摘要:工业生物过程技术是支撑我国生物制造产业升级的重要研究领域之一，是实现生命科学与生命技术研究成果产业化的重要技术保障。为促进我国相关科研工作者与工业生物技术产业界之间的交流，促进技术成果转化，秉承学会对科学研究推动产业化发展的指导思想，中国微生物学会生化过程模型化与控制专业委员会先后组织两届“工业生物过程研讨会”，就工业生物过程前沿和关键技术开展学术研讨，并设立企业专场充分凸显工业生物过程研究的产业导向性，促进科研成果产业化。会议受到国内相关科研院所、企事业单位的积极参与和投稿，本专刊即是在会议优秀论文基础上，通过征集组织出版了“工业生物过程技术前沿专刊”。本期专刊包括综述和研究论文两部分，内容主要涉及与工业生物过程密切相关的高效生产菌种构建与筛选方法、工业酶制剂性能优化与改造、生物过程模型化及高效优化放大方法等几个方面的研究。

摘要:甲烷氧化菌中的甲烷单加氧酶能够在生理条件下选择性地以甲烷和氧气为底物生成甲醇，麻省理工学院的Lippard教授称它为“神奇的生物分子机器”。本文重点对生物分子机器甲烷单加氧酶的结构、编码基因及调控机制、催化反应机理等进行了综述，此外也简要介绍了甲烷单加氧酶的产生菌甲烷氧化菌的研究历史及分类。生物分子机器甲烷单加氧酶可催化甲烷氧化成甲醇，不仅为甲醇的生产提供了一种新颖的生产方法，而且对生物分子机器的设计也有借鉴意义。

摘要:转录激活因子样效应物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases, TALENs)，是一种将最初发现于植物病原菌的TALEs蛋白 (Transcription activator-like effectors, TALEs) 同限制性核酸内切酶的切割结构域 (例如FokⅠ) 融合而成的人工酶。TALENs的特异性取决于数量可变的串联重复单元，这也是TALEs特异性识别DNA的功能结构单元。理论上，人工构建的TALENs可以特异性识别任意DNA位点并使之断裂，进行基因敲除、插入或修饰。TALENs技术发展至今已经在多层次、多物种中获得成功。本文总结了TALENs技术的研究进展，及其与ZFNs、CRISPR/Cas等技术相较的优劣之处。TALENs在工业微生物育种领域具有特殊的应用优势，其载体构建便利、靶向精准、编辑效率高，以及拥有良好的生物安全性，具备推广应用的前景。

摘要:红霉素为代表的聚酮类化合物已经成功的在大肠杆菌中实现了异源合成，但其产量仍然较低 (仅 ~10 mg/L)。本研究基于大肠杆菌全基因组代谢模型iAF1260，利用通量平衡分析预测了红霉素母核6-脱氧红霉内酯 (6-Deoxyerythronolide B, 6-dEB) 生物合成的关键靶点，通过合成调控RNA技术 (Synthetic small regulatory RNAs, sRNAs) 对预测的靶点进行验证。结果表明，以弱化lsrC (编码LsrABC转运蛋白) 和ackA (编码乙酸激酶蛋白) 为代表的关键靶点改造可以显著提高6-dEB异源合成，提高幅度可达48.7%。通过弱化靶点的组合，进一步改善了6-dEB的异源合成，产量最终可达22.8 mg/L，比出发菌株产量提高59.9%。本研究发现和确认了6个有效的调控靶点，最终成功地改善了6-dEB在大肠杆菌中的异源合成。研究表明，通量分布比较分析结合sRNAs技术是一种有效的方法提高6-dEB异源合成，也为改善其他代谢产物的异源合成提供了可供借鉴的研究思路。

摘要:目前鼠李糖脂生物表面活性剂主要由条件致病的铜绿假单胞菌生产获得，从而影响工业应用。为了开发一种相对安全的鼠李糖脂生产菌，将带有不同强度组成型合成启动子的鼠李糖基转移酶基因 (rhamnosyltransferase gene, rhlAB) 以单、中、高3种拷贝数分别在大肠杆菌ATCC 8739中异源表达，实现了不同产量的鼠李糖脂异源合成。对rhlAB基因和rhaBDAC基因簇 (TDP-L-鼠李糖合成的基因簇) 进一步利用合成启动子进行组合调控，筛选获得了最优生产鼠李糖脂工程菌——大肠杆菌TIB-RAB226。对大肠杆菌TIB-RAB226进行发酵温度优化，鼠李糖脂产量达到124.3 mg/L，是优化前的1.17倍。通过分批补料发酵，12 h时鼠李糖脂产量达到209.2 mg/L。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析，共检出相对含量变化的5类质核比不同的鼠李糖脂同系物。本研究可为异源合成产鼠李糖脂提供重要参考。

摘要:建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法及T-DNA突变库，高效筛选聚苹果酸高产菌株及功能基因。通过含潮霉素和草铵磷抗性基因的农杆菌转化出芽短梗霉，抗性压力筛选及PCR验证建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法，结合发酵液pH与聚苹果酸含量响应变化，微孔板高效筛选高产聚苹果酸的T-DNA插入突变株，基因组步移确定T-DNA插入位点及功能基因。结果获得遗传稳定的抗性基因菌株，每107个细胞可获得80?120个转化子，出芽短梗霉H27 号T-DNA突变株聚苹果酸摇瓶发酵产量提高24.5%，基因组步移证实糖酵解途径磷酸甘油酸变位酶基因被破坏。成功建立了根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法和T-DNA插入突变库，结合高效筛选方法为聚苹果酸合成功能基因挖掘及高产机制解析奠定基础。

摘要:异戊二烯是橡胶合成的重要前体物质。为了提高菌株的异戊二烯产量，本实验室在研究中构建了一株异戊二烯产气的菌株BW-01，基于蛋白质预算理论的指导，理性设计通过改变质粒拷贝数、增加稀有密码子等合成生物学手段调控关键限速酶编码基因表达，从而提高大肠杆菌外源MVA代谢途径的异戊二烯产量。摇瓶发酵实验中我们构建的新产气菌株BW-07比原有的产气菌株BW-01的产量提高了73%，达到了761.1 mg/L。为后续菌株改造及进行发酵罐实验奠定了基础。

摘要:阿尼芬净是一种新型的抗真菌药物，能够抑制各种致病念珠菌在活体内外的活性。棘白菌素B (Echinocandin B，ECB) 是合成阿尼芬净的关键前体，其发酵单位的高低直接关系到阿尼芬净的价格及市场前景。文中考察了巢曲霉在摇瓶发酵生产ECB的过程中，添加滑石粉、Al2O3、玻璃珠等微粒对其发酵单位的影响。发现微粒的粒径和添加浓度是菌体形态和ECB产量的关键影响因素，添加20 g/L滑石粉 (d50 = 14.2 μm) 和7颗玻璃珠 (d = 6 mm) 可使ECB发酵产量分别比对照提高33.2%和41.7%，达到1 262.9 mg/L和1 344.1 mg/L。结果表明微粒的添加可以显著地改善丝状微生物发酵过程中的菌丝形态，提高其产物的发酵产量，为丝状微生物发酵过程的优化提供了一种重要手段。

摘要:利用碳限制恒化实验研究了黑曲霉生长和糖化酶生产之间的相关性，结果表明当比生长速率低于0.068 h–1时，菌体生长与产酶是相关的，当比生长速率大于0.068 h–1时，菌体生长与产酶不相关。根据恒化实验结果获得黑曲霉葡萄糖底物消耗的Monod动力学模型，并结合葡萄糖和氧消耗的Herbert-Pirt方程和产物形成的Luedeking-Piret方程构建黑曲霉产糖化酶的黑箱模型。应用该模型设计指数补料分批发酵实验控制菌体比生长速率在0.05 h–1，使糖化酶的得率最高达到0.127 g糖化酶/g葡萄糖，并成功地使用模型描述了黑曲霉产糖化酶的发酵过程。实验值和模拟值进行比较表现出很好的适用性，表明黑箱模型可以用于指导黑曲霉产糖化酶发酵过程的设计和优化。

摘要:搅拌桨是高好氧高黏度微生物发酵实现高效反应必不可少的因素之一，不同搅拌桨组合对发酵过程的影响十分重要。威兰胶是由产碱杆菌在高耗氧高粘度发酵体系下合成的胞外微生物多糖，广泛应用于水泥、石油、油墨、食品等行业中。本研究借助于计算流体力学 (Computational fluid dynamics，CFD) 的方法，以威兰胶发酵液体系为研究体系，研究了6种不同搅拌桨组合在反应器内流体速率分布、剪切速率、和气含率等参数。将模拟效果较好的3种组合用于威兰胶发酵过程。研究表明MB-4-6搅拌桨组合对改善发酵罐内部的溶氧及流场分布效果最明显，威兰胶产量水平提高了13%。同时在该组合下威兰胶的产品粘度得到有效提高。

摘要:辅酶NAD(H) 相比NADP(H) 有稳定性好、价格低廉及更广的辅酶循环方法等优势，因此在实际应用中常需将NADP(H) 赖型的脱氢酶改造成为NAD(H) 依赖型的。来源于嗜热共生杆菌Symbiobacterium thermophilum的NADP(H) 依赖型内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶 (meso-2,6-diaminopimelate dehydrogenase, StDAPDH) 及其突变体酶是催化还原氨化合成D-氨基酸的优良催化剂，本研究试图改变其辅酶偏好性，增强其应用优势。对其晶体结构分析可知，氨基酸残基Y76距离腺嘌呤较近，R35及R36和辅酶上磷酸基团有直接相互作用。依氨基酸侧链基团性质对Y76进行了定点突变，发现不同突变子对两种辅酶的偏好性都发生了变化；对与磷酸基团直接作用的R35、R36进行的双突变R35S/R36V，导致酶对NADP+的催化活力降低；将R35S/R36V和部分Y76突变进行了组合，发现三突变组合以NAD+为辅酶时的活力均大于以NADP+为辅酶的活力，实现了辅酶偏好性转变。这些研究工作为进一步实现StDAPDH的辅酶偏好性完全转变提供依据。

摘要:为了提高Escherichia coli重组表达的β-葡萄糖醛酸苷酶 (PGUS-E) 的键选择性，本研究以PGUS-E结构与功能关系的推测为指导，选择了可能影响PGUS-E的键选择性的R329、T369、N467位点进行定点饱和突变，利用薄层层析 (TLC) 和高效液相色谱 (HPLC) 对键选择进行筛选，得到优势突变酶R329K、T369V。结果显示：与PGUS-E酶相比，突变酶R329K、T369V键选择性分别提高26.9%、34.3%。突变酶的酶学性质研究表明，突变酶的最适pH和温度与PGUS-E一致，但其酶催化效率下降。由此可见，R329、T369对酶催化的键选择性和酶的活性有显著影响。综上结果，本文应用饱和突变方法改善了PGUS-E 的键选择性，为酶的结构和功能关系理解提供了实验依据。

摘要:我国大多数陆上主力油田已进入“双高” (高含水、高采出程度) 开采阶段。为进一步提高聚合物驱后油藏的石油采收率，本研究发现了一种促进油藏内源微生物生长代谢的高效激活剂，且该激活剂已通过室内产气和物理模拟驱油实验及岩心电镜观察和454 (Pyrosequencing) 焦磷酸测序方法的评价。结果表明激活剂在高压容器中静置培养60 d后产气增压达到2 MPa，用量0.35 PV，浓度为1.8% (W/W) 的激活剂溶液在聚合物驱后的天然岩心上石油采收率可再提高3%，并在电镜观察到岩心内部激活的内源微生物菌体及其代谢产物。现场于2011年12月在萨南南二区东块的1注4采井组开展了试验，监测到4口有效生产井的甲烷和二氧化碳气体δ13C (PDB) 含量产生明显变化，与萨南南二区东块对照试验区产油量增幅35.9%，含水稳定在94%，在3年半期间阶段累计增油5 957 t，为同类油藏进一步提高石油采收率提供了一条有效途径。

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