摘要:植物III型聚酮合酶能催化生成一系列结构各异、具有不同生理活性、包含查耳酮合酶基本骨架的植物次生代谢产物, 这类次生代谢产物不仅使植物体本身的抗逆性提高, 并且对人类健康医疗有很好的应用前景。以下综述了近年来从植物中克隆、鉴定III型聚酮合酶的研究进展, 着重论述了其分子结构、催化反应的类型和机制、表达调控及其在转基因工程方面的研究和应用前景。这些研究将为有效地对其进行基因改造, 合成一些难以化学合成的新型天然化合物奠定基础, 并且为将来进一步开展III型聚酮合酶的转基因工程提供了参考。

摘要:重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus, rAAV)的诸多优点使其成为具有巨大潜力的人类基因治疗载体。人类基因治疗临床前和临床研究以及基因治疗产品的市场化要求rAAV载体生产的规模化。自1989年野生型的腺相关病毒序列被Samulski 报道以来, rAAV的生产工艺已经从传统的质粒共转染发展到应用包装细胞系和生产细胞系, 包装细胞也从“人体细胞” 衍化到 “昆虫细胞”。目前rAAV的生产规模和病毒载体质量都完全可以符合临床应用要求, 有效地促进rAAV在基因治疗临床上的广泛运用。以下将着重介绍rAAV规模化生物包装技术的发展趋势, 尤其各种规模化生产系统的要点。

摘要:为探讨口蹄疫病毒Lpro致MDBK细胞病变效应中的形态学变化, 本实验在成功构建可稳定表达口蹄疫病毒Lpro 目的基因的MDBK细胞系的基础上, 人工诱导Lpro表达后, 采用光学显微镜观察、Hoechst 33258染色、AO-EB染色、DNA Ladder等进行检测, 研究口蹄疫病毒Lpro致MDBK细胞的病变效应。结果显示, MDBK细胞系在诱导表达口蹄疫病毒Lpro 24 h后, 光学显微镜下细胞形态表现为细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围出现透明圈等现象; Hoechst 33258染色检测呈现典型的细胞核浓缩和梅花状核碎裂; 诱导表达Lpro 36 h后, AO-EB染色显示早期病变细胞核染亮绿色呈致密斑块或碎片状, 晚期病变细胞核染橘黄色呈致密斑块; DNA凝胶电泳显示可见的DNA Ladder“梯状”条带。证明口蹄疫病毒Lpro 在体外可诱导MDBK细胞发生凋亡。

摘要:本研究在完成Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)As01株全基因组测序的基础上, 采用融合PCR扩增得到含有15个C碱基的5￠端片段(约1800 bp), 并利用长片段PCR扩增得到基因组3￠端片段(约6700 bp)。再利用单一的酶切位点将2个片段克隆到pBluescript SK载体中, 从而获得携带As01株基因组全长cDNA的重组质粒pBSAs。将该质粒线性化后作为模板体外转录并转染BHK-21细胞, 可观察到典型的细胞病变。对收获的病毒采用RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察等检测及鉴定, 结果表明, 拯救出了具有感染性的Asia1型FMDV。拯救毒与亲本毒对乳鼠的致病力(LD50)差异不显著, 具有相似的生物学特征。该感染性克隆的构建, 为深入研究FMDV的致病机理及开发新型疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。

摘要:雌激素受体关联受体a(Estrogen-related receptor a, ERRa)是调控机体能量代谢的关键转录调控因子, 其在白色脂肪组织中的作用尚不清楚。本研究旨在通过touch down-PCR方法克隆猪ERRα基因的ORF序列; 通过Western blotting和细胞免疫荧光染色法分析其在猪各组织及成熟脂肪细胞中的表达模式; 利用ERRa特异性抑制剂XCT790处理原代培养的猪成熟脂肪细胞, 探讨其对成熟脂肪细胞甘油三酯聚集的影响。结果显示, 所克隆的猪ERRα基因ORF序列长1269 bp (GenBank Accession No. FJ446485, 尚未公布), 编码422个氨基酸, 其核苷酸和氨基酸序列与其他物种高度同源; ERRa蛋白高表达于猪白色脂肪组织(White adipose tissue, WAT)、肾脏以及心脏中, 在脾脏中表达量较低; 细胞免疫荧光化学染色显示, ERRα蛋白广泛分布于脂肪细胞的细胞核和胞浆中; XCT790在10 mmol/L浓度时显著抑制了ERRa蛋白的表达和成熟脂肪细胞中甘油三酯的聚集。本研究将为有效调控体脂沉积提供新的靶点和理论参考。

摘要:感染性分子克隆是研究病毒复制和致病机制的有力工具。本研究应用PCR诱变技术解决了外源片段易于自连的难题, 成功将2个PCV2 SD1株全基因组(DQ346683)头尾相接插入到真核生物表达载体pSK的多克隆位点中, 构建重组质粒pSK-2PCV2; 另外课题组成功构建含单个PCV2全基因组的pSK-PCV2和自身环化质粒ds-PCV2。将所得3种质粒分别转染无PCV污染的PK-15细胞系, 经10次连续传代后, 间接免疫荧光试验检测显示三者均在细胞核中聚集大量的病毒抗原; 经RT-PCR检测都有PCV2特异性基因转录; 透射电镜下可观察到直径约为17~20 nm的典型PCV2病毒粒子; 经测序鉴定所拯救出的病毒与亲本病毒核苷酸同源性为100%。拯救出的PCV2与亲本病毒具有相同的病毒学及分子生物学特性。本研究应用PCR诱变技术成功构建PCV2双拷贝感染性克隆, 并经体外拯救证实其具有感染性, 为进行PCV2分子特性及致病机理研究打下了基础。

摘要:断奶后多系统衰弱综合征(PMWS)是目前规模化猪场常见的传染病, 由PCV2感染引起。临床上PCV2与PRRSV混合感染较常见, 死亡率和发病率很高, 但目前尚无能有效预防该病的商品化疫苗。本研究利用基因克隆方法, 构建融合表达PCV2-Cap蛋白与PRRSV-GP5蛋白的重组腺病毒rAd-Cap-GP5, 经IPMA、IFA和Western blotting验证了Cap蛋白和GP5蛋白在该重组病毒中获得表达。将该重组腺病毒免疫小鼠测定其抗体、中和抗体, 结果显示小鼠免疫后出现两种病毒的抗体和中和抗体,诱导小鼠产生明显的体液免疫应答, 可以作为预防PCV2-PRRSV混合感染的基因工程疫苗候选毒株, 为PCV2和PRRSV二联重组亚单位疫苗的研究奠定了基础。

摘要:参照GenBank中长角血蜱致病性Okayama株卵泡抑素基因的核苷酸序列(GenBank Accession No. DQ248886)设计合成一对引物, 从本实验室保藏的单克隆洁净长角血蜱饥饿成蜱中快速提取总RNA, 通过RT-PCR扩增出814 bp的卵泡抑素基因, 序列比对结果显示:与长角血蜱致病性Okayama株的核苷酸序列及氨基酸序列一致性分别为97.8%和99%, 将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1中进行表达, GST融合重组蛋白预期分子量为57 kD。表达重组蛋白经MagneGSTTM蛋白纯化系统纯化后作为抗原分别与抗不同发育阶段长角血蜱(卵、幼蜱、若蜱、成蜱)多克隆抗体作为一抗进行免疫印迹, 结果表明: 与长角血蜱卵制备的多克隆抗体有很强的免疫反应, 而与其他发育阶段(幼蜱、若蜱、成蜱)饥饿长角血蜱制备的多克隆抗体反应性很弱。以上结果表明: 长角血蜱卵泡抑素蛋白在长角血蜱产卵及卵成熟发育时期的表达水平较其他发育阶段(幼蜱、若蜱、成蜱)的蛋白表达水平高。

摘要:为了深入研究单核增生性李氏杆菌(LM)致病机理, 从其基因组中克隆李氏杆菌溶血素基因hly, 并将其与原核表达载体连接在大肠杆菌BL21中表达携带His标签的李氏杆菌溶血素(LLO)融合蛋白, 经镍柱纯化得到重组LLO蛋白作为免疫原并免疫小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)进行融合, 经过3次亚克隆后获得3株稳定分泌针对LLO蛋白单抗的杂交瘤细胞株, 分别命名为Anti-LLO1、Anti-LLO2、Anti-LLO3; 经ELISA测定其细胞培养上清效价分别为1:3.6×104、1:6.4×104、1:1.6×104, 腹水效价分别为1:2×107、1:2×107、1:1×107; 亲和力解离常数(Kd)分别为6.18×10-11、7.50×10-11、6.27×10-11; 3株单抗的IgG亚类均为IgG1。经Western blotting鉴定证明, 该3株抗体均能特异地识别李氏杆菌LLO蛋白, 该单抗的制备为深入研究LM的致病机理奠定了基础。

摘要:通过分析流感数据库45个H7亚型禽流感病毒的HA序列, 在保守区内设计并合成引物, 建立了一步法RT-PCR检测方法, 扩增片段大小为501 bp。通过对H7亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液不同滴度检测, 证实病毒尿囊液最低检出量为105.5 EID50/mL; 阳性棉拭子最低检出量为103 EID50/mL。用该方法检测H1~H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原进行检测, 仅有H7亚型AIV有特异性目的条带, 与其他均无交叉反应。从脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品的病毒分离和RT-PCR方法比较, 表明在10-1的样品浓度下, 两者可以达到相同的检出量。表明该一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高和准确率高的特点。

摘要:本研究报道了猪尿酸氧化酶(Porcine urate oxidase, pUOX)的原核表达载体的构建、pUOX的蛋白表达条件的优化以及对pUOX经纯化后进行活性检测和酶学性质分析。利用RT-PCR从猪肝总RNA中克隆pUOX, 定向插入原核表达载体pET30a(+)中, 构建表达载体pET30a(+)/pUOX, 并转化到大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中。重组质粒pET30a(+)/pUOX经双酶切鉴定和序列分析, 证实已成功构建了重组表达载体。重组表达菌经IPTG诱导表达了约为 41 kD的蛋白, 与预期分子量一致, 并对pUOX蛋白表达条件进行了优化, 表达的蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞中,包涵体经过变性、复性后, 用Ni2+-NTA对复性蛋白进行亲和纯化, 并对纯化蛋白进行了活性检测和酶学性质分析, 纯化的重组pUOX的比活为50.63 IU/mg, 并发现重组蛋白在最佳温度、热稳定性等方面与天然pUOX相同, 为后续动物实验奠定重要的基础。

摘要:搅拌是影响透明质酸(HA)发酵的一个重要因素, 然而有关搅拌对HA发酵影响的认识存在较大争议。本研究采用计算流体力学(CFD)技术深入研究了搅拌对菌体生长和HA合成的影响。结果表明, 菌体量和HA产量受搅拌转速的影响很小, 而HA分子量随着转速的增加呈现出先增加后降低的趋势。分阶段控制转速研究表明转速对HA分子量的影响主要体现在HA合成阶段。CFD计算结果表明随着搅拌转速的增加, 混合时间降低的同时反应器内部的剪切速率明显增加。最终通过改变搅拌桨组合方式的手段有效地解决了上述矛盾, 并使得HA分子量提高23.9%。

摘要:发酵初期在米根霉菌发酵培养基中添加L-乳酸可以调控发酵产物乳酸的光学纯度。随着L-乳酸添加量的增加,所产L-乳酸的光学纯度随之增加, 当L-乳酸的添加量≥1.5 g/L时, D-乳酸不再产生。同时, L-乳酸的产量、生物量、糖转化率也随之降低。该调控方法对乳酸菌调控产L-乳酸光学纯度影响不大, 对大肠杆菌发酵调控产D-乳酸光学纯度没有效果。

摘要:采用上流式厌氧污泥床(UASB)反应器研究了亚硝酸盐型同步厌氧生物脱氮除硫工艺的性能。该工艺具有很高的硫化物和亚硝酸盐转化潜能, 最大容积硫化物去除率和容积硝酸盐去除率分别为13.4 kg/(m3·d)和2.3 kg/(m3·d); 所能耐受的最大进水硫化物和亚硝酸盐浓度分别为880 mg/L和252.7 mg/L; 最适进水硫化物和亚硝酸盐浓度分别为460 mg/L和132.3 mg/L, 最适水力停留时间为4 h。硫化物和亚硝酸盐的表观半抑制浓度分别为403.9 mg/L和120.8 mg/L,两者之间的联合毒性为拮抗作用。

摘要:外部引导序列(EGSs)是一类与mRNA靶序列互补并能引导核酶P切割靶mRNA的小分子RNA。本实验构建稳定表达UL49基因的HeLa细胞系, 设计合成了针对于人巨细胞病毒(HCMV)UL49基因的12 nt DNA性质的EGS1386, 通过转染稳定表达UL49基因的细胞系, 荧光定量PCR和Western blotting检测细胞内目的基因UL49的表达情况。结果显示在DNA-EGS1386作用下UL49基因的表达量降低了50%, 表明DNA-EGS1386可以有效引导人的核酶P切割目标mRNA。因此, DNA-EGS可以发展成为一种新的基因沉默技术和潜在的抗病毒试剂。

摘要:为了延长人激肽释放酶(hK)的血清半衰期, 提高分泌蛋白的产率, 制备了重组激肽释放酶-IgG1 Fc融合蛋白(hK'-Fc)。采用PCR扩增hK基因和IgG1的Fc序列, 用鼠源信号肽序列替换hK基因原有的信号肽序列, 构建改良型融合蛋白hK'-Fc以及天然型融合蛋白hK-Fc的表达载体, 转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞, 筛选稳定分泌融合蛋白的细胞株, 通过Western blotting鉴定信号肽改造效果, 利用Protein A+G亲合层析柱纯化融合蛋白, 酶学实验检测融合蛋白的体外活性。结果表明: 成功构建了pcDNA-hK'-Fc以及pcDNA-hK-Fc重组表达载体; 获得了稳定表达融合蛋白的细胞株, 产量达11 mg/L以上; 信号肽改造后融合蛋白的分泌效率提高约5~10倍; 融合蛋白能水解其特异性的底物S-2266, 具有生物学活性。本研究为进一步探讨融合蛋白的体内半衰期打下了坚实基础, 也为研制治疗脑梗塞疗效更好的第二代hK蛋白和其他药用蛋白的改良提供新的线索。

摘要:以体外培养的人乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象, 探讨surfactin对肿瘤细胞增殖、凋亡及细胞骨架的影响。MTT实验表明, surfactin能抑制MCF-7的增殖, 并且呈现出浓度和时间的依赖关系, 作用48 h时的IC50是27.3 mmol/L。AO/EB荧光染色法及流式细胞术检测发现, surfactin可诱导MCF-7发生典型的凋亡形态学改变和G2/M期阻滞。免疫荧光和免疫印迹结果表明, surfactin显著抑制了细胞内vimentin的表达, 诱导了a-tubulin的解聚和重排, 使细胞的骨架系统发生了剧烈的变化。可见, surfactin具有抑制MCF-7细胞增殖, 诱导细胞凋亡的作用, 其机制可能与细胞骨架蛋白的表达水平有关。

摘要:为了获得有活性的重组人白细胞介素21(rhIL-21), 本研究建立了在毕赤酵母 (Pichia pastoris) 中分泌表达rhIL-21的技术。首先, 通过RT-PCR从人外周血淋巴细胞中扩增IL-21cDNA, 克隆到酵母表达载体pPIC9K中, 构建了重组酵母表达载体pPIC9K-hIL21cDNA; 然后, 线性化的载体转化毕赤酵母表达菌株GS115, 经抗性梯度筛选获得了多拷贝重组酵母菌; 加入甲醇诱导培养后, SDS-PAGE和Western blotting 检测到培养液中有rhIL-21的分泌表达, 相对分子量约为16 kD, ELISA结果显示摇瓶表达量可达229.28 mg/L; 表达上清经阳离子交换介质SP Sepharose Fast Flow纯化后, 目的蛋白纯度达到95%。细胞增殖试验结果显示该rhIL-21联合刀豆蛋白A(Con A)对人淋巴细胞的增殖具有显著的促进作用。本研究首次成功在毕赤酵母表达系统中分泌表达了有生物活性的rhIL-21, 为相关疾病免疫治疗的研究奠定了基础。

摘要:肝素酶III是一种特异性地裂解乙酰肝素的酶, 在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体。为实现肝素酶III的可溶性表达, 利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与肝素酶III融合性能, 通过构建相应的表达质粒pGEX-heparinaseIII, 在大肠杆菌中实现了肝素酶III的可溶性表达。粗酶通过一步亲和纯化其纯度可达95% 以上。通过对LB培养基摇瓶培养Escherichia coli BL21的诱导时机、诱导剂用量、诱导时间等培养条件的优化, 确定了该可溶性肝素酶III融合蛋白的最适生产条件。通过对纯酶的最适反应温度、pH、Ca2+ 浓度等一系列性质研究, 确定了该酶的最适反应条件。

摘要:虫草素具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎等多种功效。为了更好地开发蛹虫草资源, 选择合适剂量的低能离子束注入蛹虫草, 优化虫草素的提取工艺条件, 采用紫外分光光度法检测注入前后菌株中虫草素的含量。结果表明: 最佳注入剂量为2.60×1015 ions/cm2, 虫草素最佳的微波-超声波提取工艺为: 乙醇浓度70%, 提取功率200 W, 提取时间110 s, 料液比1:240。选育出虫草素含量较高的15株菌株, 最高含量达(11.924±0.063) mg/g, 比原始菌株增长了近30%。

摘要:利用T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase, T7 RNAP)的体外转录方法因其简便、高效而在RNA制备中得到广泛应用, 但该法由于T7 RNAP的启动子跨越转录起始位点而会导致转录产物多出附加序列; 如果去掉T7启动子的转录起始位点, 则会严重降低T7 RNAP的转录活性。本实验很好地消除了以上弊端, 将T7 RNAP的高效转录系统与核酶高度专一的自剪切技术相结合, 成功构建了一种不影响转录效率的体外转录方法, 而且转录后核酶能够在设计的特定位点进行自剪切并释放出目的RNA, 得到了活性达113.6 pmol/μg的人线粒体色氨酸tRNA(HmtRNATrp (UCA))。该方法转录效率高、重复性好, 适合RNA的大量精确制备。

摘要:为了构建能够有效进入血脑屏障的新型融合蛋白PTD-maxadilan(PTD-MAX), 设计编码融合蛋白PTD-MAX基因, 克隆到表达载体pKYB, 构建重组表达载体pKYB-PTD-MAX, 转化大肠杆菌ER2566中。采用IPTG诱导由PTD-MAX、内含肽和几丁质组成的融合蛋白的表达。利用IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)介导的纯化系统制备目的融合蛋白PTD-MAX。所得的目的蛋白经激光飞行质谱测定分子量, 结果与理论值相符。动物实验结果表明融合蛋白PTD-MAX能够有效穿越血脑屏障, 重组PTD-MAX具有比天然maxadilan更显著(P<0.05)的抑制小鼠摄食的作用。融合蛋白PTD-MAX的构建和制备为其生物学功能的深入开发奠定了基础。

摘要:为开展人b干扰素-人血清白蛋白融合蛋白(IFNb-HAS)的临床前研究, 本研究采用免疫学方法对毕赤酵母转化子进行筛选, 得到高产菌株8株。在5 L发酵罐上对高产菌株进行诱导表达, 产量达500 mg/L。发酵液经超滤浓缩、染料亲和层析、镍离子螯合亲和层析和DEAE离子交换层析纯化后, 融合蛋白纯度达到96%。Western blotting杂交表明融合蛋白具有人血清白蛋白和人b干扰素的抗原性, 细胞病变抑制法测定IFNb-HSA比活性为1.96×107 IU/mg。建立了融合蛋白的生产工艺, 为IFNb-HSA的临床前研究奠定了基础。