摘要:相比其他萜类化合物，丝状真菌来源的二倍半萜化合物数量较少，但具有广泛的生理活性和药用价值。已经发现的丝状真菌二倍半萜合成酶均由萜类环化酶和异戊烯基转移酶两个结构域组成，表现出底物的非特异性和环化方式的多样性。本文重点叙述了丝状真菌来源的二倍半萜化合物以及其合成酶的结构与功能特征，并对丝状真菌二倍半萜化合物及其合成酶研究现状作简要概述。

摘要:DNA中碱基的化学修饰近年来一直是生命科学领域研究的热点之一。DNA甲基化是一种常见的表观遗传现象，它能在不改变DNA序列的前提下改变遗传表型。各种胁迫因素能诱导植物DNA甲基化产生变异，但其应答胁迫机制仍然未知。本文对植物DNA甲基化研究进展进行了综述，结合本课题组的研究结果，对7Li 离子束注入、60CO-γ射线诱变诱导产生的DNA甲基化变异进行了报道，以期为DNA甲基化可能参与涉及植物的表型可塑性提供一定的依据。

摘要:金黄色葡萄球菌核酸酶A (Staphylococcal nuclease A, SNA) 可用于菌蜕制备中宿主菌的进一步灭活及残存遗传物质的去除。关于SNA在去除了信号肽后是否仍能分泌至胞外以及是否需要融合其他氨基酸片段才能在宿主菌胞质中发挥作用尚存争议。为厘清这一争议，分别构建一系列含SNA、SNA与λ噬菌体cro基因或结核杆菌脲酶基因部分序列的融合片段cSNA或uSNA的温控质粒并对其在大肠杆菌内的作用进行评价。结果显示，SNA、cSNA和uSNA的表达产物对大肠杆菌的4 h灭活率分别为99.9%、99.8%和74.2%。升温诱导30 min后，SNA和cSNA即可在宿主菌胞内被检出，而uSNA需1 h；相较之下，SNA和cSNA在培养液上清中的被检出时间要晚1 h，uSNA则晚2 h。对三者的核酸酶活性检测均为：SNA﹥cSNA﹥uSNA，且胞外活性都显著低于胞内。此外，SNA和cSNA在诱导2 h后即将宿主基因组成功降解，而uSNA则在整个实验期间均未能使宿主基因组完全降解。这表明SNA、cSNA和uSNA的表达产物均具有核酸酶活性，可被动释放至胞外，外源DNA片段的融入反而会降低SNA的核酸酶活性。

摘要:为开发新型重组减毒鼠伤寒沙门菌口服活疫苗载体，本研究以pYA3493质粒为基础，用鼠伤寒沙门菌sopENt100基因及其启动子替代原有的Ptrc启动子，构建沙门菌三型分泌表达载体pYA-sopENt100；再将质粒pYA-sopENt100电转入沙门菌ΔcrpΔasdSL1344，构建减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 三型分泌表达系统，研究其生物学特性，进一步将报告基因egfp克隆入sopE基因下游，构建重组菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)，感染Vero细胞，用Western blotting分析该系统递呈外源抗原的能力。PCR、酶切及测序结果表明，减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 三型分泌表达系统构建成功；生物学特性鉴定结果表明，其血清型与亲本株Δcrp SL1344及野生株SL1344保持一致；其生化特性与亲本株基本相近，但与野毒株相比发生明显变化；生长速度也更为缓慢；重组菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 的LD50较野生株SL1344降低了7.0×104倍；Western blotting结果发现，重组菌培养上清中能检测到SopENt100-egfp融合蛋白 (37 kDa)；重组菌株感染Vero细胞后，可以同时检测到SopENt100-egfp融合蛋白 (37 kDa) 和EGFP蛋白 (27 kDa)。以上结果证实，本研究成功构建了新型减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd (pYA-sopENt100) 三型分泌表达系统，其能够有效递呈外源抗原，该重组菌株有潜力作为安全、稳定、高效表达外源基因的口服重组活疫苗载体。

摘要:以葡萄糖氧化酶 (GOx) 为研究对象，系统地研究了钙离子对交联酶聚集体 (CLEA) 粒子尺寸和微观结构的调控作用以及酶催化性能和实用性的影响。研究结果表明，GOx酶沉淀过程中引入钙离子可显著降低CLEA粒子尺寸并导致粒子内纳米孔道结构逐步消失。在0.1 mmol/L钙离子浓度下，GOx酶的CLEA仍保有清晰的纳米孔道结构。以葡萄糖为底物的GOx酶CLEA催化结果显示，该CLEA粒子的酶活性为对照CLEA粒子的2.69倍。即便1.0 mmol/L钙离子浓度下制备的CLEA粒子的GOx酶活性仍高出对照CLEA粒子约 42%。此外，0.1 mmol/L钙离子浓度下制备的CLEA不仅具有更高的底物转化速率和很好的操作稳定性，而且CLEA中GOx酶的最大反应速度显著提高。这些实验结果明确了钙离子对CLEA粒子尺寸和微观结构的调控作用，为制备具有高效生物催化活性的CLEA粒子奠定了基础。

摘要:旨在以非肥胖糖尿病 (Non-obese diabetic, NOD) 小鼠为动物模型，研究高剂量昆虫细胞表达的重组热休克蛋白gp96 (Recombinant gp96, rgp96) 对1型糖尿病 (Type 1 diabetes, T1D) 的预防作用。以高剂量rgp96免疫NOD小鼠，用血糖仪监测小鼠血糖值，用流式细胞术检测小鼠脾脏CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞 (Regulatory T cells, Tregs) 亚群频率，然后用一系列体外实验探究高剂量rgp96对Tregs的影响。结果显示高剂量rgp96免疫有效地预防或延缓小鼠T1D发病，免疫诱导Tregs数量明显增加。体外实验发现rgp96蛋白促进Tregs增殖，诱导Foxp3表达上调和IL-10分泌增加。研究结果为开发基于rgp96的新型T1D预防和治疗性疫苗提供了依据。

摘要:旨在制备抗心肌肌钙蛋白T (cTnT) 的单克隆抗体 (mAb)，对单抗进行初步评价鉴定，并建立 (cTnT) 的化学发光定量检测试剂。首先利用外购的cTnT抗原免疫BALB/c小鼠，利用常规mAb制备技术和间接ELISA法筛选mAb，以表达和合成的cTnT片段对筛选到的 mAb进行表位鉴定。使用双抗体夹心ELISA方法筛选检测cTnT抗原的配对mAb，并建立cTnT全自动化学发光定量检测试剂。使用220例临床标本评价该试剂与罗氏试剂的检测一致性，另外使用238例临床样本和784例体检人群样本评价该试剂的临床应用。我们成功筛选到33株稳定分泌抗cTnT抗体的杂交瘤细胞株，并对单抗的表位进行初步鉴定。我们筛选到能检测10 pg/mL cTnT抗原的配对mAb E16H8和C8G11，并使用该配对研制出全自动化学发光定量试剂。该试剂与罗氏试剂相关系数r达到0.959 9，检测一致率95%，利用该试剂盒检测临床样本灵敏度为97.5%，特异性为99.15%，99%体检人群的cTnT浓度分布小于0.080 6 ng/mL，符合WHO对急性心肌梗死的定义标准。综上，初步建立了cTnT诊断优势表位单抗，并利用这些优势表位的单抗建立全自动管式化学发光定量检测试剂，与罗氏试剂检测结果符合率高。

摘要:为建立高效快捷的蛛丝功能化修饰平台，蛋白质内含子的反式剪接技术被首次应用于重组蛛丝的功能化修饰。在体外通过Ssp DnaB的反式剪接作用，在蛋白质水平上将12 kDa泛素相关修饰蛋白 (SUMO) 与蛛丝蛋白 (W2CT) 连接形成功能化蛛丝蛋白SUMOW2CT。修饰后SUMOW2CT与W2CT均能形成纳米至微米级的丝纤维，但SUMOW2CT自动成丝速度明显下降且产量约为W2CT的一半。与W2CT丝纤维 (W) 相似，SUMOW2CT丝纤维 (UW) 不具有超收缩能力和对2%SDS不耐受，但机械性能低于W2CT丝纤维。功能化蛋白SUMOW2CT形成的丝纤维中SUMO蛋白仍保持着正确三维结构，可被SUMO蛋白酶酶切。外源功能化蛋白质虽在一定程度上降低了丝的形成速度和机械性能，但修饰上的功能化蛋白仍保持着生物活性，表明断裂蛋白质内含子介导的蛛丝修饰平台成功建立，也为蛛丝的功能化修饰和应用奠定了坚实的技术基础。

摘要:为了获得足够多纯度高且有活性的肝靶向肽-人内皮抑制素融合蛋白（HTP-rES），首先研究了BL21/pET21b-HTP-rES重组菌株的生长曲线和最佳诱导时机；单因素分析不同pH值、不同诱导时间、不同诱导剂浓度、不同诱导温度时融合蛋白表达量；通过包涵体洗涤、复性、纯化，以获得高纯度的肝靶向肽-人内皮抑制素融合蛋白；最后采用流式细胞仪和MTT对融合蛋白进行活性鉴定。结果表明，BL21/pET21b-HTP-rES重组菌株在1.5–3.5 h处于对数生长期，培养基pH 8.0、IPTG终浓度0.06 mmol/L、42 ℃、诱导表达5 h为最佳表达条件。包涵体洗涤后纯度达60%，经复性、纯化后获得的目的蛋白纯度达到95%以上，对人肝癌细胞具有靶向性，能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖。研究确立了融合蛋白最佳表达条件以及复性、纯化条件，为进一步研究其生物学活性及药物开发奠定基础。

摘要:为了以细菌胞外蛋白酶酶解低值蛋白资源制备抗氧化活性肽以及挖掘新型蛋白酶，采用液体发酵培养的方法对假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp. SHK1-2进行发酵产酶，获得胞外蛋白酶粗酶液用于酶解热水法提取的鲮鱼胶原蛋白，通过超滤、sephadex LH-20分子筛层析获得具有DPPH自由基清除能力 (35.6%±7%)、氧自由基清除能力 (Oxygen radical absorbance capacity，ORAC) 及DNA氧化损伤抑制活性的小分子肽，液相色谱质谱联用鉴定该活性肽分子量为776.2 Da，预测氨基酸序列为Thr-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Thr-His。ORAC检测验证了人工合成的多肽同样具有抗氧化活性。研究表明细菌胞外蛋白酶在低值资源高值化中具有一定的应用前景，对于新型蛋白酶及其应用的挖掘具有一定的参考意义。

摘要:轴周蛋白 (Periaxin) 是外周神经系统非致密性髓鞘中特异表达的蛋白，编码Periaxin的基因经由选择性剪接产生两种蛋白异构体L-periaxin和S-periaxin，对髓鞘形成的初始化有重要作用。至今在Periaxin 基因上已发现有18种不同的位点突变导致外周脱髓鞘神经疾病腓骨肌萎缩症4F亚型 (CMT4F) 的发生。利用转录激活因子样效应物核酸酶 (TALENs) 靶向基因敲除技术对大鼠RSC96细胞的periaxin基因进行敲除，根据TALENs设计原则，确定L-periaxin基因的敲除靶点在其编码NLS结构域部分，设计相应的TALEN左臂与右臂的识别序列，构建含上述识别序列的L-periaxin基因敲除载体TALEN-L和TALEN-R，并将其转入RSC96细胞，经嘌呤霉素药物筛选，获得L-periaxin基因敲除细胞株，经测序确认大鼠RSC96细胞中的基因组中L-periaxin基因区段已被敲除，成功构建了L-periaxin基因敲除细胞模型。计算L-periaxin基因敲除载体的突变率为21.6%。Western blotting 实验证明，在RSC96细胞中只能检测到S-periaxin蛋白的表达。通过流式细胞术及MTT实验检测基因敲除细胞的细胞周期和生长速度，发现敲除L-periaxin基因的细胞生长速度缓慢，G1期细胞增多，S期细胞减少。

摘要:构建了共表达ATP再生和L-茶氨酸合成酶的重组大肠杆菌菌株，并将其应用于L-茶氨酸的合成中。合成磷酸激酶 (PPK) 和γ-谷氨酰甲胺合成酶 (GMAS) 基因序列，分别利用pETDuet-1和pET-21a(+) 载体，构建共表达重组质粒pETDuet-ppk+gmas和pET21a-ppk+gmas。将上述两种重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3) 中，获得重组菌株TPG和APG。IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果表明，PPK和GMAS在两种重组菌中均可溶性表达。当用于催化L-茶氨酸合成时，来自APG的GMAS-PPK要优于TPG。利用APG所产的酶进行L-茶氨酸合成，在37 ℃、pH 7.0条件下，使用催化量ATP可实现L-茶氨酸的摩尔产率为86.0%。该结果一方面扩展了酶法ATP再生系统的应用，另一方面为生物催化合成L-茶氨酸提供了一种有效方法。

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