摘要:甜菜碱是一类广泛存在于生物体内的渗透保护剂。高等植物中，甜菜碱的生物合成经由胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱两步反应完成，其中第一步反应，也是甜菜碱生物合成的限速反应，由胆碱单氧化物酶(CMO)催化。本研究以耐盐植物山菠菜(Atriplex hortensis)为材料构建了盐胁迫下的cDNA文库，用菠菜CMO cDNA为探针从中筛选获得一个长1.77kb的cDNA克隆，测序结果表明该克隆包含一个完整的开放读码框，编码一个由438个氨基酸构成的多肽，与菠菜和甜菜CMO的氨基酸序列同源性分别为81%和72%。同菠菜和甜菜中的CMO序列相比，山菠菜CMO基因(AhCMO)也具有保守的RieskeType［2Fe2S］簇结合区和保守的多铁原子核结合域。对盐处理条件下山菠菜CMO基因转录水平的研究表明CMO基因在盐胁迫情况下表达量增加约3倍。将CMO与35S启动子连接后转化烟草(Nictiana tabacumvar.Xanthi)，获得了具有一定耐盐性状的转基因植株，在1.2%NaCl的盐浓度下生长良好。

摘要:在对凝乳酶原二硫键Cys206\|Cys210进行定位突变过程中发现，在相应的模板序列中有自身形成自由能为-16.1kcal/mol的茎环结构倾向，妨碍与引物结合，从而难以合成突变的DNA，采用快退火可解决此矛盾。5个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达，除C206A外，约占细胞总蛋白的50%左右。突变体的复性结果表明，Cys206\|Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的，但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响，在5个突变体中，C206A/C210A的复性率分别为C206S/C210S\,C210A\,C210S的4.5倍、20倍和30倍，而C206A完全不能复性。C206A/C210A与C206S/C210S的远紫外CD光谱与野生型基本相同，其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变，而荧光强度有显著增加。由于上述3个蛋白具有相同比活，说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象，而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。

摘要:通过PCR的方法从Bacillus subtilis基因组中克隆了中性植酸酶基因nphy,DNA全序列分析表明其结构基因全长1152个核苷酸(编码383个氨基酸)，5′端有一编码26个氨基酸的信号肽序列。去除信号肽编码序列的nphy克隆到大肠杆菌IPTG诱导表达载体pTYB40上，在大肠杆菌中得到了高效表达，表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的40%以上，表达产物具有生物学活性，证实了克隆到的中性植酸酶的编码基因有正常的生物学功能。

摘要:猪卵透明带(Zona pellucida,ZP)由生物化学和免疫学性质截然不同的三种糖蛋白(pZP1、pZP3α和pZP3β)组成。由于抗pZP3β抗体能在体外与人ZP发生交叉反应，因此pZP3β一直被认为是研制抗受精避孕疫苗的潜在抗原之一。为了能在原核系统中获得无卵巢因子污染的pZP3β蛋白，本文采用PCR方法删除了原cDNA中编码5′和3′端信号肽和跨膜区的DNA顺序。扩增的pZP3β基因核心片段(pZP3β″)经DNA测序验证后，通过引入其两端的EcoRI和SalI酶切位点被定向插入pBV221质粒P_RP_L启动子下游的多克隆区。SDS-PAGE分析表明：工程菌在热诱导后能特异地表达pZP3β蛋白，并能在蛋白印迹实验中被兔抗pZP IgGs识别。

摘要:利用乳链菌肽(nisin)诱导表达系统，以泛素(ubiquitin)融合蛋白的形式在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中表达了多肽抗生素apidaecin。利用TricineSDSPAGE和Western blotting均可在诱导后的宿主菌中检测到特异蛋白带。表达产物的最高产量可达宿主菌可溶性蛋白的7.2%左右。在体外用泛素特异性蛋白酶UBPI从融合蛋白中切除泛素后，产物具有明显的抗菌活性。

摘要:肉桂地链霉菌(S.cinnamonensis)是莫能菌素(Monensin)的产生菌。大肠杆菌链霉菌穿梭表达载体pHZ1252中的透明颤菌血红蛋白基因(vhb)位于硫链丝菌素诱导启动子P_tipA之下，它在肉桂地链霉菌中的结构不稳定，发生了重组缺失，缺失的片段包括大肠杆菌质粒部分和vhb基因。但来自阿维链霉菌(S.avermitilis)中缺失了大肠杆菌质粒部分却保留了完整的vhb基因及tipA启动子的pHZ1252，可在肉桂地链霉菌中稳定复制，不再发生缺失，经硫链丝菌素诱导表达出了有生物活性的VHb蛋白。摇瓶发酵实验证明，VHb蛋白在氧限条件下可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成。

摘要:构建了携带asd、霍乱毒素B亚基(CTB)基因的表达质粒pYX201，与福氏2a痢疾菌T32的△asd突变株FaD构成宿主质粒平衡致死系统，用于在没有抗生素选择压力的情况下，稳定表达CTB抗原基因。以此为基础，构建了单独表达肠毒素性大肠杆菌CS26菌毛抗原基因的重组质粒pYX202，以及同时表达CS6和CTB的共表达质粒pYX203。Western blotting和ELISA检测结果证实CS6及CTB在痢疾菌FaD中可以有效表达。重组菌免疫家兔后可诱生相应的血清抗体，特别是CTB的抗体效价较高，并持续较长时间。本研究为细菌性腹泻疫苗的研究提供了候选株。

摘要:通过PCR从苋属植物千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)的总DNA中扩增出苋菜凝集素(AHA)的核基因片段。序列分析结果表明该基因为2453bp，含有一1538bp的内含子和两个分别为212bp和703bp的外显子。采取反向PCR的方法获得仅含该基因的编码区克隆。以此为基础与二元表达载体pBin438构建含内含子与不含内含子AHA基因的植物表达载体pBAHAg和pBAHAc并通过土壤农杆菌介导转化了烟草。转化再生植株的PCR和Southern blot分析表明，AHA基因已整合到烟草的染色体中，有单拷贝和多拷贝的整合。用与AHA蛋白高度同源的ACA蛋白的抗血清进行了免疫斑点(Immunodot blot)检测，结果初步表明转基因烟草有AHA蛋白的表达。虫试结果表明转pBAHAg和pBAHAc烟草对蚜虫的平均抑制率分别达57.2%和48.8%，有的高达90%以上。含内含子和不含内含子的AHA基因在转基因植株中的抗蚜性不同。

摘要:为了探讨利用黄瓜花叶病毒(CMV)构建表达载体的可行性，分离了山东株(SD) CMV RNA 3的全长cDNA。测定其全序列后，采用定点突变的方法在衣壳蛋白(CP)基因起始密码子处改造出一个NsiⅠ位点，可将外源基因引入NsiⅠ位点和CP基因终止密码子上游附近的XhoⅠ或SalⅠ位点而置换掉CP基因。分别用绿色荧光蛋白(GFP)基因、β-葡糖醛酸酶(GUS)基因以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因3种报告基因置换CP基因。将Fny株CMV RNA 1、RNA 2和SDCMV嵌合RNA 3的cDNA分别插入pCass载体的35S启动子和终止子之间，将构建的置换型载体直接以质粒的方式转染烟草原生质体，表达了3种报告基因。

摘要:通过PCR技术从HCV全长基因组中扩增并克隆到Core区、NS4区的部分优势表面抗原肽的基因和C33a基因。再将它们以Core\,CC3c\,NS4的顺序和C33c、NS4的顺序分别拼接融合成融合抗原CCN、CN。片段之间以Gly-Gly-Gly-Gly柔性连接肽连接。经核苷酸序列分析表明，拼接点序列正确。将融合抗原CN、CCN基因分别克隆至T7启动子控制下的表达质粒PET24(a)+,PET22(b)+中，转化至大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导可高表达分子量约为43kD、58kD的融合抗原，表达产物以包涵体形式存在。表达产物经Ni²⁺IDA亲和柱纯化后，并对融合抗原CN、CCN的抗原性做了初步的鉴定。

摘要:以本室研制的一株抗肿瘤血管单克隆抗体AA98为基础，采用PCR扩增抗体AA98基因的重链可变区(V_H)和轻链(L)，以重链恒定区1(C_H1)5′端12个氨基酸的序列作为连接肽，并将连接肽中的Lys突变为Ser，构建VH连接肽-L三结构域单链抗体。重组VH/L单链抗体在大肠杆菌中得到了高效表达，其表达量占菌体总蛋白质的20%。表达的蛋白质在菌内形成包含体，经凝胶过滤法复性，获得了有抗原结合活性的V_H/L。该三结构域单链抗体的成功构建和复性，为重组抗体片段的研制提供了借鉴。

摘要:RT-PCR获取的血管形成素Angiogenin cDNA片段，克隆入融合表达载体pRSETB中，表达产物为N端融合了His6的融合蛋白，以包涵体形式存在，占菌体总蛋白的10%。用8mol/L脲溶解包涵体，利用His6与过渡态金属离子Ni⁺²高亲合力结合的性质，经Ni+2NTA亲和树脂一步法纯化，获得纯度达98%以上His6-ANG融合蛋白，Western-blot结果表明在相应分子量处有一条特异性条带。重组蛋白复性后活性测定表明，在体外可促进鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管形成，并可降解tRNA。

摘要:研究了E.coliBL21(DE3)及其磷酸转乙酰基酶(PTA)缺陷变株FR55发酵过程中菌体生长和有机酸产生情况，并以肿瘤坏死因子(TNF)为外源蛋白表达的模型考察了pta基因缺陷对外源蛋白表达的影响。在摇瓶培养条件下，pta变株TNF的表达水平比亲株提高了23%。在5L发酵罐中进行了补料分批培养试验，在不限制比生长速率的条件下pta变株能够以较长时间和较高比生长速率保持对数生长，最终达到32.5g(DCW)/L的菌密度，TNF的总表达量达2.8g/L；而在相同条件下，以BL21(DE3)为受体菌的对照组最高菌密度为19.5g(DCW)/L,TNF总表达量只有0.84g/L。表明pta变株对于提高工程菌外源蛋白的表达和实现高密度培养具有一定应用价值。分析了补料分批培养过程中发酵液有机酸组成和含量的动态变化情况，发现pta变株乙酸累积水平明显降低(为亲株乙酸累积水平的42%)的同时，其他几种有机酸(丙酮酸、乳酸、琥珀酸)的累积有显著增加的趋势，使发酵液中总有机酸浓度增加了123%，其中乳酸的累积是影响菌体进一步生长的主要因素。

摘要:为了提高长效组织纤溶酶原激活剂（ＬＡｔＰA）在转基因小鼠乳腺中的表达水平，将受控于羊β乳球蛋白（ＢＬＧ）的ＬＡｔＰＡ表达载体ＢＬＧＬＡｔＰＡ与小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因片段进行共注射，采用此方法建立的转基因小鼠，经ＰＣＲ筛选和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹鉴定，获得３只ＬＡｔＰＡ和ＷＡＰ共整合阳性鼠，并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的ＬＡｔＰＡ表达，表达水平达到１０μｇ／ｍL。

摘要:克隆了产朊假丝酵母(Candida utilis)AS2-117尿酸氧化酶(Urate Oxidase,Uricase,EC1.7.3.3)的基因。将此基因插入原核表达质粒pET21a后转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得高表达的重组转化子菌株。经IPTG诱导，重组尿酸酶基因表达量可达菌体可溶性蛋白的40%。重组尿酸氧化酶为有酶活性的可溶蛋白。Western印迹分析证实表达产物有免疫学活性。经DEAE DE52纤维素离子交换柱层析纯化，目的蛋白纯度可达95%。重组蛋白和天然蛋白的理化特征比较证明重组蛋白的热稳定性有较大提高。酶盒配制和临床应用实验表明重组蛋白可代替天然蛋白进行临床血清尿酸的分析。

摘要:三角酵母(Trigonopsis variabilis)的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAO,EC1.4.3.3)是一种胞内酶，完整细胞并不呈现酶促活性。为了获得三角酵母细胞的较高表观活力，需对细胞进行处理以改变壁和膜对反应底物和产物的通透性。研究中比较了冻融、丙酮、丁醇和十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)等理化因子的透性化效率，并对丙酮的透性化条件进行了优化。证明丙酮的透性化作用与溶剂浓度、保温时间和温度有关。30%～35%丙酮浓度，4～28℃保温，可得到最大酶活力。透性化所需时间极短，在5min内即可完成。同时，透性化细胞中的DAO比无细胞抽提液中的酶对热更为稳定。用丙酮透性化细胞作为生物催化剂可有效地转化头孢菌素C(Cephalosporin C, CPC)为戊二酰-7ACA(Glutaryl-7-ACA,GL-7ACA)。

摘要:木薯α-羟腈酶是一种催化羟腈化合物分解和合成的裂解酶，它在不对称合成手性羟腈化合物和手性药物等方面具有广泛的应用前景。通过RT-PCR从木薯叶组织总RNA中扩增出α-羟腈酶基因的cDNA序列，并将其克隆于质粒pPIC9K。序列分析表明，克隆的基因和文献报道的3个木薯羟腈酶的cDNA序列不完全一致，可能是木薯羟腈酶基因家族的新成员。通过一系列步骤，将获得的α-羟腈酶基因cDNA序列插入表达载体pET30a，在大肠杆菌获得高效表达。每升发酵液获得2100单位的羟腈酶，粗酶液的比活为8.5u/mg蛋白质，并首次利用热变性法纯化重组羟腈酶。重组羟腈酶催化合成的(S)扁桃腈的ee值达95.2%，转化率为98.2%。

摘要:采用三因素多项式回归311-A最优设计方法对影响落叶松体细胞胚发生数量的ABA、PEG4000和AgNO₃的用量进行了研究，建立了华北落叶松正常体细胞胚发生数量与ABA、PEG4000和AgNO₃的数学模型，分析了落叶松体细胞胚发生数量试验因子的主效应和互作效应，优选了落叶松体细胞胚发生数量最佳结果的最佳技术组合方案为ABA18.9138mg/L,PEG4000.888007g/L与AgNO310.7513 mg/L时，最佳体细胞胚数量应为107.5278个子叶胚/g.callus。实验结果表明：该方法是针叶树体细胞胚胎发生过程中，主要激素种类与浓度配比、处理组合，科学、合理的培养基优化途径。

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