摘要:人胚胎干细胞系的建立，对人类胚胎发生和人类发育生物学研究、人类新基因的发现和功能研究以及基因治疗、细胞和组织的移植治疗等领域的突破性进展具有重大意义；回顾了人胚胎干细胞建系研究的历程，就建系的几种方案、路线、意义和可行性进行了探讨；详细系统地说明了迄今为止建立人胚胎干细胞系所需要的饲养层类型、培养基组成、添加细胞因子种类及其作用；分析了建立和维持人胚胎干细胞系所需消化酶的种类及其作用以及目前常用的几种传代方法；从若干方面总结了人胚胎干细胞系的鉴定方法，并对建立和维持人胚胎干细胞系中存在的若干问题进行了剖析，提出了目前急待解决的问题。

摘要:腺生物反应器拥有巨大的开发价值，但开发成功的例子却寥寥可数，主要的原因是外源基因的表达量较低，达不到开发生产的要求。提高外源基因表达量的关键在于乳腺生物反应器表达载体的构建。近年来，这方面的新思路、新方法不断出现，本文对此进行了综述。

摘要:确定导致转录后基因沉默的原因，探索在转基因植物研究中避免基因沉默的对策。方法是将转基因沉默分为转录水平的沉默和转录后水平的沉默，分别对RNA阈值模型、异位配对和异常RNA模型、双连RNA模型等几种导致转录后基因沉默模型的分析。结果确定了转基因沉默抑制现象和转录后基因沉默的形成机制，以及转录后基因沉默理论和实践意义。提出了利用RNAi等技术进行基因功能鉴定和利用基因沉默进行病毒防治的策略。

摘要:利用转基因家畜的乳腺生产人类重组蛋白，可以高效获得安全、足量的药用蛋白。本文针对乳腺生物反应器的成功研制，从目的基因的选择、载体构建、转基因技术等方面探讨了动物乳腺生物反应器的研究现状。分析了提高转基因效率和外源蛋白表达水平的技术途径，提出了降低总体成本的战略措施。特别探讨了利用Cre-loxP系统发展“体细胞打靶体细胞核移植技术体系”，高效生产乳腺生物反应器动物的可能性。

摘要:对一株能转化D，L-对羟基苯乙内酰脲为D-对羟基苯甘氨酸的菌株MMR003进行了细菌分类学鉴定，该菌为皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)。实验通过Southern杂交，部分文库构建和筛选，并经一系列亚克隆测序分析，获得一长度为1374bp的完整开放阅读框，编码458个氨基酸的D-乙内酰脲酶基因。用该基因序列构建的高表达质粒pXZPH2转化E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导后，检测到D-乙内酰脲酶活性。该基因编码的氨基酸序列经Blast同源比较分析与放射形土壤杆菌NRRL B11291所产相应酶有85%的同源性。以D，L-对羟基苯乙内酰脲为底物测得的表达酶的活力为0.66u/mL，比相同条件下所测出发菌株MMR003的酶活提高了2倍。

摘要:

摘要:用我国的高产栽培品种泗棉3号和美国栽培品种TM-1为材料，构建F₂和F_2∶3作图群体，应用301对SSR引物和1040个RAPD引物，对产量性状QTLs进行了分子标记筛选，结果共筛选出了37对SSR多态性引物和10个RAPD多态性引物的49个位点，鉴定出了控制产量性状变异的主效QTLs。定位于第9染色体的连锁群，分别具有控制铃重、衣分和籽指的主效QTLs，铃重的2个QTLs分别解释F_2∶3群体表型变异的18.2%和21.0%；在F₂群体检测到的1个衣分QTL解释表型变异的25%，另一个衣分QTL在F₂群体和F_2∶3群体都检测到，解释F₂群体衣分的24.9%的表型变异，解释F_2∶3群体衣分的5.9%的表型变异；在F_2∶3群体铃重的一个QTL的同一位置同时检测到一个籽指QTL，它解释15.6%的表型变异，是一因多效或是紧密连锁的两个QTLs，有待进一步研究。本研究标记的产量性状主效QTLs可用于棉花产量性状的标记辅助选择。

摘要:对水稻非特异性脂质转移蛋白(Nospecific lipid transfer protein,nsLTP) LTP110中结构重要的5个氨基酸位点进行了定点突变，测序结果证实了突变体构建成功。在尝试了多种大肠杆菌表达系统进行表达之后，发现硫氧还蛋白融合表达载体适合于LTP110野生型及突变体的表达。将编码野生型LTP110及突变体Y17A，P72L，R46A，D45A，C50A蛋白的cDNA顺序克隆进两种硫氧还蛋白表达载体并对其表达情况进行了比较：pTrxFus载体可以在宿主菌GI724中以较低水平表达野生型LTP110及突变体Y17A，P72L，R46A融合蛋白，但不能表达D45A和C50A融合蛋白；pET32a(+)载体可以在宿主菌BL21 (DE3) trxB-中以可溶蛋白的形式表达野生型及所有突变型融合蛋白，且表达量比在pTrxFus载体/GI724突主菌中表达量高。对pET32a(+)载体中表达的LTP110融合蛋白进行了纯化，并利用带有荧光标记的脂肪酸分子对其测活，结果表明表达的野生型LTP110分子具有结合脂质的活性。

摘要:纹捕鸟蛛毒素Ⅰ是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化，具有镇痛活性的肽类神经毒素。对巴氏毕赤酵母生产的重组HWTX-Ⅰ进行多步纯化，首先将分泌到培养上清的rHWTX-Ⅰ进行90％饱和度的（NH₄）₂SO₄沉淀，再用截留分子量3kD的滤膜脱盐，再用CM阳离子交换层析分离，最后用C₁₈反相层析脱盐纯化，真空干燥后得到的rHWTX-Ⅰ经Tricine SDS-PAGE,质谱鉴定,氨基酸组成分析，N-端序列测定及活性鉴定,证明已获得高纯度的重组HWTX-Ⅰ，摇瓶表达量约为80mg/L，约占总分泌量的23.6%，并对摇瓶发酵条件进行了优化，为利用基因工程方法生产HWTX－I的规模化生产及临床应用提供了证据。

摘要:肿瘤坏死因子是一种重要的炎性细胞因子，目前已知许多免疫疾病与之相关，为了抑制TNF的生物学活性，将可溶性TNFR II（sTNFR II）和人IgG Fc分子通过柔性短肽相连，构建成一个嵌合蛋白，在大肠杆菌中进行表达，并获得了纯化蛋白。实验证明该嵌合蛋白能够自发形成聚合体，识别并结合TNF蛋白，同单体sTNFR II相比，对TNF的中和活性得到了较大的提高。

摘要:以miniTn5gfp-km转座子中nptII片段作为探针，对已获得的五株野油菜黄单胞菌野油菜黑腐病致病型（Xcc）非致病突变体进行了Southern blot分析，结果表明，这五株突变体确由mini-Tn5gfp-km转座子插入致病相关基因所致，且为单拷贝不同位点的插入。提取这五株突变体总DNA作为模板，采用改进的热不对称交错PCR （TAIL-PCR）方法从其中克隆到了各自转座子插入区侧翼序列，对这些侧翼序列进行了序列测定并将分析结果与GenBank database及Xcc全基因组序列做了比较，结果表明，五个侧翼序列所在的基因确与Xcc致病性有关。这种改进后的TAIL-PCR方法为突变体特别是转座子插入突变体中目的基因的克隆提供了一种简便高效的新方法。

摘要:从含有庚型肝炎病毒(GBVC/HGV)包膜蛋白E2 cDNA(559bp)的质粒pGEX\|E2中，扩增得到能够编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶(GST)和GBVC/HGV包膜蛋白E2的融合基因片段。将此长度为1324bp的DNA片段插入到酵母表达载体pPIC9K中，使之位于α因子信号肽下游，且与之同框。通过电激转化将构建的重组表达质粒pPIC9K\|GST\|E2插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中。筛选His\++Mut\+s表型的转化子，震荡培养，用05%甲醇诱导表达5d后，在培养液中得到表达的GSTE2融合蛋白。经过表达条件的优化，GSTE2蛋白可占培养液中总蛋白的50%。通过谷胱甘肽亲和层析柱纯化，GSTE2融合蛋白的纯度可达95%左右。以庚型肝炎病人血清为探针，进行免疫印迹及ELISA实验，结果表明该融合蛋白具有能被庚型肝炎病人血清特异性识别的抗原性。

摘要:通过同源重组的方法分别构建了在CMV启动子控制下的带有第一内含子和不带内含子的pGH cDNA基因的重组腺病毒。通过感染CHO细胞表明，构建的重组腺病毒能够介导pGH基因在CHO细胞中表达，加入第一内含子的pGH cDNA基因的表达效率比不加内含子的提高了117%，这说明pGH基因的第一内含子有促进该基因在真核细胞中表达的功能。

摘要:大环内酯类抗生素基因工程是近年来研究的一个新领域，迄今已合成了100多种新的聚酮类化合物。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板，用重叠PCR方法扩增出去除KR6酶域DNA的约32kb DNA片段，克隆于pWHM3载体，构建了同源重组质粒pWHM2201。PEG介导原生质体转化法将pWHM2201转入糖多孢红霉菌A226，并整合于染色体红霉素合成基因位点。整合体在R3M斜面上生长两代后，制备原生质体涂R3M平皿。利用PCR鉴定筛选出8株KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M(1-8)。ZabsPec Fab质谱鉴定，证实糖多孢红霉菌M1合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B，一种新的酮内酯类化合物。 〖HJ0

摘要:研究表明外加紫杉醇能够诱导悬浮培养的东北红豆杉(Taxus cuspidata)细胞总DNA发生梯带化降解。利用mRNA差异显示技术比较了紫杉醇诱导凋亡与不诱导凋亡的东北红豆杉细胞基因表达的差异，得到了8个特异表达的cDNA克隆，经Northern杂交证实其中3个在不发生凋亡的细胞中表达，5个在凋亡的细胞中表达。对这8个cDNA克隆单向序列测定后，与GenBank/EMBL/DDBJ中同源序列进行了比较，结果表明：1个cDNA片段与拟南芥中ABA应答蛋白基因的保守区有86%的同源性；2个cDNA片段与番茄内切壳聚糖酶前体基因的保守区有50%的同源性；其他5个cDNA片段无明显的同源基因，可能是新基因。

摘要:将猪瘟病毒的E2基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中，酶切线性化后电穿孔导入Pichia pastoris进行整合，经G418筛选得到高拷贝转化子，甲醇诱导表达。SDSPAGE和Western blot结果证实了酵母培养上清液中含有E2蛋白。免疫活性研究证明P. pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生抗猪瘟病毒的抗体。

摘要:采用RT-PCR技术从菠菜总RNA中分离扩增了乙醇酸氧化酶（GO）基因的cDNA序列，首先克隆到质粒pMD18T，进行了测序。然后将乙醇酸氧化酶的cDNA分别亚克隆至质粒pThioHisC、 pTIGTrx、pBV220和pET-2b(+)，分别转化大肠杆菌DH5α和BL21（DE3），并对重组乙醇酸氧化酶在大肠杆菌中的表达进行了研究。SDSPAGE和酶活分析表明，菠菜乙醇酸氧化酶在E.coli BL21 (DE3) （pTIGTrxGO）和E.coli BL21(DE3) （pET-22b(+)GO）里得到了高水平的表达，其中E.coli BL21(DE3) （pET-22b(+)GO）的乙醇酸氧化酶活性较高。

摘要:利用PCR技术，从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST₁突变基因和LT_B基因，通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了含K88ac-ST₁-LT_B融合基因表达载体的重组菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5）。经酶切鉴定和DNA序列分析证实，构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST₁-LT_B融合基因，且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测，重组菌株表达的K88ac-ST₁-LT_B融合蛋白能够被ST₁单抗、LTB和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实，表达的融合蛋白已丧失天然ST₁肠毒素的活性。免疫实验结果表明，K88ac-ST₁-LT_B融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ST₁肠毒素的毒性作用，表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄、白痢基因工程菌苗的候选菌株。

摘要:在液体培养基中，将米曲霉3042菌体培养成直径为1～2mm、菌壁上含较高氨基酰化酶浓度的菌丝球，以甲醛为交联剂，明胶为酶活性保护剂对米曲霉菌丝球进行固定化研究。在正交实验L₁₆(4⁵)的基础上，选用结构为410-15-1的BP(Back propagation)人工神经网络，对固定化工艺条件进行优化和预测，得到了优化的固定化条件。实验测定在此条件下制备的固定化米曲霉菌体比酶活为1500u，比酶活保留率达到83%，说明人工神经网络可以用于米曲霉菌体固定化工艺条件的优化。

摘要:以丙烯腈为原料，微生物转化生产丙烯酰胺的过程中，酶催化反应是过程的关键。为了了解酶催化的动力学，本研究以自由细胞的酶为催化剂，进行了腈水合酶的反应动力学和失活动力学的研究。首先研究了菌体浓度、温度、pH值、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度等对腈水合酶催化反应速度的影响。结果表明，在这些因素中，温度和丙烯酰胺浓度是最主要的影响因素。28℃时酶活为5659u/mL（菌液），在5℃时的反应速率仅为28℃时的11.72%,相应的表观酶活为663u/mL（菌液）。而在丙烯酰胺45%浓度条件下的酶活大约只有丙烯酰胺5%浓度下的酶活的1/2。经过对不同温度下的反应速度的研究，得到腈水合酶水合反应的活化能为65.57kJ·mol^-1。本文进一步研究了自由细胞状态下，菌体浓度、pH值、温度、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度对腈水合酶失活的影响，得到了失活动力学。结果表明，在这些因素中，对酶失活影响的最主要因素还是温度和丙烯酰胺浓度。尤其当丙烯酰胺浓度到达35%时，酶活下降得很快，在55 h后，酶活几乎为零。而在丙烯酰胺浓度为10%的情况下，55 h的酶活仍然还存在约50%。试验结果还表明，丙烯腈对酶的稳定性的影响很小。经过数据处理，得到的28℃的酶失活速率常数为5℃下的2177倍。经过对温度与失活速率常数的拟合，得到腈水合酶失活反应的活化能为9228kJ·mol-1。

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摘要:蛋白质微阵列是生物芯片的一种，其主要优势在于应用平面上的有序排列的许多管、腔(孔)或各自独立的点来进行样本检测，使大量样本的平行分析成为可能。应用此技术可同时分析诸多蛋白质的生物化学活性、蛋白质与蛋白质间、蛋白质与DNA间、蛋白质与RNA间，以及蛋白质与配体间的相互作用，从而在临床诊断、药物研究、环境监测、食品卫生等方面显示出其广阔的应用前景。

摘要:原位分子杂交技术应用于电镜水平，观察标记的特定DNA、mRNA和RHA在细胞和/或组织内的超微结构定位的方法，称为电镜原位分子杂交技术。本文综述了电镜原位分子杂交技术的建立及其分类，并详细介绍了非放射性电镜原位分子杂交技术的基本操作程序及注意事项，最后对电镜原位分子杂交技术的应用做了简要介绍。