摘要:干细胞在体外特定培养条件下可以被诱导分化成具有不同体细胞表型的细胞。除了通过不同培养条件进行体外诱导分化的方法外，用成熟体细胞与干细胞共培养同样可以诱导干细胞定向分化。以下首先简述了脂肪干细胞 (Adipose-derived stem cells，ADSCs) 的来源及其标志，然后重点就ADSCs的不同培养方法、诱导分化及最新的临床应用进行阐述，包括药物及化学诱导培养、体细胞与ADSCs二维、三维共培养等，最后提出ADSCs的问题所在并对此技术进行展望。

摘要:黄单胞杆菌属TAL效应子类蛋白作为病原菌的毒性因子或无毒因子，能够与寄主靶基因DNA的启动子进行特异性识别，调控寄主的基因表达，引起致病或抗病反应。TAL效应子类蛋白识别靶基因DNA的模式，是2个氨基酸决定1个核苷酸的识别。这种新型的蛋白质-DNA互作方式有可能在基因治疗、植物抗病基因发掘、广谱抗病基因构建等生物医学工程和农业工程方面得到广泛应用。文中综述了TAL效应子类蛋白的发现及功能，TAL效应子与寄主靶基因识别的专一性及分子密码，并对该分子密码当前的应用现状及前景进行了讨论和展望。

摘要:丝状真菌产生的次级代谢产物是新药的重要来源之一，其生物合成过程受到众多因素的调控。最近的研究表明，表观遗传对多种丝状真菌次级代谢产物的生物合成具有调控作用。DNA和组蛋白的甲基化与乙酰化修饰是目前所知的丝状真菌主要的表观遗传调控形式。通过过表达或缺失相关表观修饰基因和利用小分子表观遗传试剂改变丝状真菌染色体的修饰形式，不仅可以提高多种已知次级代谢产物产量，而且可以通过激活沉默的生物合成基因簇诱导丝状真菌产生新的未知代谢产物。丝状真菌表观遗传学正逐渐成为真菌菌株改良的新策略以及挖掘真菌次级代谢产物合成潜力的强有力手段。

摘要:为有效监测免疫狂犬病疫苗后的抗体水平，以狂犬病病毒N蛋白的主要抗原表位所在区域N1蛋白为包被抗原，建立了SPA-ELISA抗体检测方法。用RT-PCR方法分别扩增出狂犬病病毒Flury LEP株N基因及其N1区域 (1 000~1 353 bp)，将二者分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，并将重组的表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3) 中，经1 mmol/L IPTG诱导后进行免疫印迹分析。结果表明，重组的RV N和RV N1均以包涵体形式表达。与表达全长RV N相比，RV N1的表达量显著高于前者，且该重组蛋白同样具有良好的反应原性。用纯化的重组RV N1作为诊断抗原建立了检测犬RV抗体的间接ELISA方法。通过优化反应条件，确定抗原最佳包被量是2 mg/L，血清的最佳稀释度为1∶100，Protein A-HRP的稀释度为1∶4 000。用建立的ELISA方法对102份临床血清样品进行检测，与商品化试剂盒相比，二者的符合率为94.1％。试验结果表明基于主要抗原表位所在区域N1蛋白的SPA-ELISA方法可有效用于犬RV抗体水平的检测，为检测RV免疫抗体的ELISA试剂盒的研制奠定了基础。

摘要:根据甜蛋白des-pGlu1-Brazzein的成熟区氨基酸序列，按照酵母密码子的偏好优化其编码序列，合成了4对末端具粘合位点的寡聚核苷酸序列，经连接、PCR扩增后得到了179 bp的des-pGlu1-Brazzein编码序列，插入到pPIC9K载体中，构建了重组表达载体pPIC9K-Bra。经酶切、电击转化到毕赤酵母菌GS115中。酵母工程菌株经筛选鉴定后诱导表达，目的蛋白的表达量约占上清总蛋白的51.6％，分离纯化后的des-pGlu1-Brazzein具有一定的甜度。

摘要:将葡萄Vitis vinifera L.的蔗糖转运蛋白基因VvSUC11和VvSUC12与甘薯Ipomoea batatas L. Lam.的甘薯贮藏蛋白 (Sporamin) 基因的根部特异性启动子命名为SP1和SP2重组。以pCAMBIA2301为起始载体，构建了pCAMBIA2301- SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12用农杆菌介导法转化了甜菜Beta vulgaris L.品种KWS-9103，发现预培养4 d，侵染时农杆菌的浓度OD600值为0.5，附加0.005％表面活性剂Silwet L-77，延迟筛选4 d，转化效率最高，可达42％。对在卡那霉素中分化并生根的甜菜植株进行PCR和RT-PCR检测，证明目的基因已整合到甜菜中并表达，为进一步研究该基因在甜菜Beta vulgaris中的功能奠定了基础。

摘要:为揭示细胞珠蛋白对肝星状细胞氧化损伤的保护作用及相关机制，通过siRNA干扰内源性细胞珠蛋白基因，利用重组细胞珠蛋白作用于完全活化的人肝星状细胞系LX-2及大鼠原代肝星状细胞，并在LX-2细胞内过表达细胞珠蛋白，考察在过氧化氢及铁过载两种不同作用机制的氧化反应模型中细胞的增殖性及细胞内超氧化物水平。结果表明内源性细胞珠蛋白对于两种氧化反应导致的肝星状细胞损伤都具有显著性的保护作用，证明其在活化肝星状细胞内的表达上调是其应对氧化应激的保护性措施；重组细胞珠蛋白不仅能保护完全活化的LX-2细胞免受氧化应激损伤，并且能抑制未完全活化的原代肝星状细胞过度增殖以及保护其被过度损伤；重组细胞珠蛋白对细胞内的活性氧清除效果不理想，可能与其进出细胞缺乏相应的主动运输机制有关。进一步在LX-2细胞内过表达细胞珠蛋白对无论是铁过载或是过氧化氢引起的氧化反应均能发挥较好的保护性作用。本研究为加速肝纤维化药物新靶点开发提供了理论依据。

摘要:为了探讨O-GlcNAc修饰的生物学作用和相关疾病的发病机理，需制备高效、专一的O-GlcNAcase (OGA) 抗体。通过对人源OGA蛋白进行序列分析发现，氨基端1~350 aa片段 (sOGA) 抗原性和亲水性较强，将该片段构建至原核表达载体pET-28a，并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中进行诱导表达，通过优化IPTG浓度 (0.05 mmol/L) 和诱导时间 (10 h) 获得了高可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和分子筛层析对重组蛋白进行了纯化，SDS-PAGE检测分子量的大小 (45 kDa) 和纯度 (95％以上)。以4-MU-O-GlcNAc为荧光底物，检测到sOGA的糖苷酶活性为106 nmol/(min·mg)，表明该片段是OGA糖苷酶的活性区域。以此片段作为抗原免疫新西兰大白兔，以CNBr活化Sepharose 4B微珠纯化抗血清制备OGA特异性多克隆抗体。Western blotting和ELISA检测表明，该抗体可以特异识别含有OGA糖苷酶活性区域的多种变体，检测灵敏度为0.11 ng/mL (效价为1∶80 000)，可应用于O-GlcNAcase生物功能研究。

摘要:艾滋病病毒 (Human immunodeficiency virus，HIV) 通过与靶细胞膜的融合感染宿主细胞，研究表明阻断HIV与受体靶分子的结合可以阻止HIV进入宿主细胞，抑制HIV病毒的感染。设计合成了一个包含CD4和CCR5与HIV-1结合的主要功能结构区，及Flt3-L和Mip-3α分子的融合基因，构建了2个融合基因的真核表达载体pABK-CKR5-CD4/Flt3L-Mip3α (pABK-HIV-MF) 和pABK-CKR5-CD4 (pABK-HIV-MT)，在人胚肾293细胞中进行了表达。RT-PCR、细胞免疫荧光技术、ELISA和Western blotting检测结果表明融合基因在真核细胞中获得了正确的表达，这为进一步研究其对于HIV-1的拮抗并靶向树突状细胞 (DC) 清除研究奠定了基础。

摘要:以表达人重组尿激酶原中国仓鼠卵巢 (CHO) 工程细胞系11G-S为研究对象，运用基因芯片技术比较了CHO工程细胞在批次及流加培养不同生长阶段基因表达水平的差异，在此基础上采用Genmapp软件，同时结合已知的细胞周期信号通路图，着重分析了批次及流加培养CHO工程细胞的细胞周期调控基因转录谱差异。在基因芯片涉及的19 191个目标基因中，批次和流加培养不同生长阶段CHO工程细胞的下调表达的基因数量多于上调表达基因数目；两种培养模式下的基因差异表达有着明显的不同，尤其是在细胞生长的衰退期，流加培养CHO工程细胞中下调表达的基因数量明显多于批次培养。有关调控细胞周期关键基因的转录谱分析表明，CHO工程细胞主要是通过下调表达CDKs、Cyclin及CKI家族中的Cdk6、Cdk2、Cdc2a、Ccne1、Ccne2基因及上调表达Smad4基因，来达到调控细胞增殖及维持自身活力的目的。

摘要:为了筛选并建立一种由猪羊水干细胞向心肌细胞分化的有效方法，以猪羊水干细胞为研究对象，以5-氮胞苷 (5-aza) 和维生素C (Vc) 为诱导剂，对猪羊水干细胞形成的类胚体 (EBs) 进行诱导分化。应用免疫荧光、RT-PCR、透射电镜技术检测跳动细胞团中心肌特异性标记的表达情况。结果显示，在猪羊水干细胞形成的类胚体中加入心肌细胞诱导剂，10 d后即见到节律性跳动的细胞团，t检验发现0.1 mmol/L Vc加5 μmol/L 5-aza联合诱导组的诱导效率最高，达33％。免疫荧光结果显示跳动心肌细胞团表达细胞骨架蛋白α-actin和肌钙蛋白Tnni3。RT-PCR检测跳动心肌细胞团，发现心肌细胞特异性标记分子TbX5、Gata4、α-MHC、Tnni3均呈阳性表达。借助透射电镜观察诱导后的跳动样细胞团，能清晰可见其中的肌丝、糖原粒、糖原池等结构。说明5-氮胞苷和维生素C可以促进猪羊水干细胞向心肌细胞的诱导分化。

摘要:以增强型绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶为报告基因，构建了鸡卵清蛋白启动子表达载体和慢病毒载体，以巨细胞病毒 (Cytomegalovirus，CMV)启动子表达载体为对照，转染或感染鸡原代输卵管上皮细胞、鸡胚成纤维细胞、鼠3T3-L1前脂肪细胞和牛乳腺上皮细胞，通过荧光和酶活性检测，旨在筛选出用于实现转基因鸡生物反应器的高效特异性表达载体。结果发现，鸡卵清蛋白启动子表达载体转染以上4种细胞后2种标记基因均有表达，没有表现出明显的细胞特异性，且荧光素酶检测结果表明其在各细胞组中表达活性都低于CMV启动子表达载体100倍以上；慢病毒载体感染以上4种细胞后2种标记基因均有表达，在鸡输卵管上皮细胞组感染单个细胞的病毒颗粒 (Multiplicity of infection，MOI) 为20时绿色荧光蛋白表达量就可以达到CMV启动子表达载体的水平。上述结果表明，基于卵清蛋白基因调控序列构建的表达载体无法实现外源基因的高效、特异性表达，而慢病毒载体在表达活性和广泛性上可以用于进行鸡输卵管生物反应器的研究。

摘要:逆转录病毒表达系统是基因治疗研究和RNA干扰技术广泛采用的外源基因表达系统。文中以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因的表达水平和稳定性为指标，比较逆转录病毒表达载体pQCXIN和pcDNA3.1(+) 表达质粒介导的外源基因在HEK293细胞和CHO-K1细胞的表达效率。病毒感染HEK293细胞和CHO-K1细胞的相对荧光强度 (Relative fluorescence intensity，RFI) 均约为对应的质粒转染细胞的2倍。多轮反复感染逆转录病毒表达载体能有效提高HEK293细胞表达EGFP的效率。HEK293细胞经4轮病毒感染后的RFI值较1次病毒感染的RFI值约提高2倍。此外，逆转录病毒表达载体介导的外源基因表达的稳定性优于质粒转染的外源基因表达。采用携带人重组活性蛋白C (Recombinant human activated protein C，rhAPC) 基因的pQCXIN和HEK293细胞进一步验证了逆转录病毒载体介导的外源基因表达效率，构建了rhAPC表达水平为10~15 mg/(106 cells·d) 的HEK293细胞系。研究结果表明，逆转录病毒表达系统是有应用价值的介导外源基因在哺乳动物细胞高效表达的技术途径。

摘要:基于DNA环介导恒温扩增技术 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，探索建立一种应用于NDM-1基因 (New Metallo-β-Lactamase-1 Gene，NDM-1) 的快速检测方法，以适应临床实验室等的检测需求。利用LAMP技术，以NDM-1基因为靶序列，设计4组LAMP引物，并筛选最优引物组，建立LAMP反应体系与条件，进行灵敏度和特异性实验。结果表明整个检测过程仅需1 h，即可通过肉眼直接目测实验结果。在灵敏度试验中，NDM-1基因的最低检测限为6 拷贝/反应。在特异性实验中，以4株病原菌 (肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌) 以及肠道菌群元基因组DNA、土壤菌群元基因组DNA为模板对NDM-1基因进行检测，结果显示均没有发生非特异性扩增反应。文中建立的LAMP检测方法能够快速检测NDM-1基因，且可直接观察到实验结果，实现了检测结果的可视化。具有操作简单安全、检测灵敏度高、特异性高的特点，能够满足基层实验室、应急检测或现场监测等方面的使用需求，具有良好的应用价值。

摘要:利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性，建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法，并用该方法获得sTNFRII-gAD (可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白) 蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量 (MOI) (0~1 000) 感染BHK21c022细胞，观察比较其转导效率和细胞毒性。用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD。用rAd5-sTNFRII-gAD以不同的MOI (0~1 000) 感染BHK21c022细胞，收取上清进行Western blotting分析，比较上清中sTNFRII-gAD蛋白的表达量。在此基础上，用rAd5-sTNFRII-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞，在无血清培养条件下反复多次收取培养上清，经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD融合蛋白，并体外测定该融合蛋白拮抗TNFa的活性。结果获得了携带sTNFRII-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD；用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明，随着腺病毒用量的增高，表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加；MOI在0~100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性，MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。Western blotting分析结果表明，随着腺病毒用量的增高，培养上清中sTNFRII-gAD融合蛋白表达量明显增加，以MOI为1 000时最高。在此基础上，我们用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL，每48 h收获上清1次并换液，反复6次收取培养上清共约3 L，经过纯化获得了约11 mg的sTNFRII-gAD融合蛋白。体外活性测定实验表明，获得的sTNFRII-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用。腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统，利用该系统成功制备了有生物学活性的sTNFRII-gAD融合蛋白。该表达系统的特点是生产规模易于放大，适应无血清培养，可以反复多次收获目标蛋白。

摘要:以灵杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增非特异性核酸酶 (Non-specific nuclease，NU) 基因，并克隆到pMAL-c4X载体上构建重组表达载体pMAL-c4X-NU。经测序及 BLASTN发现其与灵杆菌Serratia marcescens核酸酶基因的同源性为97％。将构建的表达载体pMAL-c4X-NU转入大肠杆菌BL21，经IPTG诱导实现了胞内表达78 kDa的麦芽糖结合蛋白-NU融合蛋白 (Maltose-binding protein-NU，MBP-NU)，其最佳诱导表达条件为37 ℃，0.75 mmol/L IPTG诱导1.5 h。用Amylose resin纯化得到了目的蛋白。活性检测表明MBP-NU具有同时降解DNA和RNA的活性，在37 ℃、pH 8.0时活性最高，比活力为1.11×106 U/mg，目标蛋白的纯化效率可达10.875 mg/L。纯化的目标蛋白中无蛋白酶活性存在。0.5 mmol/L乙二胺四乙酸 (Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、1 mmol/L苯甲基磺酰氟 (Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF) 以及150 mmol/L KCl对MBP-NU的活性几乎无影响，因此MBP-NU可作为蛋白质纯化过程中核酸的高效降解酶。