摘要:

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摘要:锌指蛋白由于锌指结构域序列相对保守，识别DNA序列具有高度特异性，所以成为研究较广泛的DNA结合蛋白，但目前对锌指蛋白的研究多集中在真核细胞，而对微生物锌指蛋白，尤其是原核微生物锌指蛋白的研究相对较少。本文综述了近年来微生物锌指蛋白，尤其是原核微生物锌指蛋白的发现及功能的最新研究进展，以及人工锌指蛋白技术在微生物菌株改造中的应用。特定人工锌指蛋白不仅可调控微生物细胞中多基因控制的复杂性状，例如，耐热性、乙醇和丁醇耐性，渗透胁迫耐受性等，还可以利用锌指结构域构建DNA脚手架系统，进而构建复合酶系统，从而提高催化效率和代谢物产量。目前报道的用于微生物代谢调控的人工锌指蛋白利用的都是哺乳动物的基因，未来根据不同微生物中天然锌指蛋白的序列进行人工锌指的设计，将拓展人工转录因子技术在微生物全局基因表达调控中的应用。

摘要:白藜芦醇合成酶 (Resveratrol synthase, RS) 是白藜芦醇 (Resveratrol, Res) 合成途径中的关键酶。以往研究报道，RS基因已在多种植物和微生物中进行了转化和表达，并在植物的代谢及调控等方面发挥生物学作用。文中主要围绕RS基因对植物的转化，及异源表达后植物体内代谢产物的变化，转RS基因对植物抗病原菌活性、抗自由基活性和生长发育的影响，以及利用RS基因在微生物中生产Res的相关进展进行了综述。并对RS基因在生物工程方面的应用前景进行展望。

摘要:紫杉醇是植物次级代谢产物中一种具有抗癌作用的萜类物质。但由于在自然界中含量低、难获得使其成本昂贵，临床应用受限。近年来，利用组合生物合成技术制备紫杉醇成为研究热点，研究用的体系以大肠杆菌、酵母为主，还涉及到小立碗藓、拟南芥、番茄、人参等植物体系。文中综述了不同体系中紫杉醇的组合生物合成研究进展，分析了目前存在的问题，并对不同体系的发展方向提出建议。最后，结合本实验室对紫杉醇组合生物合成的小立碗藓体系的研究，阐述了其发展前景和优势。

摘要:提高工业酿酒酵母对高浓度代谢产物及原料中的毒性底物等环境胁迫因素的耐受性，对提高工业生产效率具有重要的意义。乙酸是纤维素原料水解产生的主要毒性副产物之一，其对酵母细胞的生长和代谢都具有较强的抑制作用，因此，对酿酒酵母乙酸耐性分子机制的研究可为选育优良菌种提供理论依据。近年来，通过细胞全局基因表达分析和代谢组分析，以及对单基因敲除的所有突变体的表型组研究，对酿酒酵母乙酸耐性的分子机制有了更多新的认识，揭示了很多新的与乙酸毒性适应性反应和乙酸耐性提高相关的基因。综述了近年来酿酒酵母乙酸耐性的基因组规模的研究进展，以及在此基础上构建乙酸耐性提高的工业酵母菌的代谢工程操作。结合本课题组的研究，对金属离子锌在酿酒酵母乙酸耐性中的作用进行了深入分析。未来对酿酒酵母乙酸耐性分子机理的认识及改造将深入到翻译后修饰和合成生物学等新的水平，所获得的认知，将为选育可高效进行纤维素原料生物转化、高效生产生物燃料和生物基化学品的工业酿酒酵母的菌株奠定理论基础。

摘要:采用PCR技术扩增基因IV型HEV (Hepatitis E Virus，HEV) 开放阅读框2 (Open Reading Frame 2，ORF2) 的缺失突变体 (aa384-606)，亚克隆到表达载体后，转化到大肠杆菌中进行诱导表达，表达蛋白命名为rP24。SDS-PAGE和免疫印迹实验表明，rP24获得了高效表达，且和单克隆抗体15B2具有强的反应活性。rP24经过包涵体洗涤、溶解复性、离子交换层析和分子筛层析纯化后，免疫印迹实验表明，纯化rP24能与抗HEV ORF2中和单克隆抗体8C11以及HE (Hepatitis E，HE) 阳性血清发生很强的免疫反应性，说明rP24上具有构象型中和表位，模拟了HEV衣壳蛋白的空间结构。动态光散色测量结果表明，rP24的平均水化半径为7.48 nm；纯化rP24免疫动物实验表明，rP24具有强的抗原性，小鼠阳转周期短，抗体持续时间长；纯化rP24作为包被抗原检测HE阳性血清和阴性血清，结果显示rP24对HE阳性血清和阴性血清检出率与北京万泰公司的抗HEV-IgG检测试剂盒的检出率一致。这些实验结果说明，具有较好免疫反应性和免疫原性的rP24获得了高效表达，该蛋白模拟了天然病毒衣壳蛋白的中和表位，为进一步研究基因I型和基因IV型HEV感染不同宿主细胞差异的分子机制奠定了基础。

摘要:为了制备传染性法氏囊病病毒 (Infectious bursal disease virus, IBDV) DNA微球疫苗，并评价其免疫效果。以丝素蛋白 (Silk fibroin, SF) /壳聚糖 (Chitosan, CS) 为壁材，IBDV的VP2/4/3 DNA疫苗为芯材，通过戊二醛和Na2SO4介导的乳化交联技术，制备出SF/CS复合微球疫苗，然后经肌肉注射14日龄非免疫鸡，2周后加强免疫一次，酶联免疫法 (ELISA) 定期监测鸡血清的IBDV抗体，以研究微球化疫苗的免疫原性。结果显示：戊二醛介导交联方法影响荷载DNA疫苗的活性，而Na2SO4介导的交联方法操作简单且不影响荷载DNA活性；建立了以壳聚糖浓度0.5% (pH 5.0)、丝素蛋白浓度0.6%，质粒DNA 500 μg/mL溶解在2% Na2SO4溶液中的工作条件；SF-CS复合微球DNA疫苗荷载率89.14%，大小1.98 μm，对DNaseⅠ的消化有保护作用。免疫后的抗IBDV血清ELISA抗体的检测显示，微球免疫组总体高于质粒疫苗免疫组(P<0.05)，而且SF/CS复合微球组免疫反应要略高于单纯CS包被的抗原组。研究表明，丝素蛋白/壳聚糖作为微球佐剂能提高IBDV DNA疫苗的临床免疫效果，有很好的应用前景。

摘要:氨基甲酸乙酯是发酵食品中存在的一种致癌物质，酶法去除发酵食品中的氨基甲酸乙酯是消除氨基甲酸乙酯危害的一种重要方法。从小鼠的胃部获得了一株产氨基甲酸乙酯水解酶的肺炎克雷伯氏菌，为了解该氨基甲酸乙酯水解酶的酶学性质，从肺炎克雷伯氏菌中提取获得氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液，经硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析分离得到氨基甲酸乙酯水解酶纯酶。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE) 分析，估计该酶的分子量约为55 kDa。其水解氨基甲酸乙酯的Km值为74 mmol/L。酶反应的最适温度为55 ℃，最适pH为7.0。乙二胺四乙酸 (EDTA) 和二硫苏糖醇 (DTT) 对该酶有较强的激活作用，而Cu2+和Zn2+则有较强的抑制作用。该酶可耐受高浓度NaCl，对低浓度乙醇也有一定的耐受性，对于酱油中氨基甲酸乙酯的消除有一定的参考意义。

摘要:近年来微生物腈水解酶水解腈类化合物制备有机酸已逐步受到关注。本研究分离到一株表现出较高腈水解酶活力的细菌菌株，通过形态学、生理生化实验以及16S rRNA基因序列分析将其鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC3830。结合单因素及响应面法对该菌株产腈水解酶的发酵条件进行了优化，获得最适培养条件为：甘油13.54 g/L，胰蛋白胨11.59 g/L，酵母粉5.21 g/L，KH2PO4 1 g/L，NaCl 1 g/L，脲1 g/L，初始pH 6.0及培养温度30 ℃。通过优化，酶活由2.02 U/mL提升至36.12 U/mL。对该菌株底物特异性的考察结果表明，恶臭假单胞菌腈水解酶对芳香族腈类化合物具有较高的水解活力。将其应用于烟酸的生物合成中，2 mg/mL游离细胞能90 min内将20.8 g/L 3-氰基吡啶彻底转化，制备得到相应烟酸。这些结果表明恶臭假单胞菌P. putida CGMCC3830在烟酸的规模化生产中具有一定的应用潜力。

摘要:为在毕赤酵母中表达来源于米曲霉Aspergillus oryzae的A型阿魏酸酯酶并研究其水解功能，探讨大孔树脂对其水解产物阿魏酸的纯化条件及纯化效果，以米曲霉A. oryzae CICC 40186总RNA为模板，通过RT-PCR技术克隆出了米曲霉阿魏酸酯酶A (AorFaeA) 成熟肽的编码基因AorfaeA，并借助pPIC9K质粒实现了其在毕赤酵母GS115中的异源表达。SDS-PAGE分析结果显示纯化后的重组阿魏酸酯酶 (reAorFaeA) 为单一条带，其表观分子质量约39.0 kDa。以阿魏酸甲酯为底物，经高效液相色谱法测得该酶的最高酶活为58.35 U/mg。利用reAorFaeA和木聚糖酶复合酶水解去淀粉麦麸制备阿魏酸，用大孔树脂纯化小麦麸皮阿魏酸粗提液，所测树脂中HPD-300型大孔树脂的吸附量和解吸率较高，以50%的乙醇为洗脱液，当流速为1.0 mL/min时洗脱效果较好。在该纯化条件下，阿魏酸的回收率为92%，质量分数由原材料中的0.13％富集提高到10.55%。这些研究为阿魏酸的酶法“绿色生产”及应用奠定了坚实的理论基础。

摘要:缺氧条件下嗜乙酰乙酸棒杆菌Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870生长停滞，却能够代谢葡萄糖产生以乳酸和琥珀酸为主的有机酸。采用以sacB基因为反向筛选标记的同源重组染色体基因敲除系统，敲除嗜乙酰乙酸棒杆菌的乳酸脱氢酶基因，得到的Δldh菌株CCTCC NO. M20122041在缺氧条件下不产乳酸，葡萄糖消耗速率降低了29.3%，产琥珀酸和乙酸浓度分别提高45.6%和182%；NADH/NAD+值小于1 (约0.7)；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和乙酸激酶的比酶活分别提高84%和12倍。说明嗜乙酰乙酸棒杆菌中乳酸合成途径的阻断驱使了琥珀酸和乙酸代谢途径加强，推测加强NADH供给和阻断乙酸产生支路可能是提高C. acetoacidophilum菌株产琥珀酸产量的有效途径。

摘要:为了解析胆盐水解酶催化中心中关键氨基酸位点与其底物特异性的关系，以大肠杆菌pET-20b(+)表达系统为分子改造平台，采用理性设计，结合氨基酸定点突变的方法，成功构建了唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius胆盐水解酶BSH1的7种突变体。通过对比L. salivarius BSH1及其突变体对6种结合胆盐的底物特异性表明，7种突变体对不同的结合胆盐的水解活性有所改变。结果说明，Cys2和Thr264分别是BSH1催化TCA和GCA的关键残基，且对酶的催化活性的保持具有关键作用。其中，高保守性的氨基酸位点Cys2不是BSH1唯一的活性位点，而其他突变的氨基酸位点可能作为BSH1的结合位点参与了底物的结合，也可能影响了底物进入BSH1活性中心的通道或底物结合口袋的体积与形状，进而影响了BSH1对不同结合胆盐的水解活性。

摘要:从青岛潮间带的海水中分离得到的红细菌科细菌Lentibacter algarum的发酵液中提取胞外多糖，对其进行离子交换色谱分离纯化，得到水洗和0.1、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液4个洗脱组分。对含量最高的0.1 mol/L NaCl 洗脱组分La0.1进行进一步的凝胶排阻柱层析纯化，得到组分La0.1-1。通过化学测定和高效液相色谱 (HPLC)、高效凝胶渗透色谱法 (HPGPC) 等分析方法对其理化性质、分子量、单糖组成、连接方式及初步结构进行研究。结果表明，La0.1-1总糖含量为66%，平均分子量为12.0 kDa。其单糖组成主要为半乳糖、甘露糖和氨基葡萄糖，比例为Gal：Man：GlcN=1.35:1.1:1.0。对La0.1-1进行气相色谱质谱联用 (GC-MS) 和一维核磁 (1-D NMR) 分析结果显示，La0.1-1的连接方式是以β构型为主，主要存在→2)-Manp(1→，→3)-Galp(1→连接，还存在少量的→4)-Galp(1→和→4)-Manp(1→等连接方式，表明该多糖以直链为主，还存在一定的分支，分支发生在→2)-Manp(1→的O-6位和→3)-Galp(1→的O-4或O-6位。氨基葡萄糖主要为→4)GlcN(1→和末端连接方式。核磁分析还显示La0.1-1存在一定的乙酰基取代，初步判断主要取代在氨基葡萄糖的N-2位上，也可能存在于甘露糖和半乳糖上。本研究是首次对Lentibacter属细菌的胞外多糖进行测定，获得了结构较为新颖的胞外多糖资源，为开发海洋多糖资源提供物质基础。

摘要:为获得稳定来源并且具有生物学活性的重组金针菇免疫调节蛋白 (Fip-fve)，将fip-fve基因转至毕赤酵母GS115中进行诱导型和组成型表达。用PCR方法从金针菇子实体基因组DNA中扩增fip-fve基因，连接至pPIC9构建诱导型表达载体pPIC9-FIP-fve，从毕赤酵母基因组DNA中扩增三磷酸甘油醛脱氢酶启动子 (pgap)，替换pPIC9-FIP-fve上乙醇氧化酶启动子 (paox1) 构建组成型表达载体pPIC9-PGAP-FIP-fve。将线性化的两种表达载体用PEG法转化毕赤酵母GS115，经组氨酸缺失培养基筛选和酵母菌落PCR鉴定后进行表达。结果表明，重组Fip-fve在以甲醇 (1%，V/V) 为碳源进行诱导型表达4 d达到最高，粗蛋白表达量为158.2 mg/L，在以葡萄糖 (10%) 和甘油 (1%，V/V) 为碳源进行组成型分别在表达第4天和第5天达到最高，粗蛋白分别为46.3 mg/L和29.5 mg/L。SDS-GAGE及Western blotting证明重组Fip-fve已正确表达，血细胞凝集活性检测初步证明重组Fip-fve具有良好生物学活性。

摘要:采用遗传转化技术获得了整合有拟南芥AtELHYPRP2 (EARLI1-LIKE HYBRID PROLINE-RICH PROTEIN 2, AT4G12500) 基因的转基因烟草株系，研究了该基因编码蛋白对真菌病原体赤霉菌的抗性及其亚细胞定位特征。以拟南芥Col-0生态型基因组DNA为模板，通过聚合酶链反应扩增AtELHYPRP2基因编码序列，经限制性酶切后连接至pCAMBIA1302载体，构建产生pCAMBIA1302-AtELHYPRP2-GFP融合表达载体。进一步采用农杆菌LBA4404转化烟草叶片外植体，筛选得到转基因烟草植株。RT-PCR、Western blotting印迹分析结果显示，AtELHYPRP2基因在转化体中可以有效表达。激光共聚焦显微观察发现AtELHYPRP2-GFP融合蛋白产生的绿色荧光与碘化丙啶染色后产生的红色荧光能够重合，说明AtELHYPRP2蛋白定位于细胞表面。真菌侵染实验结果显示，组成性表达AtELHYPRP2基因能够增强烟草对赤霉菌的抗性，被侵染部位有明显的H2O2积累。转基因烟草植株中PR1基因的本底表达水平比野生型高，PR1和PR5基因的系统表达水平比野生型高，说明AtELHYPRP2基因可能在SAR反应中具有一定的作用。

摘要:驱动蛋白是一类利用水解ATP为ADP和磷酸的过程中释放的能量沿微管系统运动的蛋白。为了研究ATP中储存的化学能是如何转化为驱动蛋白的机械动能，鼠脑驱动蛋白的相关N-端区域在BL21-Codon Plus(DE3)-RP感受态大肠杆菌细胞中大量地表达。通过SP-强阳离子交换色谱和分子筛色谱的两步骤纯化，蛋白最终产量高达10 mg/L细胞培养液，蛋白纯度可以达到95%以上。纯化的蛋白具有水解ATP酶的活力，并与驱动蛋白抗体有特异性的反应。驱动蛋白可以在如下条件结晶：1.7 mol/L (NH4)2SO4, 500 mmol/L NaCl, 20% glycerol。晶体衍射的分辨率可以达到2.0 ?。

摘要:探讨从孕中期羊水中分离出人羊水祖细胞的有效方法和FIX基因修饰后的效果，为血友病B的产前治疗提供可行的基础。从镜下分离出呈致密克隆生长的梭形细胞集落，经培养传代后，通过第3代慢病毒载体将hFIX导入该细胞，经酶联免疫反应(ELISA)等方法检测hFIX的表达并检测凝血活性。用这种方法得到的羊水祖细胞呈成纤维细胞样，倍增时间为39.05 h，该细胞在不仅在蛋白水平表达干细胞表面分子SSEA4，TRA1-60，在基因水平还可检测到NANOG，OCT4，SOX2mRNA的表达。羊水祖细胞导入hFIX cDNA后，能合成并分泌hFIX蛋白，传代后48 h在上清液中的浓度为20.37%±2.77%，凝血活性16.42%±1.78%。上清液中的浓度在第4天达到平台期，为50.35%±5.42%，凝血活性可达45.34%±4.67%。ELISA检测显示转染后的羊水细胞表达的hFIX蛋白的水平呈现基本稳定趋势，波动幅度较小；同时检测FIX凝血活性也与蛋白浓度呈正相关。从羊水中可以分离得到具有多能性祖细胞，转染了hFIX的羊水祖细胞在体外能持续合成有凝血功能的hFIX蛋白，为血友病B产前治疗的新方法提供了实验依据。

摘要:用分子对接方法预测天然植物化学物质与受体蛋白的相互作用位点并探究作用机制。利用MVD (Molecular Virtual Docker 5.5) 软件，以HER-2激酶区为受体模板建立活性位点，与12种花青素成分进行分子对接。结果表明12种化合物均能在同一活性腔中与HER-2激酶区对接 (MolDock Score: 苷元<–105 kJ/mol, 单葡糖苷<–130 kJ/mol)，主要作用力是疏水作用和氢键；该活性腔也是ATP与HER-2激酶区的结合 (MolDock Score= –161 kJ/mol) 位点，花青素的结合可能会干扰ATP与HER-2之间氢键的形成。提示花青素可能以竞争性结合方式阻碍ATP与HER-2的结合，抑制HER-2磷酸化激活及下游信号通路的激活，从而发挥抑癌活性。

摘要:建立马铃薯纺锤块茎类病毒属 (Pospiviroid) 类病毒有效的芯片筛查技术，对该属类病毒进行筛查。分析了该属类病毒序列，得到19条具有属级鉴定特征的探针。这些探针符合GC含量在40%与60%之间、单个核苷酸含量不大于50%、无多于4个核苷酸的连续重复及不形成多于6个核苷酸的发卡结构的标准；将探针点制到玻璃片基上制备芯片。芯片探针有效性实验结果表明，菊花矮化类病毒 (Chrysanthemum stunt viroid, CSVd) 及番茄雄性株类病毒 (Tomato planta macho viroid, TPMVd) 样品杂交可获得有效信号；灵敏度实验结果表明，该芯片可检测到200 pg/μL的总RNA。该芯片可用于Pospiviroid类病毒的筛查。

摘要:锰过氧化物酶 (MnP) 在环保领域有着广阔的应用前景。目前，利用廉价基质生产MnP，尤其是利用工农业废弃物生产MnP的研究受到了国内外学者的广泛关注。本实验利用响应面方法从几种不同的农业废弃物中筛选裂褶菌F17 (Schizophyllum sp. F17) 产MnP的固态发酵基质。结果表明，以0.52∶0.15∶0.33的比例组成的松木屑、稻草和黄豆粉的混合基质为发酵产MnP的最佳基质，发酵第6天MnP的活力最高，达到11.18 U/g。因此，利用农业废弃物固态发酵产锰过氧化物酶在减低酶的成本和环境污染物治理方面具有重要的意义。