2024, Vol. 40中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 白振敏, 郭姝媛, 杨一群, 庄周康, 曹文兵, 杨研, 于涛, 汤红婷
- BAI Zhenmin, GUO Shuyuan, YANG Yiqun, ZHUANG Zhoukang, CAO Wenbing, YANG Yan, YU Tao, TANG Hongting
- 微生物利用CO2及其低碳衍生物为原料制备粮食类产物的研究进展
- Microbial production of food compounds with carbon dioxide and derived low-carbon molecules as substrates
- 生物工程学报, 2024, 40(8): 2731-2746
- Chinese Journal of Biotechnology, 2024, 40(8): 2731-2746
- 10.13345/j.cjb.240164
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文章历史
- Received: February 28, 2024
- Accepted: July 11, 2024
- Published: July 12, 2024
引用本文
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2. 中国科学院深圳先进技术研究院 深圳合成生物学创新研究院 合成生物化学研究中心, 广东 深圳 518055;
3. 中国科学院深圳先进技术研究院 深圳合成生物学创新研究院 定量合成生物学重点实验室, 深圳 518055;
4. 中国科学院深圳先进技术研究院 碳中和与粮食安全交叉创新联合实验室, 广东 深圳 518055
2. Center for Synthetic Biochemistry, Shenzhen Institute of Synthetic Biology, Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518055, Guangdong, China;
3. CAS Key Laboratory of Quantitative Engineering Biology, Shenzhen Institute of Synthetic Biology, Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518055, Guangdong, China;
4. Carbon Neutrality and Food Security Cross-Innovation Joint Laboratory, Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518055, Guangdong, China
近年来，随着全球工业化步伐的加快，人类每年向大气中排放二氧化碳(CO2)超过350亿t，且呈现逐年增加的态势[1]。资料显示，人为排放的CO2通过自然过程所吸收的量约为54%，其中24%通过海洋吸收，30%由陆地生态系统吸收，剩下的46%则留存于大气中[2]。CO2持续累积导致其在大气圈中的浓度日渐升高，被认为是导致温室效应加剧、全球变暖的可能性因素。习近平总书记2020年9月在第七十五届联合国大会上提出“双碳”目标，即中国二氧化碳排放力争于2030年前达到峰值，努力争取于2060年前实现碳中和，旨在促进实现中国经济快速向高质量可持续发展转型。
当前，全球面临饥饿和营养不良危机的人口规模仍然巨大。世界粮食计划署通过对59个国家的调查发现，2023年仍然有约2.82亿人面临严重的粮食短缺[3]。预计到2050年，全球人口将达到近90亿–110亿人，全球对食物的需求预计将增加70%[4-5]。农业为社会提供食物和许多原材料，但受限的可耕种地面积和气候变化使得农业领域面临日益严峻的挑战，几乎无法满足不断增长的粮食需求。
为了促进CO2的利用，同时缓解粮食短缺问题，开发不占用可耕种土地即可将CO2固定为粮食类化合物的研究受到了广大学者的关注。自然光合生物为地球生命体系演化繁衍提供了物质基础，虽然光合作用可以有效减少大气中的二氧化碳，但是其CO2利用速率有限，难以在完全转化过量排放的CO2的同时实现足量粮食的生产[6]。因此，第三代生物炼制，即通过微生物细胞工厂将可再生能源和CO2转化为化学品，已经逐渐成为现阶段的研究热点[7]。
目前，利用自养微生物，例如蓝细菌和微藻，构建以CO2为原料合成产物的途径是第三代生物炼制的重要技术之一。然而，天然自养微生物的目标化合物生产种类少且产量较低、细胞生长慢、匮乏的遗传操作技术且产品难以分离，因此限制了其在工业上的实际应用[8-9]。在过去几十年里，通过热、电化学等方法，将CO2转化为碳链长度为Cn≤3的简单低碳(C1–3)化合物的研究取得了巨大进展[10-13]，但这些方法不适用于生产复杂结构的高碳产物，而微生物细胞工厂已被广泛、成功地应用于天然产物、大宗化学品、生物能源等高碳产物的生产。因此，将CO2衍生的C1–3化合物拓展为发酵原料，再通过微生物细胞工厂合成目标产物，为将CO2间接转化成高碳化合物提供了可靠的技术。此外，在异养微生物中构建固碳途径使其能够直接利用CO2，也成为了备受关注的技术，并已经取得了一定的研究成果[14-15]。
碳水化合物和蛋白质是重要的粮食类化合物。碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖和淀粉，是自然界中最丰富和广泛分布的有机物质之一，也是所有生物体的基本组成部分。2021年，美国国家航空航天局(National Aeronautics and Space Administration, NASA)发起了一项世纪挑战，旨在将CO2转化为碳水化合物，实现可循环食品的制造，从而为未来太空探索提供重要的物质基础。此外，蛋白质是人类饮食中所必需的营养物质，在体内发挥着重要的作用。因此，本文主要聚焦于直接或者间接以CO2为原料制备粮食类化合物的相关研究，围绕以CO2衍生的低碳化合物为原料合成葡萄糖、糖类衍生物、单细胞蛋白及人工碳固定途径的开发及应用等方面的研究进展进行综述。
1 利用低碳化合物为原料高效合成葡萄糖葡萄糖作为最重要的单糖分子，不仅是生物大分子的基本成分，还是生物体中最重要的能量分子，被广泛地应用于食品、发酵及医药等领域。目前，工业生产葡萄糖的制备原理是原料中的淀粉经过酸水解或酶水解形成葡萄糖，大致过程是玉米或马铃薯等原料经过提取、液化、糖化、精制、结晶和干燥最终形成葡萄糖。最近，通过微生物细胞工厂利用CO2及其衍生的低碳化合物为原料合成葡萄糖的研究，不仅能减少葡萄糖制备成本，降低对粮食原料的消耗，还可缓解温室效应，推动可再生能源的绿色可持续制造。
中心碳代谢途径是生物体内碳元素流动和转化的网络系统，包括糖酵解途径、糖异生途径(gluconeogenesis)、柠檬酸循环(citric acid cycle, CCC)和磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)。糖酵解是细胞中最经典、最基础的葡萄糖消耗途径之一。在这一过程中，葡萄糖分子被分解为丙酮酸等产物，并生成2分子ATP和2分子NADH，为细胞提供能量。糖异生途径为糖酵解的一种逆反应过程，过程中大多酶与糖酵解途径一致，是细胞进行葡萄糖合成的途径。
基于糖异生途径的设计和改造，多个团队已经实现CO2转化为葡萄糖的研究(表 1)。2016年，Milo团队[16]在大肠杆菌中引入卡尔文循环(Calvin Benson Bassham cycle, CBB)，并通过敲除负责催化3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate, 3PG)生成2-磷酸甘油酸(2-phosphoglycerate, 2PG)的关键酶——磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase, gpmA/gpmM)来打断糖酵解途径，将整个中心碳代谢分为两个模块：一个包含上糖酵解、糖异生途径、CBB循环；一个模块包含下糖酵解及三羧酸(tricarboxylic acid cycle, TCA)循环；该菌株经过适应性进化后，实现了大肠杆菌(Escherichia coli)利用CO2合成细胞生物质及PPP途径中的多个内源磷酸糖，如6-磷酸己酮糖、4-磷酸赤藓糖，首次提出了通过工程菌株利用一碳合成糖的概念。2019年，Antoniewicz团队[17]首次在大肠杆菌中利用木糖合成葡萄糖，通过敲除E. coli中葡萄糖转变为葡萄糖6-磷酸(glucose-6-phosphate, G6P)过程中的两个酶PtsI和Glk，并进一步敲除糖酵解和PPP途径中的果糖激酶pfkA和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, Zwf)，打断其余的碳同化路径，最终产生(1.8±0.1) mmol/OD600的葡萄糖。2022年，于涛课题组报道了电化学-生物合成偶联将CO2转化为葡萄糖的研究，该研究通过打断酿酒酵母糖酵解的第1步，即敲除3个关键的己糖激酶，包括葡萄糖激酶1 (glucokinase, Glk1)、己糖激酶1 (hexokinase isoenzyme 1, Hxk1)、己糖激酶2 (hexokinase isoenzyme 2, Hxk2)，使得葡萄糖不能磷酸化形成G6P，因而不能进入中心碳代谢被利用，形成葡萄糖泄露表型；随后，进一步敲除己糖激酶(N-acetylglucosamine kinase, YLR446W)以及葡萄糖激酶2 (hexokinase, Emi2)，过表达糖异生途径的关键酶和葡萄糖1-磷酸酶(glucose 1-phosphate phosphatase, AgpP/Yihx)的编码基因，提高细胞中G6P和葡萄糖-1-磷酸(glucose 1-phosphate, G1P)向葡萄糖的转化量，最终实现乙醇和乙酸向葡萄糖的转化，产量在2.0 g/L左右[18]。该工作为CO2通过电化学偶联微生物细胞工厂合成葡萄糖提供了概念性验证。2023年，该课题组将底物拓展至一碳底物甲醇、二碳化合物乙二醇、三碳化合物异丙醇等，其中利用毕赤酵母作为底盘实现了甲醇合成葡萄糖，摇瓶产量达到1.3 g/L；同时，为了进一步提高由乙醇转化生成葡萄糖的产量，过表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, Pck1)来增强糖异生途径、敲除糖酵解途径中的丙酮酸激酶(pyruvate kinase, Pyk1/Pyk2)以及敲除1型蛋白磷酸酶的调控亚基(regulatory subunit of type 1 protein phosphatase Glc7p, Reg1)缓解葡萄糖抑制作用，最终使得葡萄糖产量提高近1倍[19]。吕雪峰课题组2023年的研究展示了通过改造蓝细菌的代谢底盘，包括敲除蓝细菌的2个葡萄糖激酶、表达糖异生的相关酶，最终实现利用聚球藻(Synechococcus elongatus) PCC 7942生产葡萄糖，产量达到2.0 g/L，经过3批次补料发酵，最终积累5.0 g/L葡萄糖，占固定碳通量的70%以上[20](表 1)。
| Host | Substrates | Glucose production | References |
| Escherichia coli | Xylose | (1.8±0.1) mmol/OD600 | [17] |
| Saccharomyces cerevisiae | Acetic acid, ethanol | 1.8 g/L from acetic acid; 2.3 g/L from ethanol | [18] |
| Pichia pastoris | Methanol, glycerol | Methanol as carbon source: 1.3 g/L in flask; 13.4 g/L in 1 L bioreactor Glycerol as carbon source: 13.8 g/L in 1 L bioreactor |
[19] |
| S. cerevisiae | Ethanol | 4.3 g/L in flask; 18.2 g/L in 1 L bioreactor; | [19] |
| Synechococcus elongatus PCC 7942 | CO2 | 2.0 g/L in flask; 5.0 g/L under fed-batch fermentation | [20] |
近年来，随着生物技术的迅猛发展，以甲醇等低碳原料生物制备糖类衍生品的研究逐渐受到关注。糖类衍生品作为一类重要的生物分子，在医药[21]、食品、化妆品[22]等领域具有广泛的应用前景，其中包括氨糖、肌醇、甘露糖、木糖醇等产品。
2.1 氨基葡萄糖氨基葡萄糖(glucosamine, GlcN)是一种天然的氨基单糖，是功能性葡萄糖衍生品。氨基葡萄糖及其乙酰化衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)已被广泛用于食品、化妆品和制药行业[23]。传统的制备方式是通过从蟹壳和虾壳中提取的壳聚糖进行酸水解进行生产。微生物发酵法生产氨基葡萄糖作为环境友好、条件温和、安全性高的一种生产方式，已经吸引了众多研究者的关注。目前氨基葡萄糖的生产主要以葡萄糖作为碳源，作为二氧化碳还原的产物，低碳原料的利用越来越多地受到研究者的关注。
Ma等[24]共利用葡萄糖和低碳原料甘油发酵，在大肠杆菌中实现了乙酰氨基葡萄糖的高效合成，通过敲除PfkA基因，提升了甘油的利用率，并且通过优化甘油和葡萄糖的比例，实现了生长和产物合成的平衡，最终在5 L发酵罐中产量达到了179.70 g/L。Tang等[19]通过对酿酒酵母及毕赤酵母的工程化改造，过表达来源于多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的葡萄糖胺-6-磷酸酶(glucosamine-6-phosphate phosphatase, GlmP)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶(glucosamine-6-phosphate deaminase, GlmD)，分别实现了甲醇、乙醇、甘油作为唯一碳源合成氨基葡萄糖，摇瓶发酵产量分别达到了29.08、37.04以及41.69 mg/L。相较于葡萄糖作为碳源，低碳原料合成氨基葡萄糖的产量还有很大提升空间。
2.2 肌醇肌醇是一种天然糖醇化合物，属于维生素B族中的一种，是人和动物生长的必需物质。肌醇广泛应用于医药工业、食品工业以及水产动物饲料中[25-26]。肌醇的传统生产方式为以米糠饼粕为原料的水解植酸盐法，条件相对苛刻[27]。2017年，张以恒教授团队设计构建了一条人工合成路径实现了以淀粉为原料合成肌醇，开创了生物法合成肌醇的先河[28]。并且，通过优化迭代重组酶发酵工艺、肌醇分离提取工艺、优化体外多酶配比[29-30]，实现了肌醇的万吨级工业化生产，这一目标的实现标志着肌醇产业向可持续工业生产迈进重要一步。
微生物发酵法合成肌醇由于具有环境友好、操作流程简单等优势，正在受到越来越多的关注。肌醇的生物合成通过关键中间体G6P经过肌醇1-磷酸合成酶(inositol-1-phosphate synthase, IPS)催化合成肌醇1-磷酸，再经过肌醇单磷酸酶(inositol monophosphatase, IMP)催化合成肌醇。采用微生物发酵法合成肌醇的主要碳源类型包括淀粉、纤维素、蔗糖、木糖、葡萄糖等，以低碳原料作为碳源生产肌醇相对较少。
甘油和葡萄糖作为混合碳源，可用于肌醇的生产。Tang等[31]通过在大肠杆菌中优化IPS及IMP酶组合、过表达甘油激酶消除葡萄糖对甘油利用的抑制效应并且引入组成型启动子等策略，提升了细胞的生长以及肌醇产量，最终在3 L发酵罐中肌醇产量达到76.00 g/L。You等[32]通过进一步在大肠杆菌中敲除pgi、pfkA、pykF等基因，增加中间体G6P供应，优化了碳源在细胞生长和肌醇生产中的代谢平衡，使得在1 L发酵罐中肌醇的产量达到106.30 g/L。
最近，将CO2及其衍生的低碳化合物拓展为发酵原料的研究也获得了广泛关注。Wang等[33]在集胞藻PCC 6803中引入酿酒酵母来源的IPS和谷氨酸棒杆菌来源的IMP，实现了以CO2为原料直接合成肌醇，随后通过过表达IPS、调控竞争路径以及增加碳固定等策略使肌醇产量达到了12.72 mg/L。Tang等[19]通过在酿酒酵母和毕赤酵母中过表达内源肌醇单磷酸酶(inositol-3-phosphate synthase, Ino1)，引入大肠杆菌来源肌醇单磷酸酶(inositol-1-monophosphatase, SuhB)以及肌醇转运蛋白(myo-inositol transporter, Itr1)，分别实现了以甲醇、乙醇、甘油为唯一碳源生产肌醇，产量分别达到了129.67、228.71、40.00 mg/L。这一研究扩大了肌醇合成的底物范围，但是肌醇产量还有进一步的优化空间。
2.3 木糖醇木糖醇是一种五碳糖，是天然糖醇化合物，通常作为人造甜味剂用于食品和医药工业中。与蔗糖(4.0 cal/g)相比较，木糖醇的热量值较低(2.4 cal/g)，但其相对甜度与蔗糖几乎相同。木糖醇的工业生产是采用雷尼镍催化剂，通过化学加氢过程将来自半纤维素水解液中的木糖转化为木糖醇[34]。这种生产方式流程繁琐、不可持续。因此，采用微生物发酵的方式取代化学法具有很大的优势。
当前木糖醇的微生物生产集中在筛选及优化木糖代谢利用的菌株，赵惠民团队通过在酿酒酵母中通过对不同的基因元件进行从头组装设计，筛选得到了木糖利用性能优异的菌株[35]。目前，以低碳原料作为唯一碳源生产木糖醇的研究较少。Tang等[19]通过敲除Tkl1和Tkl2基因减少木酮糖-5-磷酸的消耗，通过替换可逆的木糖激酶(xylulokinase, Xks1)为来源于枯草芽孢杆菌的不可逆磷酸酶(phosphatase, AraL)，并敲除木糖醇脱氢酶基因Xyl2，实现了在酿酒酵母中以乙醇为唯一碳源合成木糖醇，使其产量达到4.30 mg/L。
2.4 蔗糖蔗糖分子作为典型的二糖分子，在食品、医药、化工等领域广泛应用，并且是很多工业品的重要中间体。当前蔗糖的工业生产主要是通过在甘蔗和甜菜中进行提取，流程较为繁琐，利用细胞工厂以低碳原料进行高效生物合成蔗糖将会极大地降低生产流程和生产成本。
蓝细菌作为一种重要的利用光合作用的宿主菌株，成为开发蔗糖生产的重要细胞工厂[36]。集胞藻中蔗糖的合成路径和植物中蔗糖合成路径一致，蔗糖合成是由蔗糖磷酸合成酶(sucrose-phosphate synthase, SPS)和蔗糖磷酸磷酸化酶(sucrose-phosphate phosphatase, SPP)两个酶顺序催化将底物UDP-葡萄糖和果糖-6-磷酸转化为蔗糖。Ducat等[37]首次将大肠杆菌来源的蔗糖转运蛋白(sucrose transporter, CscB)引入到聚球藻PCC 7942中，实现了蔗糖的分泌表达，通过对CscB进行诱导表达，并调整盐胁迫条件，在聚球藻PCC 7942中蔗糖产量达到2.70 g/L。Song等[38]在聚球藻UTEX 2973中引入CscB基因，同时替换盐胁迫条件中钠离子为钾离子，单次发酵蔗糖产量达到3.50 g/L。Du等[39]在集胞藻PCC 6803的研究中，发现同时过表达SPS、SPP以及葡萄糖焦磷酸酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UGP)，可以显著提升蔗糖合成能力。Qiao等[40]在集胞藻PCC 7942菌株中同样证明了过表达SPS基因能够显著提升蔗糖合成能力。
酵母作为模式生物，以其为底盘细胞构建的微生物细胞工厂用于转化低碳原料合成蔗糖的研究也受到了关注。Tang等[19]通过在酿酒酵母中引入多拷贝集胞藻来源的SPS、SPP以及豌豆来源的蔗糖转运蛋白(sucrose transporter, SUF1)，同时敲除蔗糖利用相关基因，包括蔗糖酶基因Suc2；麦芽糖酶基因Mal12、Mal22、Mal32；异麦芽糖酶基因Ima1、Ima2、Ima3、Ima4和Ima5，实现了以低碳原料乙醇、甘油、异丙醇分别作为唯一碳源合成蔗糖，摇瓶发酵产量分别为1.17、2.35、0.38 g/L。由于毕赤酵母不能直接利用蔗糖，因此直接在毕赤酵母中引入SPS、SPP及SUF1，实现了以甲醇为唯一碳源合成蔗糖，产量为0.41 g/L。
2.5 淀粉淀粉作为一类重要的多糖化合物，是重要的糖类储存形式，也是人类重要的粮食产品以及生物工业重要原料。淀粉的生产主要依赖于植物的种植，包括大米、小麦、马铃薯等，占用了大量的耕地面积。人口的快速增长以及气候变化的加剧导致耕地面积减少，使得研究人员需要寻找其他更加高效的生产方式来生产淀粉。通过生物合成的方式来生产淀粉作为一种新的产业形式，近年来吸引了越来越多的关注。目前的生物合成方式集中在体外生物转化法，前期的研究集中在将纤维素通过酶法转化为淀粉[41-44]。
Cai等[45]在体外从头构建了淀粉人工合成路径，包括C1模块、C3模块、C6模块以及Cn模块；首先C1模块通过热催化将二氧化碳转化为甲醇，通过C3模块将甲醇转化为D-甘油醛3-磷酸，通过C6模块将D-甘油醛3-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸，最后通过Cn模块实现了葡萄糖6-磷酸合成直链淀粉和支链淀粉，其中直链淀粉产量达到1.64 g/L，支链淀粉产量达到1.28 g/L。
微生物发酵法相较于酶法合成，尽管其生产能效和生产速率相对较低，但是具备工业放大流程简单、无需酶制剂及辅因子制备等优势，在低碳利用转化领域也得到关注。Tang等[19]通过在酿酒酵母引入马铃薯来源的α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase, PGP)，同时敲除糖原合成路径相关基因Glg1、Glg2、Glc3、Gsy1和Gsy2，在以乙醇为唯一碳源的培养条件下，在酿酒酵母中淀粉产量达到了343.84 mg/L。在毕赤酵母中引入PGP及敲除糖原合成基因，在以甲醇为唯一碳源的培养条件下，淀粉产量达到了117.74 mg/L[19]。未来利用代谢工程的手段，淀粉合成的产量可能会进一步提升(表 2)。
| Product | Host | Titer | Carbon source | References |
| Glucosamine | E. coli | 179.70 g/L | Glucose and glycerol | [24] |
| S. cerevisiae | 37.04 mg/L 41.69 mg/L |
Ethanol Glycerol |
[19] | |
| P. pastoris | 29.08 mg/L | Methanol | [19] | |
| Myo-inositol | Synechocystis | 12.72 mg/L | CO2 | [33] |
| E. coli | 76.00 g/L | Glucose and glycerol | [31] | |
| 106.30 g/L | [32] | |||
| S. cerevisiae | 228.71 mg/L 40.00 mg/L |
Ethanol Glycerol |
[19] | |
| P. pastoris | 129.67 mg/L | Methanol | ||
| Xylitol | S. cerevisiae | 4.30 mg/L | Ethanol | [19] |
| Sucrose | Synechocystis | 2.70 g/L | CO2 | [37] |
| 3.50 g/L | [38] | |||
| 577.80 mg/L | [39] | |||
| S. cerevisiae | 1.17 g/L | Ethanol | ||
| 2.35 g/L | Glycerol | [19] | ||
| 0.38 g/L | Isopropanol | |||
| P. pastoris | 0.41 g/L | Methanol | [19] | |
| Amylose | Cell free system | 1.64 g/L | CO2 | [45] |
| S. cerevisiae | 343.84 mg/L | Ethanol | [19] | |
| P. pastoris | 117.74 mg/L | Methanol | [19] | |
| Amylopectin | Cell free system | 1.28 g/L | CO2 | [45] |
蛋白质是人类饮食中所必需的营养物质，在体内发挥着重要的作用。2019–2021年间，全球动物蛋白质消费量达到3.276 83亿t，预计到2025年，其市场价值将达到7.3万亿美元[46]。到2050年，世界每年需要生产12.5亿吨肉类和奶制品，才能满足当前消费水平下全球对动物源性蛋白质的需求[47]。然而，由于饲料转化为肉类和乳制品的效率较低，通过增加肉类和乳制品产量几乎无法可持续地满足不断增长的蛋白质需求。
单细胞蛋白(single cell protein, SCP)，也被称为微生物蛋白，常用微生物包括酵母、真菌、藻类和细菌等[48]。与传统的动植物蛋白相比，单细胞蛋白具有生产效率高、周期短、对环境影响小、更有利于人类健康和生态系统等优点[49]，能够缓解人口过度增长造成的世界粮食危机，并满足部分地区高蛋白质消费需求。单细胞蛋白含有人体必需的氨基酸、维生素和矿物质[50]，具有良好的营养价值。因此，单细胞蛋白不仅可以作为动物饲料使用，也逐渐被开发成适合人类食用的各种食品[51-52]。
近些年，将CO2及其衍生的低碳化合物转化为高价值的单细胞蛋白的技术逐渐受到关注，其不仅能够促进一碳的利用，还能促进蛋白质的可持续发展[47-53]。目前，有多种微生物利用不同的一碳原料进行SCP生产。
3.1 甲醇为原料生产单细胞蛋白甲醇是一种清洁能源，作为价格低廉、来源充足的原料，被广泛用于单细胞蛋白生产。筛选细胞中蛋白含量高的菌株是将甲醇转化为SCP的重要方式。嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilum)的细胞成分分析显示其粗蛋白含量很高，并且具有所有必需氨基酸，因此，这种微生物被认为是生产单细胞蛋白质的候选菌株。以嗜有机甲基杆菌为底盘细胞，当初始甲醇浓度为12.0 g/L时，可达到最高的细胞干重(约5.0 g/L)，甲醇转化率为0.42 g DCW/g[54]。以产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)为研究对象，当发酵原料是0.5%甲醇时，产生1.2 g的SCP (31%的转化率)，其中粗蛋白含量为71.6%，纯蛋白含量为58.0%。此外，将尿素作为氮源添加能促进产气肠杆菌的生长[55]。
随着遗传操作技术的日益成熟，研究人员可以通过代谢工程的策略提高单细胞蛋白的生产。甲基营养酵母毕赤酵母因其天然的甲醇同化能力而成为以甲醇为原料合成SCP的理想宿主，与大豆、鱼、肉、全脂牛奶等传统食品相比，从毕赤酵母中获得的SCP含有更高比例的蛋白质。Meng等[56]首先通过适应性实验室进化(adaptive laboratory evolution, ALE)提高了毕赤酵母对甲醇的利用效率及对33 ℃高温的耐受性，同时毕赤酵母的蛋白含量提高了10%；进而通过加强氮代谢(过表达谷氨酰胺合成基因GLN1)和损害细胞壁合成(敲除PAS_0305，一种与甲醇胁迫下细胞壁厚度直接相关的基因)，进一步增加了细胞的蛋白质含量；最后，该工程菌株实现了在中试规模33 ℃补料分批培养中以甲醇为原料生产高水平的SCP，生物量为63.37 g DCW/L，甲醇转化率为0.43 g DCW/g，蛋白质含量为0.506 g/g DCW。紧接着，该研究团队发现敲除PAS_0305导致了细胞内海藻糖的积累，细胞壁传感器被激活，导致细胞壁通透性的增加，进而激活高渗透压甘油(high-osmolarity glycerol, HOG)途径和细胞壁完整性(cell wall integrity, CWI)途径的信号转导。由于CWI途径的激活，敲除PAS_0305的菌株通过增加β-1, 3-葡聚糖含量和降低几丁质/甘露糖含量实现细胞壁重构，增强了其环境耐受性。此外，PAS_0305的缺失可以减少向异化途径的碳流向，从而减少的碳损失，实现甲醇利用效率的提高[57]。因此，PAS_0305敲除菌株具有较高粗蛋白产量和甲醇转化率的优异表型，粗蛋白产量和甲醇转化率分别为67.2%和0.46 g DCW/g[57]。
3.2 CO2为原料生产单细胞蛋白自养细菌的CO2固定能力使其成为最适合以CO2为原料生产SCP的底盘细胞。其中，微藻一直被认为是弥补“蛋白质缺口”最有效的SCP，是微生物蛋白的一种重要来源[58]。微藻生长迅速，作为替代蛋白原料，具有较高的应用潜力。微藻利用二氧化碳作为碳源，进行含氧光合作用，从阳光或人工光中获取能量。人们对微藻作为食物的兴趣是由于它们的高营养价值，蓝藻细菌，特别是节螺旋菌和念珠菌，几个世纪前便已经在非洲和亚洲作为食物食用[59]。它们具有较高的蛋白质含量(30.0%–80.0%)，氨基酸组成平衡，维生素、矿物质、类胡萝卜素和多不饱和脂肪酸含量良好[51]。莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是我国国家卫生健康委员会近期批准的36种新食品原料之一[60]。产品经藻种培养、发酵罐异养扩大培养、干燥等工艺制成，其主要营养成分蛋白质含量高于30.0%、粗多糖高于10.0%。此外，微藻还具有抗炎、抗菌、抗氧化、降血脂、抗癌等多种生物活性，在营养和制药领域具有吸引力[61]。光合细菌的培养受到光照需求的限制，尽管自然光作为免费能源具有优势，但其捕获需要细胞大面积去接触。使用人造光虽然是一种可行方案，但会显著增加成本。
氢氧化菌(hydrogen oxidizing bacteria, HOB) 主要是化学自养生物，使用无机电子(H2)和碳源(CO2)来生长并生产生物质，为大型CO2排放工业提供了一个回收工具，以减少其碳足迹。将HOB用于生产饲料、食品或绿色化学物质是未来生物经济中最具挑战性、但也最有前途的技术之一。在高密度反应器中，HOB能够实现每kgH2转化2.4 kg干生物质，HOB每年可以产生数百吨生物质。2017年成立的芬兰初创公司Solar Foods利用HOB生产Solein的单细胞蛋白，目前正在市场推广阶段；通过消耗H2、O2和CO2等原料，生产粗蛋白含量为65.0%–75.0%的SCP，并且CO2的转化率为0.40 g DCW/g[62]。
乙醇梭菌是一种厌氧的化能自养菌，它利用CO或CO2作为碳源，通过Wood-Ljungdahl途径，以H2作为还原剂，生产燃料乙醇、微生物蛋白等高附加值化学品。乙醇梭菌的蛋白含量高、氨基酸种类齐全、平衡性较好，无明确抗营养因子存在，是构建一碳气体生物转化细胞工厂的理想微生物之一。北京首钢股份有限公司和中国农业科学院饲料研究所利用乙醇梭菌蛋白工艺，以乙醇梭菌为发酵菌种，以钢铁工业煤气(转炉煤气、高炉煤气)中的CO为主要原料，以氨水为氮源，并与其他微量元素一起组成培养基，生产乙醇等清洁能源及菌体蛋白(粗蛋白含量超过80.0%)，该成果已实现工业化，工业生产能力达到了生物合成乙醇梭菌蛋白年产万吨级[63] (表 3)。
| Strain | Carbon source | Strategy | Conversion rate (g/g) | Protein content (%) | References |
| Methylobacterium organophilum | Methanol | Optimize C: N ratio | 0.42 | / | [54] |
| Enterobacter aerogenes | Methanol | Carbon source optimization, increasing temperature | 0.31 | 71.6% | [55] |
| P. pastoris | Methanol | ALE, enhance nitrogen metabolism and damage cell wall synthesis | 0.43 0.46 |
50.6% 67.2% |
[56] [57] |
| Methylobacterium extorquens ATCC 55366 | Methanol | Express heterologous proteins | 0.30 | / | [64] |
| Methylococcus capsulatus | Methane | Continuous fermentation, optimized conditions | 0.70 | 58.8% | [65] |
| Methylomonas and Methylophilus spp. | Biogas | Mixed bacteria fermentation | 0.66 0.87 |
41.0% / |
[66] [67] |
| Microalgae | CO2 | Light | / | 30.0%–80.0% | [51] |
| H2-oxidizing bacteria |
CO2, H2 | / | 0.40 | 65.0%–75.0% | [62] |
| Clostridium autoethanogenu | CO, H2 | / | / | 80.0% | [63] |
CO2人工生物转化方式可分为两种：直接CO2利用和间接CO2利用(图 1)。直接CO2利用主要是利用羧基酶将CO2转化为羧基，之后通过固碳循环转化为目标产物。直接CO2利用的关键是羧基酶，已发现的羧基酶有7种，包括二价金属依赖性羧化酶、ATP依赖性羧化酶、氧化还原依赖性羧化酶、底物活化羧化酶、硫胺素二磷酸(thiamine diphosphate, ThDP)依赖性羧化酶、多酶复合构建的羧化酶和异戊二烯化黄素单核苷酸(prenylation flavin mononucleotide, prFMN)依赖性羧化酶[68]。目前，天然固碳途径是地球生物固碳的最主要方式，但因其代谢途径长而复杂且存在厌氧的途径酶，导致CO2转化效率低，从而未被大规模开发应用[14, 69-70]。因此，构建新的人工碳固定途径受到了广大学者们的关注并成为研究热点。
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| 图 1 直接CO2利用和间接CO2利用方式 Fig. 1 Schematic diagram of direct CO2 utilization and indirect CO2 utilization. |
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基于羧基酶，人工固碳途径的设计重构取得重要进展。2016年，Erb实验室通过改造巴豆酰辅酶A成功设计构建了CETC (crotonyl-coenzyme A (CoA)/ethylmalonyl-CoA/hydroxybutyryl-CoA)循环，实现了CO2高效转化为乙醛酸，其碳转化效率是天然固碳途径的5倍[71]。2022年，李寅实验室以酰基辅酶A羧化酶为基础，构建了目前最短的固碳循环POAP (pyruvate carboxylase/ oxaloacetate acetylhydrolase/acetate-CoA ligase/ pyruvate synthase)循环，仅需4步便将CO2转化为草酸[72]。2018年，Liao实验室利用磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶构建了MCG (malyl-CoA-glycerate)途径，在体内外均证实了途径的可行性，同时证实了MCG途径的碳同化效率是目前天然途径的2倍[73]。在此基础上，该实验室将rGS (reductive glyoxylate synthesis)途径、rPS (reductive pyruvate synthesis)途径和MCG途径进行了整合，构建了rGPS (reductive glyoxylate and pyruvate synthesis)固碳循环，该循环可以固定CO2产生多种代谢中间物，包括乙酰辅酶A、苹果酸和丙酮酸等[74]。
CO2固定途径需要消耗大量能量，主要包括ATP和NADH。自然界中固定CO2所需的能量大多通过光合作用获得，将光能转化为所需的ATP和NADH。然而，目前的人工固碳途径无法直接利用叶绿体等能量转换器实现能量转化，ATP和NADH供给主要以直接添加化合物的方式实现。例如，添加的甲酸可以通过甲酸脱氢酶转化为CO2，同时将NAD+转化为NADH；添加的多聚磷酸能被多聚磷酸激酶将高能磷酸键转移至ADP，产生ATP。为了开发更加可持续的能量供给方式，Erb实验室通过提取植物的叶绿体膜，在光照条件下实现将ADP和NAD+转化为ATP和NADH，他们将此应用于CETC固碳循环，实现了CO2转化为目标化合物，但速率极低[75]。
5 结语与展望随着“第三代生物炼制”新概念的提出，以CO2为原料进行生物合成不仅能够解决原材料的成本问题，还能够有效地缓解温室效应。利用二氧化碳等低碳原料制造粮食的主要策略包括体外生物转化和微生物发酵，其研究思路可参考张以恒教授提出的“大道至简，从上而下，以道御术”[9]。体外生物转化的特点是化繁为简，实现在体外直接将底物转化为目标产品，具有生产速率和底物转化率优势。体外生物转化的核心是多酶分子机器的构造，通过对酶的定向进化，增加其稳定性、活性以及底物特异性，从而降低酶制剂使用成本、增加底物转化率、强化产品生产速率，使其在新质生物制造平台的开发中具有重要的竞争优势。针对体外生物转化的设计模式及应用场景，张以恒教授在一篇综述中已经进行了详细的介绍[76]。微生物发酵法利用微生物作为多酶反应系统，能够在实现微生物生长的同时合成目标产品。尽管获得一个工业化菌株(达到合适的产量、得率、生产速率)需要经过数年的优化，但它的特点在于合成产品的多样性相较于体外生物转化更为丰富，微生物底盘可以快速切换目标产品。此外，微生物发酵无需酶制剂的纯化及辅因子的添加，并且还可以利用复杂原料，例如工业废料[77]、食物残渣[78]等，从而可以降低成本。本综述重点围绕微生物利用低碳原料合成粮食类产品的进展进行总结。
当前，通过工程化改造提高自养微生物CO2的固碳能力，或者打造全新高效的固碳途径，都可以提高CO2作为底物的可行性。近些年，基于热、电化学等方法将CO2转化为简单低碳化合物取得了巨大进展。利用低碳化合物为发酵原料，偶联微生物细胞工厂技术，将CO2转化为高碳化合物，已经成为广受关注的研究方向。目前，以低碳分子为发酵原料，通过微生物细胞工厂已经实现了一系列粮食类化合物的生产，包括五碳糖木糖，六碳糖葡萄糖、肌醇、氨基葡萄糖，二糖蔗糖，多糖淀粉以及不同类型的SCP。然而，这些产物生物合成的研究还处于初级阶段，其产量距离工业化应用还存在一定差距。一方面原因是较低的底物利用效率。目前，尽管低碳分子例如甲醇、甲酸、乙醇、乙酸等的生物转化已被广泛研究，但其转化效率仍然低于糖类底物；而乙二醇、异丙醇、丙酸等的相关研究则非常有限。另一方面，产物合成途径与底盘细胞之间的适配性较差也是一个重要原因，例如异源酶表达活性差、内源竞争途径的干扰、目标产物的分泌等问题。因此针对微生物对CO2等低碳原料制备粮食类产物的研究，未来需要利用合成生物学手段提高低碳原料的利用效率和产物的合成效率，以进一步增加粮食类化合物的产量。
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