈基。本文通过对蛇足石杉(Huperzia serrata)内生真菌产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum) MT-40基因组的测序分析，利用本地BLAST等生物信息学分析工具挖掘具有合成xanthocillin类似物潜力的基因簇，结合米曲霉(Aspergillus oryzae) NSAR1异源表达技术实现基因簇中关键基因的功能鉴定。结果成功从内生真菌P. chrysogenum MT-40中发现一个合成xanthocillin类似物的生物合成基因簇(命名为for)，for基因簇中的关键生物合成基因forB编码的异腈基合成酶可以催化合成2-formamido-3- (4-hydroxyphenyl) acrylic acid，基因forG编码的P450酶可以催化2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl) acrylic acid的二聚化生成xanthocillin类似物N,N'-(1,4-bis (4-hydroxyphenyl) buta-1,3-diene-2,3-diyl) diformamide。本文研究结果为进一步从真菌中发现xanthocillin类似物提供参考。
Xanthocillin具有显著的抗菌活性，结构中含有独特的异腈基。本文通过对蛇足石杉(Huperzia serrata)内生真菌产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum) MT-40基因组的测序分析，利用本地BLAST等生物信息学分析工具挖掘具有合成xanthocillin类似物潜力的基因簇，结合米曲霉(Aspergillus oryzae) NSAR1异源表达技术实现基因簇中关键基因的功能鉴定。结果成功从内生真菌P. chrysogenum MT-40中发现一个合成xanthocillin类似物的生物合成基因簇(命名为for)，for基因簇中的关键生物合成基因forB编码的异腈基合成酶可以催化合成2-formamido-3- (4-hydroxyphenyl) acrylic acid，基因forG编码的P450酶可以催化2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl) acrylic acid的二聚化生成xanthocillin类似物N,N'-(1,4-bis (4-hydroxyphenyl) buta-1,3-diene-2,3-diyl) diformamide。本文研究结果为进一步从真菌中发现xanthocillin类似物提供参考。
2023,39(9):3827-3837, DOI: 10.13345/j.cjb.220932
摘要：
分枝菌酸(mycolic acid, MA)是存在于分枝杆菌细胞壁中的独特长链脂肪酸，与分枝杆菌(mycobacterium)抵御不利环境、耐受抗生素和逃避宿主免疫密切相关，是较热门的抗结核药物筛选的靶点。MA的检测方法主要有放射性薄层层析(thin-layer chromatography, TLC)和液相色谱-质谱(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)，受放射性元素使用资质和标准品等的限制，MA分析是分枝杆菌相关研究的一个难点。本研究采用一种普通薄层层析技术，并对使用四丁基氢氧化铵溶液水解酯化的分枝菌酸，将其甲酯化后再用无水乙醚萃取分枝菌酸甲酯的操作步骤进行改良，使分枝杆菌的MA提取及分析可在常规生物实验室中开展。研究通过比较不同分枝杆菌及不同生长时期的MA成分与亚型特征、检测靶向分枝菌酸合成通路的抗结核药物对细菌MA合成影响以及分枝杆菌突变株对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb) H37Ra分枝菌酸合成影响等基础和应用研究的3个方面，进一步验证该方法在分枝杆菌MA分析中的实用性。结果表明该方法在不使用放射性元素和缺少标准品情况下可简便快速地分析MA及亚型特征，可广泛用于新型抗分枝杆菌药物筛选靶向分枝菌酸合成通路机制及基础研究中MA相关的分析和应用。
分枝菌酸(mycolic acid, MA)是存在于分枝杆菌细胞壁中的独特长链脂肪酸，与分枝杆菌(mycobacterium)抵御不利环境、耐受抗生素和逃避宿主免疫密切相关，是较热门的抗结核药物筛选的靶点。MA的检测方法主要有放射性薄层层析(thin-layer chromatography, TLC)和液相色谱-质谱(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)，受放射性元素使用资质和标准品等的限制，MA分析是分枝杆菌相关研究的一个难点。本研究采用一种普通薄层层析技术，并对使用四丁基氢氧化铵溶液水解酯化的分枝菌酸，将其甲酯化后再用无水乙醚萃取分枝菌酸甲酯的操作步骤进行改良，使分枝杆菌的MA提取及分析可在常规生物实验室中开展。研究通过比较不同分枝杆菌及不同生长时期的MA成分与亚型特征、检测靶向分枝菌酸合成通路的抗结核药物对细菌MA合成影响以及分枝杆菌突变株对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb) H37Ra分枝菌酸合成影响等基础和应用研究的3个方面，进一步验证该方法在分枝杆菌MA分析中的实用性。结果表明该方法在不使用放射性元素和缺少标准品情况下可简便快速地分析MA及亚型特征，可广泛用于新型抗分枝杆菌药物筛选靶向分枝菌酸合成通路机制及基础研究中MA相关的分析和应用。
2023,39(9):3838-3848, DOI: 10.13345/j.cjb.220941
摘要：
本研究旨在建立一套便携、准确、操作简便的呼吸道病毒核酸快速检测方案。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)验证免提取的呼吸道病毒处理试剂(extraction-free respiratory virus treatment reagent, RTU)对病毒核酸处理的效果以及超快速荧光定量PCR仪(FQ-8A)对核酸扩增的效果；将RTU和FQ-8A结合构建呼吸道病毒核酸快速检测方案，通过荧光定量PCR仪中Ct值判断阳性检出率，以验证该方案检测临床样本时的准确性。结果表明，RTU与全自动核酸提取仪在提取效果上灵敏度相当；RTU在提取不同病毒类型样本时，与其他3种提取方法效果相当，但RTU提取时间少于5 min；FQ-8A检测呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)及腺病毒(adenovirus, ADV)与对照仪器ABI-7500具有良好一致性，kappa系数分别为0.938 (P<0.001)和0.887 (P<0.001)，但FQ-8A耗时更短，扩增时间仅在0.5 h左右；RTU和FQ-8A相结合的快检方案与常规检测方案具有高度一致的检出率，其灵敏度为91.70%，特异度为100%，kappa系数为0.944 (P<0.001)。总之，通过RTU与FQ-8A的结合构建了一套可在35 min内完成全部流程的呼吸道病毒核酸快速检测方案。该方案准确性高、操作简便，可为呼吸道病毒快速诊断和治疗提供重要支持。
本研究旨在建立一套便携、准确、操作简便的呼吸道病毒核酸快速检测方案。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)验证免提取的呼吸道病毒处理试剂(extraction-free respiratory virus treatment reagent, RTU)对病毒核酸处理的效果以及超快速荧光定量PCR仪(FQ-8A)对核酸扩增的效果；将RTU和FQ-8A结合构建呼吸道病毒核酸快速检测方案，通过荧光定量PCR仪中Ct值判断阳性检出率，以验证该方案检测临床样本时的准确性。结果表明，RTU与全自动核酸提取仪在提取效果上灵敏度相当；RTU在提取不同病毒类型样本时，与其他3种提取方法效果相当，但RTU提取时间少于5 min；FQ-8A检测呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)及腺病毒(adenovirus, ADV)与对照仪器ABI-7500具有良好一致性，kappa系数分别为0.938 (P<0.001)和0.887 (P<0.001)，但FQ-8A耗时更短，扩增时间仅在0.5 h左右；RTU和FQ-8A相结合的快检方案与常规检测方案具有高度一致的检出率，其灵敏度为91.70%，特异度为100%，kappa系数为0.944 (P<0.001)。总之，通过RTU与FQ-8A的结合构建了一套可在35 min内完成全部流程的呼吸道病毒核酸快速检测方案。该方案准确性高、操作简便，可为呼吸道病毒快速诊断和治疗提供重要支持。
2023,39(9):3849-3862, DOI: 10.13345/j.cjb.221026
摘要：
本研究旨在探索一种高灵敏度、高特异性检测循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)的免疫检测新方法，以尽早地检出结直肠癌，提高该疾病的检出率。首先制备含有线性微柱结构的微芯片，通过在其表面孵育氧化石墨烯-链霉亲和素(graphite oxide-streptavidin, GO-SA)及偶联广谱一抗(antibody1, Ab1)，即上皮特异性黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)单克隆抗体以捕获CTCs。运用羧基化多壁碳纳米管(carboxylated multi-walled carbon nanotubes, MWCNTs-COOH)与结直肠癌相关抗体，即特异性二抗(antibody 2, Ab2)偶联制备抗体复合物。在捕获CTCs的微芯片上孵育该抗体复合物，构建以Ab1-CTCs-Ab2为主体的超级三明治结构，通过电化学工作站检测并验证其高灵敏度和高特异性。结果发现，在免疫传感器的构建中结合应用微纳技术，极大地提高了CTCs的检测灵敏度和特异性。本研究验证了该免疫传感器应用于临床血样检测的可行性，并通过该免疫传感器对结直肠癌患者外周血中CTCs进行检测和计数。结果表明，基于微纳技术的超级三明治式免疫传感器为CTCs的检测提供了新的途径，对临床工作中的疾病诊断及病情实时监控方面均具有潜在的应用价值。
本研究旨在探索一种高灵敏度、高特异性检测循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)的免疫检测新方法，以尽早地检出结直肠癌，提高该疾病的检出率。首先制备含有线性微柱结构的微芯片，通过在其表面孵育氧化石墨烯-链霉亲和素(graphite oxide-streptavidin, GO-SA)及偶联广谱一抗(antibody1, Ab1)，即上皮特异性黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)单克隆抗体以捕获CTCs。运用羧基化多壁碳纳米管(carboxylated multi-walled carbon nanotubes, MWCNTs-COOH)与结直肠癌相关抗体，即特异性二抗(antibody 2, Ab2)偶联制备抗体复合物。在捕获CTCs的微芯片上孵育该抗体复合物，构建以Ab1-CTCs-Ab2为主体的超级三明治结构，通过电化学工作站检测并验证其高灵敏度和高特异性。结果发现，在免疫传感器的构建中结合应用微纳技术，极大地提高了CTCs的检测灵敏度和特异性。本研究验证了该免疫传感器应用于临床血样检测的可行性，并通过该免疫传感器对结直肠癌患者外周血中CTCs进行检测和计数。结果表明，基于微纳技术的超级三明治式免疫传感器为CTCs的检测提供了新的途径，对临床工作中的疾病诊断及病情实时监控方面均具有潜在的应用价值。
2023,39(9):3863-3875, DOI: 10.13345/j.cjb.220893
摘要：
减少乳酸积累一直是哺乳动物细胞生物技术产业的一个目标。体外培养动物细胞时，乳酸积累主要是2种代谢途径作用的综合结果：一方面，葡萄糖在乳酸脱氢酶A (lactate dehydrogenase A, LDHA)的作用下生成乳酸；另一方面，乳酸可通过乳酸脱氢酶B (LDHB)或乳酸脱氢酶C (LDHC)氧化为丙酮酸重新进入三羧酸循环。本研究综合评估了乳酸代谢关键基因调控对人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells, HEK-293)细胞生长、代谢和人腺病毒(human adenovirus, HAdV)生产的影响，有效提高了HEK-293细胞的HAdV生产能力，并为哺乳动物细胞的乳酸代谢工程调控提供了理论基础。通过改造乳酸代谢关键调控基因(敲除ldha基因以及过表达ldhb和ldhc基因)，有效改善了HEK-293细胞的物质和能量代谢效率，显著提高了HAdV的生产。与对照细胞相比，3个基因改造均能促进细胞生长，降低乳酸和氨的积累，明显增强细胞的物质和能量代谢效率，显著提高了HEK-293细胞的HAdV生产能力。ldhc基因过表达对HEK-293细胞的生长、代谢和HAdV生产调控最显著，最大细胞密度提高了约38.7%，乳酸对葡萄糖得率和氨对谷氨酰胺得率分别下降了33.8%和63.3%，HAdV滴度提高了至少16倍。此外，相比于对照细胞株，改造细胞株的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)生成速率、ATP/O2比率、ATP与腺苷二磷酸(adenosine diphosphate, ADP)的比值以及还原型辅酶Ⅰ (nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)含量均有不同程度的提高，能量代谢效率明显改善。
减少乳酸积累一直是哺乳动物细胞生物技术产业的一个目标。体外培养动物细胞时，乳酸积累主要是2种代谢途径作用的综合结果：一方面，葡萄糖在乳酸脱氢酶A (lactate dehydrogenase A, LDHA)的作用下生成乳酸；另一方面，乳酸可通过乳酸脱氢酶B (LDHB)或乳酸脱氢酶C (LDHC)氧化为丙酮酸重新进入三羧酸循环。本研究综合评估了乳酸代谢关键基因调控对人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells, HEK-293)细胞生长、代谢和人腺病毒(human adenovirus, HAdV)生产的影响，有效提高了HEK-293细胞的HAdV生产能力，并为哺乳动物细胞的乳酸代谢工程调控提供了理论基础。通过改造乳酸代谢关键调控基因(敲除ldha基因以及过表达ldhb和ldhc基因)，有效改善了HEK-293细胞的物质和能量代谢效率，显著提高了HAdV的生产。与对照细胞相比，3个基因改造均能促进细胞生长，降低乳酸和氨的积累，明显增强细胞的物质和能量代谢效率，显著提高了HEK-293细胞的HAdV生产能力。ldhc基因过表达对HEK-293细胞的生长、代谢和HAdV生产调控最显著，最大细胞密度提高了约38.7%，乳酸对葡萄糖得率和氨对谷氨酰胺得率分别下降了33.8%和63.3%，HAdV滴度提高了至少16倍。此外，相比于对照细胞株，改造细胞株的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)生成速率、ATP/O2比率、ATP与腺苷二磷酸(adenosine diphosphate, ADP)的比值以及还原型辅酶Ⅰ (nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)含量均有不同程度的提高，能量代谢效率明显改善。
2023,39(9):3876-3886, DOI: 10.13345/j.cjb.220925
摘要：
探究聚(N-异丙基丙烯酰胺)[poly(N-isopropylacrylamide)]基互穿网络(interpenetrating polymer network)温敏水凝胶(记作：IPNT)作为噬菌体内溶素Lys84递送载体的可行性，及载药水凝胶作为抗菌材料的应用潜力。以海藻酸钠和N-异丙基丙烯酰胺为原材料，通过自由基聚合的方法制备互穿网络温敏水凝胶，采用干态浸泡法负载金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)噬菌体内溶素Lys84获得载药水凝胶(IPNT-Lys84)。通过红外光谱仪、扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)、差示扫描量热仪(differential scanning calorimetry, DSC)对水凝胶载药前后的物理性能进行表征，并研究水凝胶溶胀、退溶胀以及内溶素Lys84释放情况、在不同温度及不同浓度药液浸泡的抗菌性能。结果表明，IPNT-Lys84水凝胶孔洞均匀，低临界溶解温度(lower critical solution temperature, LCST)为32 ℃；水凝胶平衡溶胀度为30 g/g，退溶胀时失水率为88%；在37 ℃时内溶素释放率在6 h内达到70%以上；IPNT-Lys84水凝胶杀菌率达99.9%以上。研究表明，采用IPNT递送内溶素Lys84具有可行性，IPNT-Lys84水凝胶有望成为针对多重耐药金黄色葡萄球菌的有效抗菌材料。
探究聚(N-异丙基丙烯酰胺)[poly(N-isopropylacrylamide)]基互穿网络(interpenetrating polymer network)温敏水凝胶(记作：IPNT)作为噬菌体内溶素Lys84递送载体的可行性，及载药水凝胶作为抗菌材料的应用潜力。以海藻酸钠和N-异丙基丙烯酰胺为原材料，通过自由基聚合的方法制备互穿网络温敏水凝胶，采用干态浸泡法负载金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)噬菌体内溶素Lys84获得载药水凝胶(IPNT-Lys84)。通过红外光谱仪、扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)、差示扫描量热仪(differential scanning calorimetry, DSC)对水凝胶载药前后的物理性能进行表征，并研究水凝胶溶胀、退溶胀以及内溶素Lys84释放情况、在不同温度及不同浓度药液浸泡的抗菌性能。结果表明，IPNT-Lys84水凝胶孔洞均匀，低临界溶解温度(lower critical solution temperature, LCST)为32 ℃；水凝胶平衡溶胀度为30 g/g，退溶胀时失水率为88%；在37 ℃时内溶素释放率在6 h内达到70%以上；IPNT-Lys84水凝胶杀菌率达99.9%以上。研究表明，采用IPNT递送内溶素Lys84具有可行性，IPNT-Lys84水凝胶有望成为针对多重耐药金黄色葡萄球菌的有效抗菌材料。
2023,39(9):3887-3898, DOI: 10.13345/j.cjb.220912
摘要：
为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM (HSV1, HSV2)人鼠嵌合抗体，本研究通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends, RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列，构建嵌合抗体至真核表达载体，在CHO-S细胞中稳定表达所需目的蛋白。同时优化稳定细胞株筛选工艺，对细胞池构建阶段和单克隆筛选阶段的加压条件进行摸索与探究，最后目的抗体采用蛋白L亲和纯化法进行纯化并进行生物活性检测；最终成功制备899 kDa和909 kDa的稳定高表达重组IgM抗体(HSV1, HSV2)细胞株。结果表明，最适筛选压力为20P200M (一轮加压)和50P1000M (二轮加压)；使用加压培养基进行单克隆筛选抗体表达量较高，HSV1-IgM和HSV2-IgM单克隆最终表达量分别为1 620 mg/L和623 mg/L。本研究为HSV1和HSV2的IgM系列重组抗体质控品开发以及体外高表达分泌IgM亚型抗体提供理论与实践基础。
为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM (HSV1, HSV2)人鼠嵌合抗体，本研究通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends, RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列，构建嵌合抗体至真核表达载体，在CHO-S细胞中稳定表达所需目的蛋白。同时优化稳定细胞株筛选工艺，对细胞池构建阶段和单克隆筛选阶段的加压条件进行摸索与探究，最后目的抗体采用蛋白L亲和纯化法进行纯化并进行生物活性检测；最终成功制备899 kDa和909 kDa的稳定高表达重组IgM抗体(HSV1, HSV2)细胞株。结果表明，最适筛选压力为20P200M (一轮加压)和50P1000M (二轮加压)；使用加压培养基进行单克隆筛选抗体表达量较高，HSV1-IgM和HSV2-IgM单克隆最终表达量分别为1 620 mg/L和623 mg/L。本研究为HSV1和HSV2的IgM系列重组抗体质控品开发以及体外高表达分泌IgM亚型抗体提供理论与实践基础。
2023,39(9):3899-3909, DOI: 10.13345/j.cjb.220676
摘要：
为提升工科专业课程教学质量，以成长记录袋课堂评价体系为基础，将多维立体教学法引入到高等院校生物类专业课程细胞工程的教学改革中，对课程的知识体系、施教形式、实施方案等开展了探索与实践。授课教师通过结合线上教学、互动教学、案例教学等多种教学模式的改革，不仅让生物工程专业的学生掌握了细胞工程的相关专业知识及科技前沿，更增强了学生的学习兴趣与积极性，提高了学生分析、解决与细胞工程相关的专业问题的能力，整体执行效果较好。本课程教学改革的实施，可为高校同类性质的其他专业课程提供借鉴与参考。
为提升工科专业课程教学质量，以成长记录袋课堂评价体系为基础，将多维立体教学法引入到高等院校生物类专业课程细胞工程的教学改革中，对课程的知识体系、施教形式、实施方案等开展了探索与实践。授课教师通过结合线上教学、互动教学、案例教学等多种教学模式的改革，不仅让生物工程专业的学生掌握了细胞工程的相关专业知识及科技前沿，更增强了学生的学习兴趣与积极性，提高了学生分析、解决与细胞工程相关的专业问题的能力，整体执行效果较好。本课程教学改革的实施，可为高校同类性质的其他专业课程提供借鉴与参考。
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摘要：
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
摘要：
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
摘要：
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
摘要：
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
摘要：
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
摘要：
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
摘要：
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
摘要：
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
摘要：
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
摘要：
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
摘要：
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
摘要：
通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的三聚氰胺抗原检测方法，对奶制品及饲料中的三聚氰胺残留水平监测提供参考。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金，标记纯化的三聚氰胺单克隆抗体，喷于试纸的金标垫。将MEL-OVA （三聚氰胺和卵清白蛋白的偶练物） 和纯化的羊抗鼠IgG 分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (质控线) 处，通过挑选试纸条材料和调试工艺参数，并最终组装成试纸条。结果显示，制备的试纸监测体系方法检出限为50 mg/L。试纸条对牛奶、奶粉和饲料中的三聚氰胺残留的检出限分别为100?mg/L、1
通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的三聚氰胺抗原检测方法，对奶制品及饲料中的三聚氰胺残留水平监测提供参考。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金，标记纯化的三聚氰胺单克隆抗体，喷于试纸的金标垫。将MEL-OVA （三聚氰胺和卵清白蛋白的偶练物） 和纯化的羊抗鼠IgG 分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (质控线) 处，通过挑选试纸条材料和调试工艺参数，并最终组装成试纸条。结果显示，制备的试纸监测体系方法检出限为50 mg/L。试纸条对牛奶、奶粉和饲料中的三聚氰胺残留的检出限分别为100?mg/L、1
摘要：
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
摘要：
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
摘要：
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。
摘要：
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
摘要：
Lipase production by Candida rugosa was carried out in submerged fermentation. Plackett-Burman statistical experimental design was applied to evaluate the fermentation medium components. The effect of twelve medium components was studied in sixteen experimental trials. Glucose, olive oil, peptone and FeCl3?6H2O were found to have more significance on lipase production by Candida rugosa. Maximum lipase activity of 3.8 u mL-1 was obtained at 50 h of fermentation period. The fermentation was carried out at optimized temperature of 30oC, initial pH of 6.8 and shaking speed of 120 r/min. Unstructured kinetic models were used to simulate the experimental data. Logistic model, Luedeking-Piret model and modified Luedeking-Piret model were found suitable to efficiently predict the cell mass, lipase production and glucose consumption respectively with high determination coefficient(R2). From the estimated values of the Luedeking-Piret kinetic model parameters, α and β, it was found that the lipase production by Candida rugosa is growth associated.
Lipase production by Candida rugosa was carried out in submerged fermentation. Plackett-Burman statistical experimental design was applied to evaluate the fermentation medium components. The effect of twelve medium components was studied in sixteen experimental trials. Glucose, olive oil, peptone and FeCl3?6H2O were found to have more significance on lipase production by Candida rugosa. Maximum lipase activity of 3.8 u mL-1 was obtained at 50 h of fermentation period. The fermentation was carried out at optimized temperature of 30oC, initial pH of 6.8 and shaking speed of 120 r/min. Unstructured kinetic models were used to simulate the experimental data. Logistic model, Luedeking-Piret model and modified Luedeking-Piret model were found suitable to efficiently predict the cell mass, lipase production and glucose consumption respectively with high determination coefficient(R2). From the estimated values of the Luedeking-Piret kinetic model parameters, α and β, it was found that the lipase production by Candida rugosa is growth associated.
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