摘要:微生物谷氨酰胺转胺酶具有催化蛋白质和某些非蛋白物质交联的功能，被广泛应用于食品、医药及纺织等领域。为提高该酶的产量及建立相应的分子改造平台，上世纪90年代日本味之素公司便开展了微生物谷氨酰胺转胺酶重组菌构建的研究。目前，该酶已在多个表达系统中实现活性表达，部分重组菌较野生菌的产酶能力有显著提高。近年来，谷氨酰胺转胺酶的分子改造研究也取得了初步进展，酶的催化活力、热稳定性及底物专一性得到提升。文中对上述研究中涉及的蛋白质表达及改造策略进行了简要的总结及分析，并指出相关研究的发展趋势。

摘要:近年来，随着发展低碳经济的迫切需要，可再生资源利用研究方兴未艾，其中，构建充分利用木质纤维素水解产物木糖生产乙醇的重组菌成为研究热点。木糖异构酶由于不需要辅酶，成为构建利用木糖重组酵母的首选途径。文中对近年来木糖异构酶的研究进展进行了综述。首先介绍了木糖异构酶的基本性质、序列、结构和功能特性，然后对其耐热机理进行了总结归纳；重点阐述了基于序列及结构进行的酶分子改造研究，包括底物特异性改造、热稳定性改造等；同时，结合作者的研究经历，对如何提高嗜热木糖异构酶在常温下的活性进行了探讨。最后，对木糖异构酶的研究进展进行了总结和展望，对基于结构改善木糖异构酶催化活性及构建新型高效利用木糖生产乙醇的重组菌具有重要的指导意义。

摘要:植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC 4.1.1.31) 是广泛存在的一种细胞质酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 和 HCO3-生成草酰乙酸 (OAA)，后者可转化生成三羧酸循环的多种中间产物。PEPC在植物细胞中参与植物的光合碳同化等重要代谢途径，并且在不同组织中具有多种生理功能。PEPC同时也参与调控植物种子的营养物质合成与代谢过程，控制糖类物质流向脂肪酸合成或蛋白质合成途径。以下介绍了植物PEPC的种类、蛋白质结构特点及其在植物组织中的调控方式，并重点论述了PEPC在生物基因工程中的应用方面的进展，随着对其功能机制和应用研究的深入，将有助于植物PEPC在高产优质农作物育种、能源植物和工业微生物等的开发利用等方面得到更好的发展与应用。

摘要:为了克隆鹅β-防御素 (AvBD) 3基因，并在原核表达重组鹅AvBD3蛋白，进一步研究鹅AvBD3蛋白的生物学特性，利用RT-PCR方法从鹅脾脏和法氏囊组织中扩增到鹅AvBD3基因片段，其cDNA片段大小为182 bp，编码60个氨基酸残基。经同源性分析发现鹅AvBD3氨基酸序列与鸡AvBD3氨基酸序列同源性最高，为100％。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的BamHⅠ和SalⅠ双酶切位点上，构建重组表达质粒pGEX-goose AvBD3。将重组质粒转化大肠杆菌BL21，于37 ℃用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳表明，重组鹅AvBD3蛋白在原核高效表达 (分子量约31 kDa)。该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性与理化特性，结果显示，重组鹅AvBD3蛋白具有广谱的抗菌活性，对12种细菌，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑菌作用。高盐离子浓度显著降低重组鹅AvBD3蛋白的抗菌活性。此外，该重组蛋白的溶血活性极低，并对酸碱度具有较高的稳定性。

摘要:皮肤坏死毒素 (DNT) 是支气管败血波氏杆菌的主要致病因子之一。通过PCR分段扩增和克隆获得了全长4 356 bp的dnt基因，并利用pET-28a/BL21系统对其进行了融合表达。Western blotting检测结果表明，表达产物具有良好的免疫学活性。使用His-band purification kit纯化试剂盒纯化后，得到纯度为93.2％的融合蛋白His6-DNT。在乳鼠皮肤坏死试验中，表达产物His6-DNT和天然DNT均能导致乳鼠皮肤产生坏死性病变。在乳鼠皮肤坏死阻断试验中，兔抗His6-DNT血清能中和天然DNT使其失去对乳鼠的皮肤坏死毒性。试验结果表明，重组蛋白具有天然DNT的生物学毒性和免疫原性，所产生的抗体具有中和活性。文中所获得的重组DNT蛋白具有良好的生物学活性，为DNT的结构和功能研究奠定基础。

摘要:猪细小病毒 (PPV) VP2蛋白N端连续9个甘氨酸富集的编码区是VP3蛋白的切割位点，常规PCR扩增容易导致该区段的缺失，为研究该缺失对PPV病毒样颗粒 (VLPs) 的影响，探索VP2病毒样颗粒上适合外源基因插入的位点，构建了该区段缺失的VP2的真核表达载体pCI-△VP2，并以完整VP2作为对照，采用脂质体介导法转染Vero细胞，通过生物信息学技术、SDS-PAGE、Western blotting、间接免疫荧光以及正染和免疫电镜对表达产物进行分析观察；进一步将重组质粒以核酸疫苗的方式直接肌注免疫小鼠，采用间接ELISA试验、淋巴细胞增殖试验和T细胞亚群流式细胞技术，分析免疫小鼠的体液和细胞免疫应答。结果显示，缺失△VP2和完整VP2在Vero细胞中均能自我装配成VLPs，并具有与完整病毒粒子类似血凝性，pCI-△VP2和pCI-VP2均可诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答和良好的细胞免疫应答。结果表明，甘氨酸富集区的缺失不影响VP2病毒样颗粒的装配和免疫原性，△VP2同样可进行PPV VLPs疫苗和抗原转运载体的研制，为VLPs载体改造和修饰位点的探索提供了新方向，为VP2基因结构与蛋白质功能的关系提供了新的理论依据。

摘要:以从新疆艾丁湖采集的土样中分离出的中度嗜盐菌Salinivibrio YS为研究对象，利用该菌在厌氧条件下生产2,3-丁二醇和琥珀酸，在单因素摇瓶实验基础上，确定影响产物积累的各因素及其相应条件，再利用正交试验确定这些参数的最佳水平，即温度33 ℃，起始pH为8.0，发酵过程pH为7.0，乙酸添加量为3 g/L，NaCl浓度为10 g/L。利用优化条件进行3 L体系的发酵放大实验，经过108 h的无氧发酵，2,3-丁二醇的产量可达35.05 g/L，而琥珀酸的含量则高达22.46 g/L，且其糖的总转化率高达约50％。首次利用嗜盐菌在厌氧条件下生产2,3-丁二醇和琥珀酸，拓展了嗜盐菌的应用，同时也为生产2,3-丁二醇和琥珀酸提供了新的思路。

摘要:4-羟基丁酸 (4-HB) 不仅具有医学应用价值，而且是合成生物材料P3HB4HB的重要前体。在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 参与情况下，大肠杆菌Escherichia coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 可以把1,4-丁二醇 (1,4-BD) 转化为4HB。为提高4HB产率，通过过表达烟酸磷酸核糖转移酶 (PncB) 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶 (NadE) 增加胞内NAD含量，从而加速1,4-BD转化反应的进行。结果表明，PncB-NadE的表达使1,4-BD转化率比对照组增加13.03％，由10 g/L的1,4-BD得到4.87 g/L的4HB，单位细胞的4HB产量由1.32 g/g提高40.91％至1.86 g/g。因此PncB和NadE可用于促进1,4-BD转化为4HB。

摘要:解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2 (YlLip2) 是一种具有广泛应用前景的工业酶。为了改善高密度发酵生产YlLip2过程中的溶氧限制，提高YlLip2的表达量，将YlLip2基因lip2和透明颤菌血红蛋白 (VHb) 基因vgb分别置于AOX1启动子和PsADH2启动子的调控之下，进行YlLip2和VHb在毕赤酵母中的共表达。PsADH2启动子来源于树干毕赤酵母Pichia stipitis，在低氧条件下能被激活。SDS-PAGE和CO-差式光谱分析表明，YlLip2和VHb在重组菌中成功实现了共表达。在氧限制性条件下，VHb表达的细胞 (VHb+，GS115/9Klip2-pZPVT) 与对照细胞 (VHb?，GS115/9Klip2) 相比，摇瓶和10 L发酵罐中YlLip2表达量分别提高了25％和83％。此外，在低氧条件下，VHb+细胞在10 L发酵罐中的生物量也比VHb?细胞高。文中也获得了一株表达了VHb的并携带有多个lip2基因拷贝的克隆子GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#，在低氧条件下，该克隆子在10 L发酵罐中的最高脂肪酶水解活力达33 900 U/mL。因此，在毕赤酵母中用PsADH2启动子表达VHb，同时增加lip2基因的拷贝数是提高YlLip2表达量的一种有效策略。

摘要:大肠杆菌中色氨酸向胞内的转运主要是由mtr、tnaB和aroP 3个基因编码的通透酶进行调控。利用Red重组技术，在mtr单基因敲除菌的基础上，成功构建了mtr. tnaB和mtr. aroP双基因敲除菌以及mtr. tnaB. aroP三基因敲除菌，并通过发酵实验首次考察了色氨酸转运系统多基因缺失对大肠杆菌合成色氨酸的影响。发酵结果表明，mtr. tnaB和mtr. aroP双基因缺失后，色氨酸产量分别达到1.38 g/L和1.27 g/L，与出发菌株相比分别提高了17％和9％，而mtr. tnaB. aroP三基因缺失后，菌体生长受到了明显抑制，发酵后色氨酸产量仅为0.63 g/L。在补料分批发酵实验中，mtr. tnaB双基因敲除菌的色氨酸产量进一步提高至12.2 g/L，与出发菌株相比色氨酸产量提高了27％。

摘要:采用优化模型对药用丝状真菌樟芝的复杂发酵过程进行建模，并获得最优发酵培养基组成。对樟芝发酵过程中的形态变化过程进行了观察，并分别采用人工神经网络 (ANN) 和响应面法 (RSM) 对樟芝发酵过程进行建模，同时采用遗传算法 (GA) 优化了发酵培养基组成。结果表明，ANN模型比RSM模型具有更好的实验数据拟合能力和预测能力，GA计算得到樟芝生物量理论最大值为6.2 g/L，并获得发酵最佳接种量及培养基组成：孢子浓度1.76×105个/mL，葡萄糖29.1 g/L，蛋白胨9.4 g/L，黄豆粉2.8 g/L。在最佳培养条件下，樟芝生物量为 (6.1±0.2) g/L。基于ANN-GA的优化方法可用于优化其他丝状真菌的复杂发酵过程，从而获得生物量或活性代谢产物。

摘要:米根霉Rhizopus oryzae脂肪酶不仅在众多工业领域中具有良好的应用价值，其典型的分子内伴侣结构(Intramolecular chaperon) 也是研究蛋白质翻译后加工和成熟的理想材料。以R. oryzae HU3005为材料，克隆了其脂肪酶前体基因 (pro-ROL) 和成熟脂肪酶基因 (m-ROL)，并实现了其在巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115中的分泌表达。酶学性质比较分析表明：m-ROL对中等链长底物 (C10和C12) 具有更高的水解活性，而pro-ROL更倾向于短链底物 (C4)，且在pH 8.0时活性最高。再者，pro-ROL具有比m-ROL更好的温度稳定性。推测m-ROL和pro-ROL脂肪酶酶学性质的差异可能是由前序列对脂肪酶的折叠和修饰的影响而导致。为提高m-ROL的表达水平，采用重叠延伸PCR技术将基因中8个低频密码子替换为高频密码子。在摇瓶条件下，发酵72 h后，经密码子优化后的m-ROL酶活和蛋白质含量分别达到132.7 U/mL和50.4 U/mL，而初始m-ROL和pro-ROL酶活和蛋白质含量分别仅为28.7 U/mL和14.4 mg/L、29.6 U/mL和14.1 mg/L。

摘要:研究了毕赤酵母Pichia pastoris表达的重组人复合α干扰素（cIFN）时不同诱导甲醇浓度对cIFN 分离纯化得率的影响，并分析了原因。在5 L罐中采用0.25、0.50和0.75％（W/V）三个甲醇浓度诱导时，在0.75％高甲醇浓度诱导下cIFN表达水平最高，达到2.06 g/L，是0.25％低甲醇浓度诱导的1.24倍，但是低甲醇浓度诱导下cIFN分离纯化得率却高于高甲醇诱导浓度下3.75倍。另外，低甲醇浓度下发酵上清液cIFN抗病毒活性为2.85×108 IU/mL，较高甲醇浓度提高了4.48倍。进一步采用SDS-PAGE和Native-PAGE免疫印迹分析不同条件下发酵液中cIFN存在状态，发现在高甲醇浓度下cIFN容易形成大量的聚合体，分别为共价聚合和非共价聚合，而cIFN单体含量较少，但是低甲醇浓度诱导下情况完全相反。最终在0.25％甲醇诱导下分离纯化1 L发酵上清液可得0.73 g单体cIFN，是0.75％甲醇诱导下的3.84倍。

摘要:应用定向进化技术提高了嗜热拟青霉Paecilomyces thermophila J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶 (PtLic16A) 在酸性条件下的催化能力。结合易错PCR和DNA改组的方法，构建了β-葡聚糖酶的突变体文库；利用刚果红染色法建立了阳性克隆的高通量筛选体系。筛选得到的突变酶PtLic16AM1的反应最适pH由7.0变化至5.5，且保持了原有的耐热性和比酶活。突变酶的DNA序列中有4个点位发生突变，引发了4处氨基酸替换，分别是T58S、Y110N、G195E和D221G。结构模拟结果显示，发生突变的4个氨基酸位点中，Y110N位置靠近酶活性中心，而T58S、G195E和D221G则离酶活性中心较远，其中T58S、G195E可能对酶最适pH的变化起到了关键作用。