生物工程学报  2023, Vol. 39 Issue (6): 2248-2264 |
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腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-l-methionine, SAM)是一种重要的代谢中间体，存在于所有生物体中，并在各种生物反应中发挥关键作用[1]，其化学结构如图 1所示。SAM是由微生物细胞质或生物体组织，特别是哺乳动物肝脏中的甲硫氨酸和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)在甲硫氨酸腺苷转移酶的催化下连续反应合成[2]。
SAM在转甲基过程、转硫过程和转氨丙基过程中起着重要作用，也是生物体内精胺与亚精胺合成的中间代谢物[1]。SAM的代谢途径为：在转甲基过程中，甲基被转移到甲基受体上，SAM被转化成腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine, SAH)，当产物SAH或SAH/SAM增加到一定水平时，会通过竞争性反馈抑制该反应。因此，SAH水解酶连续催化SAH分解为高半胱氨酸和腺苷可以降低SAH的积累从而有利于转甲基反应的进行。在转硫过程中，高半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶的作用下不可逆地生成胱硫醚，而后生成半胱氨酸。在转氨丙基过程中，SAM作为精胺、亚精胺的合成前体，继而生成蛋氨酸，然后在蛋氨酸腺苷转移酶(methionine adenosyltransferase, MAT)的作用下再次生成SAM[3-5]。目前SAM相关药品在肝病[6]、抑郁症[7]和癌症[8]等疾病的治疗中具有良好的疗效，市场规模已近100亿元，前景广阔。
随着市场对SAM的需求量日益增加，目前对于SAM的工业化生产极其重视。SAM的生产可以通过化学合成[9]、酶催化[10]和微生物发酵[11]来实现。化学合成法由于产物不易纯化，产率低，环境污染等原因而没有广泛应用。酶催化法与化学合成法相比，虽然产物易纯化、纯度高，并且蛋氨酸的稳定性较高，但是前体成本高，不适合工业化生产。微生物发酵法是微生物利用体内的SAM合成酶催化底物l-蛋氨酸和ATP转化为SAM，然后从发酵液中提取纯化得到SAM，其生产成本低，适合工业化生产[9, 12]，也是目前SAM的主要生产方式。SAM由雅培公司研制开发，通过酵母菌发酵生产，其制剂丁二磺酸腺苷蛋氨酸1993年在意大利上市，2000年在我国上市。国内发酵法SAM生产也取得了长足进步，主要厂家包括浙江海正药业股份有限公司、正大天晴药业集团股份有限公司、浙江震元制药有限公司、山东金城生物药业有限公司等，仅山东金城生物药业有限公司2022年SAM产能就达到180 t。国产原料药已大量出口，国产制剂打破了原研药的垄断，市场占有率已超过原研药，其中浙江海正药业股份有限公司注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸于2022年首家通过仿制药质量和疗效一致性评价。
笔者所在的浙江省生物催化与微生物发酵重点科技创新团队长期从事微生物发酵研究，在发酵法生产SAM研究方面有着丰富的经验/工作积累。2020年笔者所在团队经过5轮常压室温等离子体注入(atmospheric and room-temperature plasma, ARTP)和4轮γ-射线辐照诱变并以乙硫氨酸和制霉菌素为筛选压力筛选得到一株高产SAM的酿酒酵母突变株AC-10，摇瓶发酵SAM产量达到1.15 g/L，比出发菌株增加了130%，通过5 L发酵罐分批补料高密度发酵SAM产量达到5.62 g/L[13]。2022年笔者所在团队又对酿酒酵母ZY1-5进行了ARTP及紫外线辐照-氯化锂(ultraviolet irradiation-lithium chloride, UV-LiCl)复合诱变，并以乙硫氨酸、l-蛋氨酸、制霉菌素和虫草素为筛选压力进行筛选，进一步以乙硫氨酸为筛选压力，通过液滴微流控培养(droplet microfuidics cultivation)对突变株UV6-69进行了适应性驯化，得到突变株T11-1，在5 L发酵罐中SAM产量达到10.72 g/L，生物量达到细胞干重(dry cell weight, DCW) 105.9 g/L，SAM实际得率达到21.44 mg/g葡萄糖。进一步利用比较转录组学分析，初步揭示了SAM产量提高的可能机理[14]。本文结合笔者科研经验就近年来微生物生产SAM方面的研究进展进行综述，提出了目前生产过程中存在的问题及解决思路，并对SAM的生产进行了展望。
1 SAM的生理功能 1.1 转甲基作用SAM作为普遍存在的辅助因子，其主要的功能之一就是在甲基转移酶(methyltransferase, MTases)的催化下，作为N-、C-、O-或者S-亲核试剂的甲基供体，这是仅次于ATP的第二种最常见的有机辅因子，SAM是DNA、组蛋白和RNA甲基化的中心甲基供体，从而在基因组、表观基因组和转录组的水平上控制基因表达。此外，SAM介导的甲基化可以调节各种非组蛋白的功能[15] (图 2)。如图 2所示，甲基化是DNA的一种关键修饰，甲基从SAM转移到胞苷和腺苷可以实现DNA的甲基化。由于可以调节DNA的可及性，DNA甲基化是基因表达的一种重要调节因素。这种修饰首先在胚胎发育期间建立，并在整个生命周期中持续进行。许多甲基转移酶，包括DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)、赖氨酸甲基转移酶(lysine methyltransferases, KMTs)和肽基精氨酸甲基转移酶(peptidyl-arginine methyltransferases, PRMTs)等参与表观遗传调控。这些酶通过催化DNA和组蛋白的甲基化，导致染色质可及性、转录因子结合和基因表达发生复杂变化。甲基转移酶和去甲基化酶对组蛋白甲基化和DNA甲基化的动态调节是可逆的，受到多种代谢物的调控，而这些代谢物的产生则受细胞信号调节，产生的甲基转移酶和去甲基化酶也可能会发生突变，从而影响生物学结果[16-17]。5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, MeC)是DNA的一种重要的表观遗传修饰，在DNA-蛋白质相互作用、染色质结构、表观遗传调控和DNA修复中起着至关重要的作用。MeC由DNMTs以SAM为甲基供体对胞嘧啶的C-5位置进行酶促甲基化而产生[18]。与DNA和蛋白质的修饰相似，RNA可以分别通过甲基转移酶(也称为“Writers”)和去甲基化酶(也称为“Erasers”)进行甲基化修饰和去甲基化修饰。N6-腺苷酸甲基化(adenosine 6-methylation, m6A)是腺苷位于6位的N发生甲基化，为信使RNA (mRNA)和非编码RNA (ncRNA)中广泛存在的修饰方式，作为已知的第一个可逆的mRNA修饰，m6A已经成为表位转录领域的一个主要热点，目前已经鉴定了m6A的一组Writer蛋白和Eraser蛋白[19]。
SAM和其他代谢产物，如甘氨酸、丙酮酸、半乳糖和苏氨酸，也可以作为参与转录后RNA修饰的酶的辅助因子。这些RNA修饰作为信息的传感器(sensors)和换能器(transducers)可以控制代谢速率(如氧的消耗)和蛋白质合成[15]。SAM也与其他物质合成有关，如裸盖菇素、肌酸、香草酸、维生素、辅酶Q和许多抗生素[20-21]。Liu等[22]在大肠杆菌中引入甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶，构建了以甜菜碱为甲基源的蛋氨酸循环，利用这一循环提高了SAM的利用率，并将阿魏酸的产量提高了15.9倍。
实际上，产生的SAM分子90%以上被用于维持甲基化反应。在人类基因组中已鉴定出200多种SAM依赖性甲基转移酶编码基因。在将甲基传递给受体化合物后，SAM转化为SAH。此外，还证实了SAH水平升高和SAM水平降低会抑制转甲基化。SAM与SAH的比率通常被认为是控制体内甲基化的代谢指标，其降低表明甲基化能力的降低[23-24]。
1.2 转硫作用转硫代谢途径是连接SAM和半胱氨酸生物合成的另一个关键的分解代谢过程。SAM在转硫作用中可以作为多种含硫化合物的前体，例如谷胱甘肽、半胱氨酸等，半胱氨酸是由同型半胱氨酸通过转硫化反应生成的，之后再形成谷胱甘肽(glutathione, GSH)，这个过程主要发生在肝脏和晶状体中[25]。
1.3 转氨丙基作用SAM通过转氨丙基作用，即两次脱羧反应最后生成精胺和亚精胺。精胺和亚精胺是哺乳动物细胞中的主要多胺，并且都对衰老、免疫和癌症有重要作用[26]。Xu等[27]研究了精胺与亚精胺对小鼠大脑衰老的作用，研究表明二者增加了超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活性，降低了衰老大脑中丙二醛(malondialdehyde, MDA)的水平，其抗衰老作用与改善自噬和线粒体功能有关。
2 提高SAM产量的方式微生物发酵法是目前最常用的SAM生产方法[28]，提高微生物菌株SAM生产能力的策略主要有菌种筛选、培养基和培养条件优化以及菌种改良等。筛选野生型菌株并进行SAM生产的报道极少，如Shiozaki等[29]筛选到一株生产SAM的野生型酵母菌株Saccharomyces sake k-6，通过培养条件优化，在10 L发酵罐中SAM产量达到10.8 g/L。Li等[30]利用分离培养基从环境样品中筛选到572株菌株，其中假丝酵母(Candida sp.) S42-12生产SAM的能力最强，积累量达到35.7 mg/g菌体。培养基和培养条件优化也是提高SAM产量的途径[31-32]。Li等[33]利用营养价值高、价格低廉的豆腐黄浆液作为基质对发酵培养基进行优化，酿酒酵母CGMCC 13760利用优化的培养基在5 L发酵罐中SAM产量达到16.14 g/L。Wang等[34]考察了在补糖的同时添加磷酸氢二铵、谷氨酸钠、三磷酸腺苷二钠以提高酿酒酵母SAM0801发酵后期的稳定性，通过4批5 L发酵罐高密度补料发酵34 h左右，菌体干重超过100 g/L后，开始添加50 g的l-蛋氨酸，并在补糖液中加入10 g/L三磷酸腺苷二钠，发酵65.7 h，最高生物量达到180 g DCW/L，SAM产量达到17.1 g/L。
相较于天然菌株筛选和发酵条件优化，菌种改良是提高SAM产量最为有效的方法，目前常用的策略包括传统诱变育种和代谢工程[4]。
2.1 传统育种提高SAM产量传统微生物育种中最常用的方式为诱变育种，其原理就是人为地利用物理或化学因素有目的地使原始菌株的基因发生改变，在很短的时间内筛选出所需的适合大规模生产的正突变菌株，从而实现生物性状的有效改变[35]。目前在高产SAM菌株选育中应用最多的诱变方法包括物理诱变和化学诱变。
常用的物理诱变包括紫外辐照、航天、ARTP和γ-射线辐照等。邵娜等[36]为了研究产朊假丝酵母细胞内的硫代谢途径，实现SAM和GSH的高效联产，对产朊假丝酵母(Candida utilis) SZU07-01进行了2轮紫外诱变和1轮γ-射线辐照诱变，接种在选择培养基上进行培养，筛选到一株SAM和GSH高效联产的突变株C. utilis SUGS-01，其摇瓶发酵SAM和GSH产量分别为324 mg/L和220.5 mg/L，较原始菌株分别提高了131.4%和26.0%，其中SAM实际得率达到16.2 mg/g葡萄糖，突变株具有良好的遗传稳定性，比较适于工业化生产。Qin等[13]经过ARTP和γ-射线辐照复合诱变并结合抗性筛选，得到高产SAM酿酒酵母突变株AC-10，5 L发酵罐补料发酵SAM产量达到5.26 g/L。Huang等[37]利用太空培养并通过基因组重组对酿酒酵母菌株H5进行诱变，得到的突变株H5M147在50 L发酵罐中SAM产量达到9.64 g/L，较H5提高了86%。Weng等[14]通过ARTP和UV-LiCl复合诱变结合抗性筛选和液滴微流控培养驯化，得到酿酒酵母突变株T11-1，5 L发酵罐补料发酵SAM产量达到10.72 g/L。
化学诱变是化学诱变剂与遗传物质发生生化反应，发生的大多为点突变。近年来化学诱变筛选SAM高产菌株研究较少，其中常用的诱变剂包括亚硝基胍(ntrosoguanidine, NTG)、硫酸二乙酯、甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)和氯化锂等[38]。叶盛[39]对Candida sp. S42-12进行多轮NTG诱变和UV诱变并用乙硫氨酸和制霉菌素进行抗性筛选，获得的突变株YQ-5 SAM产量(112.1 mg/g菌体)较出发菌株提高了214.09%，经培养基优化，在以蔗糖为碳源时SAM产量达到174 mg/L。
表 1总结了2007–2022年期间利用常规育种方式提高微生物SAM产量的典型研究。从表 1可知，诱变育种在SAM产生菌育种方面应用越来越少，近5年来仅有3篇报道，虽然通过常规育种获得了高产SAM突变株，并且提高了SAM积累量，但也存在着一些局限，如工作量大、筛选过程耗时长、菌株基因型的改变具有不确定性等。
| Strain | Strategy | Titer (g/L) (fermentation time) |
Yield (mg/g) | References |
| S. cerevisiae ZY | ARTP and γ-ray radiation mutagenesis, ethionine and nystatin resistance screening |
5.62 (68 h) | – | [13] |
| S. cerevisiae H5 | Spaceflight cultivation and genome shuffling |
9.64 (84 h) | – | [37] |
| S. cerevisiae ZY1-5 | ARTP and UV-LiCl mutagenesis, droplet microfluidics cultivation with ethionine as screening pressure |
10.72 (52 h) | 21.4 | [14] |
| Candida tropicalis S42-12 | NTG and UV mutagenesis, ethionine and nystatin resistance screening, optimization of fermentation medium |
1.74 (48 h) | – | [39] |
| S. cerevisiae CGMCC 13760 | Optimization of fermentation medium | 16.14 (60 h) | – | [33] |
| S. cerevisiae SAM0801 | Optimization of fermentation medium and fed-batch fermentation |
17.10 (65.7 h) | – | [34] |
| Candida sp. S42-12 | Isolation and screening of SAM producing microorganisms from environmental samples | – (96 h) | – | [30] |
| C. utilis SZU07-01 | UV and γ-ray radiation mutagenesis | 0.324 (27 h) | 16.2 | [36] |
| –: Not mentioned or cannot be calculated due to the lack of glucose consumed. | ||||
Chen等[40]综述了提高菌株生产SAM能力的不同策略。本文主要从以下4个方面进行综述：(1) 过表达SAM合成的相关基因；(2) 支路代谢调控；(3) ATP调控；(4) 其他代谢途径。近年来，利用代谢工程策略提高SAM产量的研究日益受到重视(表 2)，研究对象主要为遗传背景清晰的酵母菌或者大肠杆菌，经过改造显著提高了SAM产量。本文关于菌株中SAM的代谢网络如图 3所示。
| Strategy | Strain | Genetic manipulation | Titer (fermentation time) |
Yield (mg/g) | References |
| Overexpression genes involved in SAM synthesis |
S. cerevisiae K6 | MAT from S. cerevisiae sam2 was overexpressed in the mutant | 2.80 g/L (72 h) | – | [41] |
| E. coli BL21 | The recombinant E. coli strain was constructed for effectively producing SAM by introducing metK | 300.9 mg/L (20 h) | 4.30 | [42] | |
| S. cerevisiae ZJU001 | Multicopy integrated plasmid pYMIKP-SAM2 was introduced into the wild strain |
8.81 g/L (52 h) | – | [43] | |
| C. glutamicum ATCC 13032 |
Knocking out thrb, metb, mcbr and Ncgl2640, overexpressing metK, vgb, lysCm, homm, metX and metY | 196.7 mg/L (48 h) | 39.34 | [44] | |
| S. cerevisiae CGMCC 2842 |
Co-expressing mat6 and sam2 | 1.55 g/L (48 h) | 31.00 | [45] | |
| Regulation of branch metabolism |
P. pastoris DS1 | Knocking out cys4 | 13.01 g/L | – | [47] |
| P. pastoris GS115 | Overexpressing MAT gene and knocking out CBS gene |
13.5 g/L (114 h) | – | [48] | |
| Pichia pastoris GS115/DS16 |
Knocking out sah1, spe2 and msm1, optimizing the amount of l-met additions |
– | – | [49] | |
| Bacillus amyloliquefaciens HSAM2 | Knocking out thrB and overexpressing sam2, optimization of fermentation parameters | 412.01 mg/L (60 h) | – | [50] | |
| Bacillus amyloliquefaciens | Recombinant plasmid expressing sam2 in S. cerevisiae and metA and metB in E. coli was combined with the absence of mccA | 648.99 mg/L (74 h) | – | [51] | |
| Regulation of ATP | C. utilis CCTCC M 209298 |
The foreign ATP6 gene from Arabidopsis was expressed in the parental strain |
223.9 mg/L (30 h) | – | [55] |
| S. cerevisiae BY4741 | The introduction of water-forming NADH oxidase, Vitreoscilla hemoglobin and phosphite dehydrogenase in combination with overexpression of the gene sam2 |
54.92 mg/L (28 h) | 2.57 | [56] | |
| S. cerevisiae WT15-33 | Knocking out sod1 and optimization of fermentation medium |
10.1 g/L (118 h) | – | [59] | |
| E. coli | Using riboswitches based on ATP sensitivity |
2.32 mg/L (24 h) | – | [57] | |
| E. coli BL21 | Expression of adenosine kinase, adenylate kinase, and acetate kinase | 8.7 g/L (18 h) | – | [58] | |
| Engineering of other metabolic pathways |
S. cerevisiae CGMCC 2842 |
Knocking out kcs1 and arg82 | 8.86 g/L (128 h) | [52] | |
| S. cerevisiae HDL | Knocking out hpa3, sah1 and glc3, overexpressing DAAO and L-PheDH | 10.3 g/L (80 h) | – | [60] | |
| S. cerevisiae BY4742 | Genome-scale engineering using a multifunctional whole-genome CRISPR (MAGIC) system | 36.5 mg/L | – | [61] | |
| S. cerevisiae CGMCC 2842 |
Knocking out reg1 and overexpressing snf1 | 8.28 g/L (140 h) | – | [64] | |
| –: Not mentioned or cannot be calculated due to the lack of glucose consumed. | |||||
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| 图 3 SAM在微生物中的生物合成途径 Fig. 3 Biosynthesis pathway of SAM in microbes. 红色字体：敲除该基因；绿色字体：过表达该基因 Red font: Gene knocked out; Green font: Gene overexpressed. |
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SAM合成酶可在胞内催化l-蛋氨酸和ATP生成SAM，通过强化SAM合成酶的表达可使得SAM过量积累。Choi等[41]对出发菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) sake K6进行紫外诱变，得到3 000株突变株，通过营养缺陷筛选法分离出一株亮氨酸缺陷型突变株K6-1，并过表达SAM合成酶基因SAM2，最终重组菌株SK6-1 SAM产量达到2.8 g/L，较出发菌株增加了21.7%。Yu等[42]将来自大肠杆菌(Escherichia coli) K-12编码SAM合成酶的metK基因克隆并连接至质粒pET-28a中，得到重组质粒pET-28a-metK，然后将其转化至大肠杆菌BL21中，构建了重组菌株，摇瓶发酵SAM产量达到34.5 mg/L，经过培养基及培养条件优化，最终摇瓶发酵SAM产量达到128.2 mg/L，SAM实际得率为6.41 mg/g葡萄糖，在5 L发酵罐中发酵SAM产量达到300.9 mg/L，SAM实际得率为4.3 mg/g葡萄糖。来自酿酒酵母的两种酶SAM合成酶I与SAM代谢的调节机制有关，并且会受到产物积累的抑制。相比之下，由sam2基因编码的SAM合成酶Ⅱ不受相对高浓度的SAM的抑制。因此选择sam2进行过表达或改造是优化MAT基因最适合的选择。Zhao等[43]将多拷贝整合质粒pYMIKP-SAM2导入野生型酿酒酵母菌株ZJU001染色体中，构建了重组菌株R1-ZJU001。该重组菌株具有更高的MAT活性，SAM合成能力也得到提升，在15 L发酵罐利用分批补料策略培养52 h后SAM产量达到8.81 g/L，比亲本菌株增加了27.1%。Han等[44]以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032为基础，通过敲除thrB、metB、mcbR和Ncgl2640等4个基因，构建了一株能够积累SAM的重组菌株C. glutamicum HW104，进而在菌株HW104中以不同的组合过表达metK、vgb、lysCm、homm、metX和metY等6个基因，结果显示同时过表达metK和vgb，得到的重组菌株HW105比其他菌株产生更多的SAM，在发酵48 h后SAM产量达到196.7 mg/L，SAM实际得率达到39.34 mg/g葡萄糖。Chen等[45]在酿酒酵母CGMCC 2842中共表达编码蛋氨酸合成酶的基因mat6和sam2以增加SAM的积累量，最终重组菌株YGSPM的SAM产量达到1.55 g/L，是原始菌株的2.34倍，SAM得率达到31 mg/g葡萄糖。
2.2.2 支路代谢的调控从图 3可以看出SAM的积累不仅可以通过过表达SAM合成酶最大化，还可以通过调控其支路代谢来达到最大化。同型半胱氨酸位于SAM代谢的关键分支点，具有3种不同的代谢途径：形成蛋氨酸、恢复为SAH或在半胱硫氨酸合成酶(cycteine synthase, CBS)存在的情况下形成胱硫醚。CBS在SAM分解中起着重要作用，通过破坏CBS阻断胱硫醚合成途径可能会增强SAM的积累[46]。Qin等[47]利用启动子文库中的弱启动子PG12将胱硫醚合成途径中的关键酶CBS编码基因cys4表达下调，构建了CBS合成途径被逐渐弱化的重组毕赤酵母G12-CBS，摇瓶培养发现，G12-CBS的生长与出发菌DS16相比没有明显差异，但胞内SAM浓度则显著提高，SAM产量达到1.68 g/L，提高了48.8%。随后，采用优化的l-蛋氨酸补料策略，在15 L发酵罐中通过分批补料发酵，G12-CBS SAM产量提高至13.01 g/L。最后，在比较转录组学分析的基础上，筛选出5个高表达的基因，其中过表达gdh2基因的重组菌株摇瓶培养时，SAM产量达到2.71 g/L，提高了52.3%。过表达MAT基因或者敲除CBS基因都可以使SAM过量积累。He等[48]研究了在毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115中两种路线协同作用对SAM产量的影响。具有异位MAT基因的重组菌株Gsam SAM产量达到0.74 g/L，是原始菌株的20倍，进一步敲除菌株Gsam的CBS基因得到重组菌株Gsam-cbs，其摇瓶发酵SAM产量达到3.6 g/L，是原始菌株的56倍，5 L发酵罐中发酵SAM产量达到13.5 g/L。Su等[49]通过敲除P. pastoris GS115/DS16 (过表达高活性MAT的重组菌)的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因sah1、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因spe2和l-甲硫氨酰tRNA合酶基因msm1，减少SAM在胞内的消耗，提高了重组菌积累SAM的能力，进一步优化l-蛋氨酸添加量，突变株G/Dsah和G/Dmsm单位菌体的SAM产量分别提高了26.4%和28.9%。Jiang等[50]为了提高无蛋氨酸培养基中SAM的产量，在解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) HSAM2中敲除thrB阻断分支途径后，所得突变体HSAM4 SAM达到143.93 mg/L，比HSAM2增加了42%。过表达sam2使重组菌SAM产量提高至226.92 mg/L，在对关键发酵参数进行优化后，突变体HSAM4 SAM产量最高达到412.01 mg/L，SAM的实际得率达到41.2 mg/g葡萄糖。Ruan等[51]设计了SAM的合成途径，并将其与B. amyloliquefaciens中的三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)相结合，以提高无蛋氨酸培养基中SAM的产量，通过酿酒酵母中sam2和大肠杆菌中metA与metB的重组质粒表达结合mccA的缺失，构建了重组毕赤酵母HSAM3，最终SAM产量达到648.99 mg/L。
2.2.3 ATP调控ATP为几乎所有的细胞功能提供动力，是细胞新陈代谢的至关重要的调节剂。细胞必须产生足够的ATP以满足其生物合成需求和维持细胞生长。ATP参与许多代谢反应，控制ATP供应和消耗是实现微生物生产高产量目标代谢物的最有效的策略之一[49, 52-53]。细胞内ATP生物合成的调节策略包括调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)的可用性、调节电子传递链、氧供应、质子梯度和FoF1-ATPase活性。基于目前对物质代谢和能量代谢的更深入理解以及合成生物学的迅速发展，学者们已在各种宿主菌中通过ATP调控来提高目标产物的浓度和生产能力[54]。
作为前体和驱动力，ATP对于微生物中SAM的合成是必不可少的。Xu等[55]为了改善C. utilis CCTCC M 209298中SAM过量产生导致的ATP供应不足问题，在亲本菌株中表达来自拟南芥的外源ATP6基因，通过基因组整合构建突变体C. utilis ATP6菌株，增加了FoF1-ATP酶活性和NADH可用性，并改善了ATP再生和细胞内ATP供应。最终突变株C. utilis ATP6的SAM产量达到223.9 mg/L，与亲本菌株相比增加了46.6%。Chen等[56]在酿酒酵母中采用了一种新的ATP调控策略来增强SAM的生物合成，包括改变NADH的可用性和调节氧气供应两个方面。在引入产水型的NADH氧化酶、透明颤菌血红蛋白(vitreoscilla hemoglobin, VHB)和亚磷酸脱氢酶的基础上，结合sam2的过表达，设计了不同的ATP调控系统。其中引入VHB所得到的重组菌株ABYSM-2 SAM产量达到54.92 mg/L，比原始菌株增加了67%，SAM实际得率为2.75 mg/g葡萄糖。Chen等[57]首次提出了一种基于ATP敏感的核糖开关ydaO基序、多聚磷酸酶(polyphosphate kinase, PPK)和VHB的新ATP再生策略并在大肠杆菌中得到成功应用，促进了GSH和SAM的联产。在发酵过程中，重组菌株CGS-2生产GSH和SAM的能力比原始菌株分别提高了137.4%和82.18%。由于ATP价格昂贵，导致SAM生产成本提高，所以有研究者尝试利用一些前体物质来代替ATP以降低成本。Jiang等[58]构建了同时表达腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶3种酶的重组大肠杆菌BL21，催化底物腺苷(adenosine, ACP)合成ATP，并优化了反应体系，最终重组菌株SAM产量达到8.7 g/L，ACP转化率达到72.5%。最近笔者所在团队Hu等[59]分别研究了NADH的转化和ATP酶必需基因的相对表达。结果表明，sod1基因缺失有利于ATP的生成，ATP对SAM的合成有积极的调控作用。所以从酿酒酵母WT15-33中敲除sod1基因，得到提高ATP供给的突变株ΔSOD1，然后通过培养基优化，最终在5 L发酵罐中突变株SAM产量达到10.1 g/L，比原始菌株提高了38.4%。
2.2.4 其他代谢途径除了以上方向，目前也有利用其他途径增加SAM产量的研究。目前发酵法生产SAM都以l-蛋氨酸为底物，但消旋的dl-蛋氨酸由于价格便宜，更适合用作工业化SAM生产的底物。然而，由于SAM合成酶的底物专一性，d-蛋氨酸对SAM的形成效率不高。为了提高dl-蛋氨酸的利用效率，连佳长团队[60]对模式菌株酿酒酵母BY4741和工业菌株S. cerevisiae HDL进行了改造，以利用dl-蛋氨酸生产SAM (图 4)，首先通过破坏编码d-氨基酸-N-乙酰转移酶的hpa3基因，在胞内积累d-蛋氨酸，然后引入密码子优化的d-氨基酸氧化酶基因(d-amino acid oxidase gene, DAAO)和l-苯丙氨酸脱氢酶基因(l-phenylalanine dehydrogenase gene, L-PheDH)将d-蛋氨酸转化为l-蛋氨酸。在0.5 g/L dl-蛋氨酸条件下，改造的BY4741中的SAM浓度和含量分别提高了110%和72.1%，而在改造的菌株HDL中，SAM的浓度和含量分别提高了38.2%和34.1%。继而利用新开发的CRISPR工具将DAAO和L-PheDH表达框整合至hpa3和sah1基因座、sam2表达框整合至HDL菌株spe2和glc3基因座，在0.5 g/L dl-蛋氨酸条件下，所得的重组菌株HDL-R2 SAM浓度和含量分别增加289%和192%。在10 L发酵罐中发酵时，补加16 g/L dl-蛋氨酸可积累10.3 g/L SAM，SAM含量达到242 mg/g菌体。虽然在酵母中已经实现了SAM高水平生产，但还需要新的代谢工程策略来进一步提高重组菌的工业应用性。Dong等[61]利用多功能全基因组CRISPR (multi- functional genome-wide CRISPR, MAGIC)系统进行基因组规模工程(genome- scale engineering, GSE)以确定SAM过量生产的新靶点，并在工业酵母菌株中进一步验证这些新确定靶点的效果。首先，构建并优化了SAM响应的基因回路作为细胞内SAM浓度的生物传感器。然后使用生物传感器辅助的GSE来识别新的遗传决定因素，以增强酵母中SAM的积累，其中snz3、rfc4和rps18b的上调被确定为最佳组合并进行了转录组学和代谢组学的分析，以探究增强SAM积累的分子机制。最后将最佳组合应用于实验室酵母菌株BY4742- iAID6和工业酿酒酵母HD，SAM生产力分别提高了2.2倍和1.6倍。
糖酵解在碳代谢中起关键作用，通常是代谢工程的目标。糖酵解中间体与l-天冬氨酸、l-丝氨酸和l-蛋氨酸等氨基酸的代谢有关。在这些中间体中，丙酮酸被转化为乙酰辅酶A，后者在三羧酸循环中代谢，转化为l-蛋氨酸或l-天冬氨酸。3-磷酸甘油酸酯通过多步反应转化为l-丝氨酸。l-天冬氨酸和l-丝氨酸通过不同途径参与l-蛋氨酸的代谢。因此，糖酵解的代谢重编程可能是一种极有潜力的提高酵母SAM合成的策略[62-63]。为提高SAM在酵母中的积累，Chen等[52]提出了一种通过改变肌醇焦磷酸(inositol pyrophosphates, IPs)代谢增强糖酵解的策略。他们将酿酒酵母CGMCC 2842中与IPs代谢相关的基因arg82、ipk1和kcs1分别敲除。与对照组相比，kcs1和arg82基因的缺失分别使重组菌株SAM产量增加了83.3%和31.8%。除了多种糖酵解基因转录水平和相关酶活性提高外，糖酵解中间体和ATP水平也有所提高。为进一步证实可行性，在缺失苹果酸合成酶基因mls1的SAM高产菌株Ymls1ΔGAPmK中敲除kcs1基因，并将乙酰辅酶A合成酶基因acs2和婴儿利什曼原虫SAM合成酶基因metK1共表达，得到重组菌株Ymls1Δkcs1ΔGAPmK，其在250 mL摇瓶和10 L发酵罐中SAM的发酵产量分别达到2.89 g/L和8.86 g/L，与菌株Ymls1ΔGAPmK相比分别提高了30.2%和46.2%，SAM的得率分别为57.8 mg/g葡萄糖和13.6 mg/g葡萄糖。Chen等[64]利用酿酒酵母CGMCC 2842敲除reg1基因和过表达snf1来缓解葡萄糖抑制，提高葡萄糖转运和糖酵解相关基因的表达水平，提高葡萄糖利用率，从而提高酿酒酵母SAM的产量。最终突变株Yreg1ΔPsnf1的SAM产量达到8.28 g/L，比原始菌株提高了51.6%。
综上所述，影响微生物SAM合成的关键因素主要为SAM合成酶的活力、SAM的代谢和底物ATP的供应等。其相应的改造策略主要包括过表达SAM合成酶相关基因增强菌株生产SAM能力、阻断SAM支路代谢增加SAM积累以及辅因子ATP调控强化ATP供应提高菌株SAM的积累。
总之，从文献来看，与传统诱变育种方法相比，SAM产生菌的代谢工程改造已成为研究热点，这主要是由于：(1) 代谢工程策略通过生物信息学分析和实验可以确定宿主菌的关键代谢途径与代谢节点，随之进行针对性改造以提高目标产物的产量和菌种性能，操作步骤简单[64]；(2) 代谢工程改造手段包括基因敲除和过表达等技术成熟[64]；(3) CRISPR-Cas9系统的发展为SAM产生菌的改造提供了高效、快速并且简便的工具[65]；(4) SAM响应的基因回路的构建和应用大大提高了重组SAM生产菌株的筛选效率[49]。
3 结论与展望SAM市场前景广阔，其高效生产具有重要意义。微生物发酵法是SAM主要生产方法，当前的研究重点是通过菌种改良提高SAM产量，虽然已取得了一定的进展，但在菌株生产能力提高和SAM检测等方面还存在着挑战。
在生产能力方面，野生菌株和工程菌株的SAM合成能力都有很大提升空间，需要更系统的工作构建高效的细胞工厂以更好地满足工业化需求[66-67]。鉴于目前重组菌种用于工业化生产存在一定困难，传统的诱变育种仍将发挥重要作用[68]，液滴微流控驯化等技术也能够提高菌种改良效率[69]，而基因工程技术在菌种改造中也展现了巨大潜力，是今后的重点发展方向，更值得关注的是将系统生物学、合成生物学和进化工程的工具和策略与传统代谢工程相结合的系统代谢工程技术[70]。组学技术的进步为确定关键途径和靶点并对菌种进行针对性改造、构建性状提高的生产菌种提供了有力的工具盒[71]，如Weng等[14]和Dong等[61]通过组学分析解析了重组菌株SAM产量提高的机理，Hayakawa等[72]通过代谢组分析确定了酿酒酵母SAM合成的限速步骤。
在SAM检测方面，目前SAM主要利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)方法检测，工作量大且繁琐，开发高通量检测方法可以大大加快SAM高产菌株筛选效率并实现发酵过程的高效控制与检测。近年来，由于能灵敏、特异和快速感应代谢物浓度信号并将其转换为特定信号输出，基于转录因子的代谢物生物传感器(biosensor)在代谢工程和合成生物学中备受关注[69]。基因电路是目前合成生物学的热点之一，常用于理性育种等方面，且在理性育种的高通量筛选中具有重要作用[73]。Umeyama等[74]基于大肠杆菌的操纵基因metO和抑制子MetJ在酿酒酵母中构建了一个SAM响应基因电路，可以监测胞内SAM相对含量，进而从基因组文库中鉴定到一个促进SAM合成的多拷贝增强子。Dong等[61]利用MAGIC技术在酿酒酵母中构建并优化了一个SAM响应的基因电路，用于确定SAM过量合成关键靶点并在工业菌株中进行了验证，但具体的SAM含量仍用HPLC检测。Chen等[75]构建了一种基于转录因子的生物传感器，能够以荧光作为输出，以剂量依赖的方式对酿酒酵母细胞中SAM进行传感。这几项研究为开发高通量SAM特异性生物传感器、提升SAM检测效率奠定了基础。
综上所述，基于诱变-遗传操作-高通量筛选-生物信息学分析-发酵工艺优化多策略组合将成为SAM生产菌改良的主流技术，为SAM工业化生产奠定扎实的基础。
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表1(Table 1)
