摘要:基因的表达在多个层次受到严格的控制，其中转录水平的调控是控制基因表达的重要环节之一。近几年，随着分子生物学研究方法的不断发展，转录调控的研究方法学也出现了新的变化。本文综述了基于作者所在课题组对链霉菌次级代谢调控研究过程中优化和改进的转录调控研究方法，如基于SYBR Gold的凝胶阻滞实验，基于荧光标记和毛细管电泳检测的足迹法，基于报告基因的直接调控关系分析等；同时也对研究调控蛋白和靶启动子相互作用的新方法进行了阐述，如表面等离子共振技术和等温滴定量热测定技术等。这些转录调控研究方法的优化和总结，能够帮助研究者开展相关研究。

摘要:工业微生物在发酵生产过程中会面对发酵环境和自身产生的各类酸性物质，而这些酸性物质会影响工业微生物的生长和代谢，即产生酸胁迫。微生物通过调控胞内质子浓度、保护和修复生物大分子、改变细胞膜组分以及整体水平调控等耐受机制来应对酸胁迫。结合酸胁迫的各种耐受机制，利用自然筛选和人工改造的方法提高工业微生物的抗酸胁迫能力，为构建出更能适应工业生产条件的菌株提供理论依据。

摘要:基因修饰技术是用于基因组定点改造的分子工具，目前主要有锌指核酸酶 (ZFN) 技术、转录激活子样效应物核酸酶 (TALEN) 技术和CRISPR-Cas核酸酶 (CRISPR-Cas) 技术。这些核酸酶都可以在DNA靶位点产生双链断裂 (DSB)，诱发细胞内源性的修复机制，激活体内非同源末端连接 (NHEJ) 或同源重组 (HR) 两种不同的修复机制，从而实现内源基因的敲除或外源基因的定点敲入。近年来，基因修饰技术已成功应用到细菌、酵母、人类细胞、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠、家畜、食蟹猴、拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、小麦和大麦等多种生物，显示了其强大的基因编辑优势。特别是新近出现的CRISPR-Cas9技术，降低了成本，使基因编辑变得简洁、高效和易于操作，得到了很多研究人员的关注。本文系统介绍了以上3种技术的原理及最新研究进展，并对未来的研究和应用做出了展望。

摘要:为了观察神经肽Y (NPY) 和瘦素长型受体 (OB-Rb) 在大熊猫胃肠道的表达分布，并探讨其功能。本实验选用中国保护大熊猫研究中心濒危动物繁殖与保护遗传四川省重点实验室提供的3例大熊猫胃肠组织样品，采用HE和免疫组化SABC法进行组织学、NPY及OB-Rb蛋白的表达研究。HE染色结果显示3例大熊猫胃肠道组织学结构完整，主要表现在单细胞和多细胞黏液腺丰富、小肠绒毛较长，肠道黏膜肌层与肌肉层较厚等。免疫组化方法观察到NPY和OB-Rb阳性产物广泛分布于大熊猫的胃肠道中。NPY阳性神经纤维呈串珠状或点状排列，主要位于黏膜下神经丛和肌间神经丛内，前者阳性神经纤维数量较多。NPY阳性细胞主要分布于黏膜层和肠腺，多呈椭圆形、多边形等。OB-Rb阳性产物主要分布在黏膜层，且在固有层内有大量阳性细胞分布。表明NPY和OB-Rb在大熊猫肠道中的广泛表达，为研究NPY和OB-Rb影响肠道的生长发育、消化吸收、免疫等多种功能奠定了基础。

摘要:b-丙氨酸是一种重要的医药化工原料，目前主要依靠化学法进行生产。探寻更为环保和高效的生物生产法是未来研究的一个方向。L-天冬氨酸a脱羧酶 (PanD) 能特异地脱去L-天冬氨酸的a羧基，生成b-丙氨酸。本文比较了3种分别来源于大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌及枯草芽胞杆菌的PanD比酶活 (分别为0.98、7.52和8.4 U/mg)。后两者的最适pH均为6.5，最适反应温度分别为65 ℃及60 ℃。与目前研究最多的来源于大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的PanD相比，来源于枯草芽胞杆菌的PanD具有更好的活性和热稳定性，具有更强的工业应用潜力。同时，本文对该酶特有的翻译后自剪切及机理性失活现象进行了分析和讨论。

摘要:集胞藻中slr1609是编码脂肪酸激活酶的基因，对与其相关的重要功能伴侣蛋白进行研究，可以完善对脂肪酸合成模块的认识，为进一步通过合成生物学技术改造蓝细菌提供理论支持。本研究在集胞藻PCC 6803中建立了蛋白质复合体分析及鉴定技术：利用氯霉素抗性基因筛选，构建带有3×FLAG 标签的Slr1609突变株，通过RT?PCR优化重组蛋白表达条件；同时对突变株进行了Western blotting鉴定，以及利用Native-PAGE验证了蛋白质复合体的存在。最后，LC-MS/MS质谱鉴定获得了Slr1609蛋白复合体中的可能伴侣蛋白。

摘要:为了建立适合米根霉的遗传转化体系，应用重叠延伸PCR的方法构建了以潮霉素B抗性为选择标记的单交换整合型表达载体pBS-hygro-ldhA；分别采用PEG/CaCl2介导的原生质体转化、原生质体电转化及萌发孢子电转化的方法将表达载体pBS-hygro-ldhA转化入米根霉AS 3.819菌株中，并研究了菌丝酶解时间、孢子萌发时间以及电转化电场强度对于转化效率的影响；通过荧光定量PCR (qPCR) 对米根霉转化子基因组中质粒整合拷贝数进行了检测，并研究了其对米根霉转化子抗性稳定性的影响。实验结果表明成功获得整合了表达载体pBS-hygro-ldhA的米根霉转化子。菌丝酶解140 min产生的原生质体其再生率和转化率最高，原生质体电转化最佳电场强度为13 kV/cm，孢子萌发2.5 h转化率最高，萌发孢子电转化最佳电场强度为14 kV/cm。萌发孢子电转化方法转化率要高于原生质体转化的方法。荧光定量PCR检测结果表明，在一定范围内，高质粒整合拷贝数的米根霉转化子比较稳定。研究建立了用于工业米根霉菌株的遗传转化体系，为米根霉代谢调控研究以及菌种改造工作提供了基础与支持。

摘要:文中分析了葡萄愈伤组织诱导和继代培养的最佳光照强度并探索葡萄愈伤组织褐变的机理。以金手指葡萄的幼嫩茎段为材料，设置0、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000和4 000 Lx等8个光照强度，研究不同光照强度对葡萄愈伤组织的诱导率、褐化率及相关酶活性和基因表达的影响。结果表明，在0、500、1 000和1 500 Lx光照强度处理下，愈伤组织的诱导率均达到92%以上，显著高于其他处理 (P<0.05)，其中1 000和1 500 Lx光照强度处理愈伤组织及其继代培养的生长势良好且褐化程度较轻；绿原酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸和香豆酸与葡萄愈伤组织褐变关系密切，其中绿原酸的含量与褐化程度呈显著正相关 (P<0.05）；POD和PPO酶活性与褐化率呈极显著负相关 (P<0.01)；POD、PPO和PAL酶基因的表达量与褐化率呈显著 (P<0.05) 或极显著 (P<0.01) 正相关。因此，葡萄愈伤组织诱导和继代培养适宜的光照强度为1 000?1 500 Lx，光照强度过高或过低对其正常的生理生长都有较大负面影响。

摘要:AAV-ITR基因表达微载体是只含有腺相关病毒 (Adeno-associated virus, AAV) 倒置末端重复序列 (Inverted terminal repeats, ITR)、基因表达顺式元件和目的基因，而不含有其他外源DNA序列的双链或单链DNA。本研究利用杆状病毒表达系统，制备得到两种重组杆状病毒Bac-ITR-EGFP和Bac-inrep，并将二者的P3代病毒共同感染昆虫细胞Spodoptera frugiperda (Sf9)，抽提小分子量DNA，获得AAV-ITR-EGFP基因表达微载体，2×107的Sf9细胞抽提可以得到100 μg AAV-ITR-EGFP基因表达微载体，核酸电泳显示AAV-ITR-EGFP基因表达微载体主要以单体和二聚体的形式存在。将AAV-ITR-EGFP基因表达微载体通过polyethylenimine (PEI) 转染HEK 293T细胞，24 h后荧光显微镜观察有EGFP表达，48 h后达到高峰，转化效率达到65%。

摘要:考察自制的肽型阳离子脂质体CDO14作为RNA转染载体的细胞毒性及其运载siRNA进行RNA干扰的效果。通过MTT法检测脂质体对稳定表达荧光素酶的肺癌A549 (Luc-A549) 细胞的毒性。以脂质体为载体将荧光素酶siRNA (Luc-siRNA) 转染至Luc-A549细胞内，用发光仪检测转染细胞内荧光素酶含量，BCA法检测细胞内总蛋白含量。在裸鼠腋下接种Luc-A549细胞，成瘤后尾静脉注射Luc-siRNA和脂质体的复合物，利用活体成像系统检测模型小鼠体内荧光素酶的表达量。细胞毒性实验表明，自制脂质体的毒性与商品脂质体DOTAP相近，低于商品脂质体Lipo2000；细胞转染实验表明自制脂质体作为基因转染载体的转染效率高于DOTAP；体内转染实验表明CDO14作为载体转染效果优于DOTAP。结果表明，肽型阳离子脂质体CDO14具有毒性小、转染效率高等优点，有望作为转染载体用于基因治疗。

摘要:Fightless I (FLII) 是一个在肿瘤中高表达的蛋白，前期研究提示FLII可能参与核质转运过程，为鉴定FLII是否与核膜结合蛋白相互作用，构建GST-FLII、GST-LRR融合蛋白重组质粒并转化至大肠杆菌 Rosetta 进行诱导表达，使用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化。通过SDS-PAGE对纯化蛋白进行验证之后，利用GST-pull down及免疫共沉淀技术证明了FLII与Importin β、Nup88蛋白的相互作用，并鉴定FLII上的LRR结构域为相互作用区域。研究结果提示FLII可能参与了Importin β的部分生物学作用，为进一步分析FLII与Importin β、Nup88的生物学功能奠定了基础。

摘要:昆虫抗冻蛋白 (Antifreeze protein，AFP) 的抗冻活性很高，可应用于生物组织和细胞的低温保存。为了在酵母中表达荒漠甲虫小胸鳖甲Microdera punctipennis抗冻蛋白MpAFP698，并确定其在低温下的保护作用，本文通过构建真核表达载体pPIC9K-Mpafp698，转化巴斯德毕赤酵母GS115，诱导表达小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698。利用免疫印迹 (Western blotting) 分析MpAFP698蛋白的特异性表达，结果显示Mpafp698 基因可整合到酵母基因组中并分泌表达，且酵母自身蛋白很少分泌表达。检测抗冻蛋白的低温保护作用，结果发现，小胸鳖甲抗冻蛋白可显著改善冷冻小鼠肝脏等器官的细胞形态，降低血细胞在4 ℃的溶血率，提高SF9细胞冻融后的存活率。本研究表明，小胸鳖甲AFP可以在毕赤酵母中分泌表达，便于纯化，有良好的低温保护效果。

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