摘要:硫酸软骨素是一种典型的硫酸化糖胺聚糖，具有多种药物活性，广泛应用于药品、保健品及化妆品行业。硫酸软骨素是动物软骨中蛋白聚糖的主要成分和少数几种细菌的荚膜多糖，因此可利用动物提取法和发酵法进行生产。以下综述了硫酸软骨素的发酵生产及其合成机制的研究进展，并对其发展趋势进行了展望。

摘要:从鸽的骨髓和肝组织中扩增到2个禽β-防御素 (AvBD) 基因，在大肠杆菌中高效表达，检测其重组蛋白的抗菌活性。应用RT-PCR方法从鸽的骨髓和肝脏组织中扩增AvBD5基因，根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-5的氨基酸序列构建系统进化树，将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达，对该重组蛋白进行纯化，测定体外抗菌活性与理化特性。测序得到这2个基因的cDNA大小均为201 bp，编码66个氨基酸残基，内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现，该基因推导的两组氨基酸序列与鸭AvBD5的同源性最高，分别为87.9％和78.8％，这两组氨基酸序列的同源性为83.3％。因此，将其分别命名为鸽AvBD5α (骨髓) 和鸽AvBD5β (肝脏)。进一步将这两个基因分别亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达。两个重组融合蛋白经纯化后，通过菌落计数法测定其体外抗菌活性，盐离子浓度对其抗菌活性的影响，及其融合蛋白的溶血活性。结果表明，重组鸽AvBD 5α、AvBD 5β融合蛋白的分子量约为32 kDa。具有明显的抗菌活性，对12种细菌均有不同程度的抑制作用，高盐浓度对其抗菌活性显著影响。此外，这两个重组蛋白对红细胞无显著溶血活性。

摘要:本研究旨在通过构建西农萨能羊固醇调节元件结合蛋白-1 (SREBP-1) 基因的重组腺病毒超表达载体，获得有感染性的病毒颗粒，并检测该基因过表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响，为进一步研究该基因在脂肪酸代谢及泌乳调控中的功能奠定基础。根据GenBank中收录的西农萨能羊SREBP-1基因的序列设计引物，PCR扩增后进行测序。将测序正确的目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后并进行线性化，转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌Escherichia coli BJ5183感受态细胞中进行同源重组，将重组成功的质粒进行PacⅠ酶线性化，转染HEK 293细胞进行重组腺病毒的包装、扩繁及滴度测定。病毒液感染原代乳腺上皮细胞，实时荧光定量检测SREBP-1超表达效果及对脂肪酸代谢相关基因的影响。结果表明：重组腺病毒质粒构建成功，腺病毒滴度为109 U/mL。病毒液感染乳腺上皮细胞48 h后，SREBP-1基因表达量上升大约15倍，72 h后，表达量上调了30倍；对脂肪酸代谢相关基因的影响在72 h较为明显，其中，脂肪酸合酶 (FASN) 及酰基辅酶A羧化酶 (ACC) 均显著上调了大约两倍，过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPARγ) 上调了大约1.5倍，肝素X受体 (LXRα) 及甘油三酯水解酶 (ATGL) 表达量升高了1.2倍；其中硬脂酰辅酶A去饱和酶 (SCD) 表达水平无明显变化。表明在西农萨能羊乳腺上皮细胞中，SREBP-1能够促进脂肪酸合成相关基因的表达，对山羊乳腺脂肪酸代谢具有调控作用。

摘要:埃博拉病毒 (Ebola virus，EBOV) 是一种能导致人类及脊椎动物出血热的致死性病毒，对公共卫生具有较严重的危害。EBOV的NP蛋白在病毒复制中具有重要作用，也是诊断该病重要的靶蛋白。文中原核表达重组扎伊尔型EBOV的NP蛋白，重组蛋白免疫bal/c小鼠，制备了一株小鼠抗EBOV-NP的单克隆抗体。利用Western blotting方法，该抗体能特异识别真核表达和原核表达的重组EBOV-NP，并能同莱斯顿型 (Reston Ebola virus, REBOV)、科特迪瓦型 (Cote-d’Ivoire Ebola virus, CIEBOV) 和本迪布焦型 (Bundibugyo Ebola virus, BEBOV) 埃博拉病毒产生交叉反应，而不与苏丹型 (the Sudan Ebola virus, SEBOV) 和马堡型 (the Marburg virus, MARV) 埃博拉病毒产生反应。利用突变PCR和Western blotting方法，定位了该抗体识别的抗原决定簇序列，该序列 (PPLESD) 位于EBOV-NP蛋白的C端583-588aa。生物信息学研究表明，该序列在已经公布的ZEBOV、CIEBOV、BEBOV共16个型和REBOV的4个型中高度保守。研究结果为建立以上各型埃博拉病毒的检测方法提供了工具，也为研究埃博拉病毒复制及致病机理提供了基础。

摘要:启动子优化是合成生物学研究的重要工具，可以通过不同强度的启动子调控基因转录水平以优化生物途径。丁醇是一种多用途的基础化工原料，目前有很多代谢工程手段应用在大肠杆菌的丁醇异源表达中，但是并没有进行启动子的精细调控。文中以大肠杆菌为宿主构建异源丁醇合成途径，通过DNA assembler的方法一步组装不同强度启动子组合的丁醇合成途径以优化丁醇合成。以强启动子Alper PLTetO1或弱启动子Alper BB转录硫解酶，以强启动子Braatsch 20或弱启动子Braatsch 10转录丁醇合成操纵子，共构建成4种不同质粒。结果表明以Alper PLTetO1转录硫解酶，Braatsch 10转录丁醇合成操纵子的组合获得最高的丁醇产量28 mg/L，与其他组合相比丁醇产量提高了3~5倍。

摘要:在以碳酸钠为酸中和剂的大肠杆菌两阶段发酵产琥珀酸的过程中，由于Na+的积累造成发酵体系中渗透压的提高，严重抑制了琥珀酸的产物浓度。为了增强大肠杆菌对渗透压的耐受性，考察了利用进化代谢方法筛选高渗透压耐受型高产琥珀酸大肠杆菌菌株的可行性。进化代谢系统作为一种菌株突变装置，可以使菌体在连续培养条件下以最大的生长速率生长。以NaCl为渗透压调节剂，通过在连续培养装置中逐步提高NaCl浓度使菌体在高渗透压条件下快速生长，最终得到了一株高渗透压耐受型琥珀酸生产菌株Escherichia coli XB4。以碳酸钠为酸中和剂，在7 L发酵罐中利用Escherichia coli XB4进行两阶段发酵，厌氧培养60 h后，琥珀酸产量达到了69.5 g/L，琥珀酸生产速率达到了1.81 g/(L·h)，分别比出发菌株提高了18.6％和20％。

摘要:芳香族L-氨基酸是合成许多药物、农药、精细化学品和食品添加剂的重要手性砌块 (Chiral building blocks)。利用酶催化具有高活性和高立体选择性的特点合成手性砌块是目前不对称合成领域重要的研究方向。通过对不同来源转氨酶的进化分析，选择分别源自原核生物大肠杆菌Escherichia coli和真核生物酿酒酵母Saccharomyces cerevisia中的两种具有代表性Ⅰ型芳香族转氨酶TyrB和Aro8，比较研究了两种转氨酶通过平衡逆转不对称氨化催化合成芳香族L-氨基酸的反应过程和催化效率。重组转氨酶TyrB和Aro8都能有效地合成天然芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸以及非天然氨基酸苯甘氨酸。手性HPLC分析表明，合成的氨基酸都是L-构型的，e.e值等于100％。L-丙氨酸是适宜的氨基供体，转氨酶TyrB和Aro8都不能利用D-型氨基酸作为氨基供体。反应体系中氨基供体L-丙氨酸和氨基受体芳香族α-酮酸的最适摩尔比为4∶1。底物芳香族α-酮酸分子结构中芳香环上的取代基以及脂肪酸碳链部分的长度都对酶催化的转氨效率有显著的影响。在制备规模试验中，TyrB催化不对称转氨反应合成L-苯甘氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的比生产速率为0.28 g/(g·h)、0.31 g/(g·h)和0.60 g/(g·h)，Aro8催化上述反应的比生产速率分别为0.61 g/(g·h)、0.48 g/(g·h)和0.59 g/(g·h)。研究结果对利用转氨酶通过平衡逆转不对称催化合成芳香族L-氨基酸的工业化应用具有指导意义。

摘要:探究了外界Ca2+ (0~50 mmol/L) 对丹参培养细胞迷迭香酸合成及其相关酶活性的影响，并利用细胞膜钙离子通道抑制剂异搏定 (Verpamil, VP) 及钙离子载体A23187初步探讨了外界Ca2+浓度变化影响丹参培养细胞次生代谢的机制。结果显示：培养6 d时的丹参细胞中迷迭香酸积累量与外界Ca2+浓度显著相关，其中10 mmol/L Ca2+最有利于迷迭香酸的合成，迷迭香酸最大积累量达20.149 mg/g DW，比1 mmol/L和3 mmol/L Ca2+处理分别高37.3％和20.4％。分析迷迭香酸合成的两条支路上的关键酶PAL和TAT活性变化发现，两种酶活性亦受外界Ca2+浓度影响，且活性变化先于迷迭香酸的积累，说明这两种酶均参与迷迭香酸的生物合成，但PAL比TAT促进作用更明显。进一步用VP和A23187处理发现，外界Ca2+影响迷迭香酸的合成是通过影响胞内Ca2+浓度实现的，胞外Ca2+内流可能参与了这一过程。

摘要:Wolynes曾经提出，蛋白质的折叠沿着能量降低的方向进行，当达到一个能量的局部最低点，蛋白质就达到了一个相对稳定的状态。有些能量的局部最低点并非生物所需要，这样的能量最低点就成了能量陷阱。Wolynes的能量通道理论和自然选择学说很好地解释了蛋白质在生理状态下的高效折叠，而非掉入能量陷阱。至于存不存在可以逃脱自然选择的能量陷阱，一直没有明确的答案。文章发现HLA-A*2402多肽复合物(pHLA-A*2402)复性后至少存在两种不同的构象，并通过对其与TCR及CD8αα相互作用的研究，发现在pHLA-A*2402中存在两个可以逃脱自然选择的能量陷阱。

摘要:病原菌膜蛋白的原位标记和定位追踪是一项非常繁琐的工作。为了建立一种可以用于快速鉴定膜蛋白、且分辨率达到纳米级别的膜蛋白荧光定位技术，将结核分枝杆菌外膜蛋白OmpA与具有光敏活性的蛋白mEos2m在无致病性的耻垢分枝杆菌中进行融合表达。重组菌固定在载玻片上后，利用405 nm激光激活mEos2m。利用普通荧光体视显微镜、正置荧光显微镜和超分辨率光激活定位显微镜观察OmpA-mEos2m，分析融合蛋白在细菌内的分布情况，并捕获光激活蛋白在细胞膜上释放的光子信号。通过超分辨率光激活定位显微镜，发现OmpA-mEos2m融合蛋白在细胞膜上呈“带”状环绕分布，这是观察到膜蛋白在细胞膜上定位的最直接证据。mEos2m与OmpA融合表达后，并不改变OmpA的膜蛋白属性和定位特征。因此可以将mEos2m用于其他非多聚体膜蛋白的融合和定位研究。可以应用非致病性的耻垢分枝杆菌作为模型，采用高分辨率活菌成像技术，研究致病性的结核分枝杆菌蛋白结构、定位和功能。这是目前为止国内采用光激活定位显微成像技术研究膜蛋白的首次报道。

摘要:为了建立一种核酸酶P1 (Nuclease P1，NP1) 的原核表达纯化系统，首先采用重叠延伸PCR将22段寡核苷酸拼接，获得人工合成的NP1 基因。将其克隆至分泌型表达载体pMAL-p4X获得重组质粒pMAL-p4X-NP1，然后将重组载体转化T7 Express 和Origami B(DE3) 菌株诱导表达，利用Amylose亲和层析柱纯化获得重组蛋白，并对其活性、热稳定性和金属离子依赖性进行系统分析。SDS-PAGE结果显示，重组蛋白MBP-NP1 (Maltose binding protein-NP1) 在T7 Express 和Origami B(DE3) 菌株中均可表达，且以可溶性形式存在。活性检测表明Origami B(DE3) 菌株中获得的重组蛋白活性高于T7 Express菌株 (75.48 U/mg : 51.50?U/mg)；利用蛋白酶Factor Xa切除MBP标签后，两种重组蛋白的比活力均有提高，分别为258.13 U/mg和139.20 U/mg。重组NP1表现出良好的热稳定性，80 ℃ 温浴30 min后重组酶仍具有90％以上的活力。2.0?mmol/L Zn2+对NP1有比较明显的激活作用，相同浓度的Cu2+则对该酶有强烈的抑制作用。该研究实现了NP1在大肠杆菌系统中的功能性表达，为NP1纯酶的制备提供一个替代途径。

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