摘要:真菌病害严重威胁作物的产量和品质，给国家和人民造成巨大的经济损失。尤其是引起维管束病害的土传真菌，化学农药的作用效果很不理想。利用抗性基因进行遗传育种是目前生物防治的重要手段之一，但对于缺乏抗性资源的物种，面对强大的土壤真菌病害，研究者也时常束手无策。近年来，利用RNA干扰技术发展而来的宿主诱导的基因沉默 (Host induced gene silencing，HIGS) 策略，在抗病虫害领域逐渐崭露头角，但由于真菌侵染的复杂多样性及土壤传播的特性，HIGS在土壤真菌病害中的应用充满神秘和挑战。本研究室近期揭示了棉花黄萎病 (一种严重的土壤真菌病害) 的“罪魁祸首”——大丽轮枝菌的侵染结构和侵染过程；并首次证明了宿主植物内源小RNA能够跨界进入病原菌细胞中降解致病基因表达的抗病作用；在此基础上，本研究室利用HIGS在棉花上获得了对黄萎病抗性较高的品系，成功地开辟了抗土壤黄萎真菌病害的新天地，研究结果显示出基因沉默技术在这一领域强大的应用潜力和前景。

摘要:数字PCR是继实时定量PCR之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。通过将单个DNA分子转移入独立的反应室，PCR扩增反应后，对荧光信号进行检测分析，实现单分子的绝对定量。数字PCR技术摆脱了对标准曲线的依赖，具有更高灵敏度和准确度，在基因突变检测、拷贝数变异检测、微生物检测、转基因食品检测以及下一代测序等方面均得到广泛应用。本文介绍数字PCR技术的定量方法，并评述该技术在主要应用领域的研究进展。

摘要:植物内生菌作为一种新型的微生物资源，分离和确定其代谢产物是一条寻找新型天然活性物质的重要途径。目前为止，许多研究者从不同的植物内生菌中分离到大量具有抗菌活性的新化合物，这些新的化合物被认为是解决日益严重的微生物多重耐药性的希望之一。本文从植物内生菌的多样性、抗菌活性物质多样性及国内内生菌研究进展等多个角度概述了当前有关植物内生菌研究的主要成果和最新进展，以期为植物内生菌相关研究提供借鉴。

摘要:乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus，HBV) 感染是引发乙型肝炎的病因，慢性化程度较高，后期可诱发肝硬化甚至肝癌。IL28B基因属于新型干扰素λ家族，已有研究报道其遗传多态性与HBV感染者的治疗效果和病毒自然清除率具有相关性。通过探讨IL28B 基因遗传易感性与HBV感染、患者治疗应答和病毒清除的关系，可以进一步了解宿主基因多态性在HBV感染治疗和病毒自然清除中的作用机制，为乙肝患者个体化医疗提供一定的理论基础。

摘要:秋茄Kandelia obovata Sheue, Liu & Yong是分布于热带、亚热带海岸带与河口潮间带的常绿红树植物，在海岸生态系统中具有重要的功能和价值。文中综述了近年来国内外关于秋茄分子生物学方面的研究进展，主要包括基于分子标记的秋茄亲缘地理关系与遗传多样性研究，基于双向电泳技术的蛋白质组学研究，以及逆境胁迫响应基因的克隆与功能验证研究；最后还结合当前研究现状展望了秋茄分子生物学未来研究工作的方向。

摘要:猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 是引起猪 (特别是新生仔猪) 急性、高度传染性消化道疾病的主要病原之一；2010年底以来，猪流行性腹泻 (PED) 的再次暴发给我国乃至全球养猪业造成了巨大经济损失。最近，研究者已先后建立了基于靶向RNA重组技术、细菌人工染色体 (BAC) 载体系统和体外连接技术的PEDV反向遗传学操作技术，为PEDV编码的蛋白质的功能、致病机制以及新型疫苗的研发开辟了新的思路。本文对PEDV反向遗传操作技术的研究进展及其在PEDV胰酶依赖性、S蛋白和ORF3蛋白的功能以及新一代疫苗研制等方面的应用现状进行了综述与展望。

摘要:验证基于革兰氏阳性增强基质 (Gram-positive enhancer matrix，GEM) 展示口蹄疫病毒细菌样颗粒 (Bacteria-like particles，BLP) 疫苗的可行性。按照大肠杆菌偏好性密码子优化合成基于猪口蹄疫病毒Mya98株序列的3种抗原基因设计，并将其插入到含有锚钩蛋白基因的原核表达载体pQZ-PA，鉴定阳性后转入Escherichia coli BL21，进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因表达及产物的可溶性进行分析。利用GEM颗粒纯化目的蛋白，制备细菌样颗粒疫苗抗原；利用BCA试剂盒测定重组蛋白的浓度，将重组蛋白与白油佐剂乳化，制备疫苗，免疫5周龄小鼠，同时设商品化多肽苗对照与空白对照，免疫后不同时间采集试验小鼠血清，利用口蹄疫病毒多肽ELISA抗体检测试剂盒和O型口蹄疫抗体液相阻断酶联免疫(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 检测试剂盒检测免疫小鼠血清的抗体水平；利用噻唑蓝比色法(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT) 测定淋巴细胞增殖情况；利用荧光定量PCR方法检测相关细胞因子表达，评价细胞免疫水平。SDS-PAGE结果表明，设计在大肠杆菌中的3种口蹄疫病毒抗原基因均以可溶形式获得高效表达；Western blotting结果显示，表达的重组蛋白能够与口蹄疫病毒阳性血清发生反应，利用GEM颗粒能够实现重组蛋白的一步离心纯化，制备BLP疫苗抗原；免疫试验结果表明，设计的重组抗原B (T1BT2) 4B不但能够刺激免疫小鼠产生更高水平的多肽特异性ELISA抗体与口蹄疫特异性液相阻断抗体，而且产生了更高水平的脾淋巴细胞增殖及Th1型的细胞因子分泌。初步实验结果表明，本研究制备的BLP疫苗GEM-B (T1BT2) 4B具有良好的免疫原性，为研究口蹄疫病毒基因工程亚单位疫苗开辟了一条新的思路。

摘要:葡萄糖二酸是一种高附加值的有机酸，广泛用于食品、医药和化工领域。为获得生产葡萄糖二酸的微生物细胞工厂，通过共表达小鼠来源的肌醇加氧酶 (MIOX) 及恶臭假单胞菌来源的醛酸脱氢酶 (Udh)，在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C中构建了葡萄糖二酸合成途径，产量为 (28.28±3.15) mg/L。在此基础上，通过调控前体肌醇的合成途径，发现肌醇-1-磷酸合成酶 (INO1) 是葡萄糖二酸合成途径的限速酶，过量表达INO1，葡萄糖二酸产量达到 (107.51±10.87) mg/L，提高了2.8倍。进一步弱化竞争支路中磷酸果糖激酶 (PFK1) 的表达，最终葡萄糖二酸的产量达到 (230.22±10.75) mg/L，为进一步获得高产葡萄糖二酸细胞工厂提供基础。

摘要:Pxa1p为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae过氧化物酶体上的膜蛋白，与Pxa2p组成二聚体，参与转运长链脂肪酸进入过氧化物酶体过程。热带假丝酵母能够发酵烷烃和脂肪酸生产长链二元酸，而过氧化物酶体中发生的β-氧化会消耗产生的长链二元酸造成产率降低。本研究以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798为宿主菌，通过基于PCR片段的同源单交换法，快速构建ctpxa1基因敲除菌株C. tropicalis 1798-pxa1。利用半定量RT-PCR技术，检测ctpxa1基因在C. tropicalis 1798、C. tropicalis 1798-pxa1的表达量，灰度值比值为2.03，表明ctpxa1在C. tropicalis 1798-pxa1中的表达被弱化。经144 h发酵，C. tropicalis 1798-pxa1比C. tropicalis 1798的十二碳二元酸产量明显提升，其产出浓度为10.3 g/L，比野生型菌株C. tropicalis 1798提高了94.3%。

摘要:甘油是生物柴油的副产物，因其价格低廉和高还原性，成为生物发酵的重要碳源。为了进一步提高工程菌对甘油的利用能力，从而提高萜类化合物的合成能力，本研究从β-胡萝卜素高产菌CAR015出发，对其甘油代谢途径的多个基因进行了调控。首先敲除了编码3-磷酸甘油抑制子的glpR基因，然后分别用M1-37、M1-46和M1-93三个不同强度的人工调控元件对glpFK、glpD和tpiA三组基因进行单基因调控和多基因组合调控。研究发现用M1-46调控glpD基因后β-胡萝卜素产量达到了64.82 mg/L，是CAR015的4.86倍，甘油消耗速率也提高了100%；调控tpiA基因后β-胡萝卜素产量略有提高；调控glpFK基因后β-胡萝卜素产量略有降低。说明GlpD是甘油代谢途径中的关键限速步骤。Q-PCR结果表明，降低甘油代谢途径的glpD和glpFK基因转录水平，增加tpiA基因转录水平，可以增加细胞生长速度、提高β-胡萝卜素产量，可能是因为减少了丙酮醛毒性所致。组合调控glpD和tpiA基因，获得β-胡萝卜素产量最高菌株Gly003，其β-胡萝卜素产量达72.45 mg/L、产率达18.65 mg/g每克干细胞，分别是出发菌株CAR015的5.23倍和1.99倍。总之，GlpD是甘油代谢途径中的关键限速步骤，适当强度调控glpD，可以有效提高重组大肠杆菌的β-胡萝卜素产量。

摘要:表皮生长因子受体 (EGFR) 是广泛存在于后生动物中的多功能受体，其配体的种类、活化方式、配体与EGFR之间的相互作用以及激活的信号通路在哺乳动物中研究得较为深入。而非脊椎动物中，EGFR配体在各物种间差异较大，目前缺乏对除果蝇以外的其他昆虫EGFR配体的认识。通过同源比对、结构域预测、mRNA翻译起始序列分析和系统进化树构建，在家蚕中鉴定到2个EGFR的配体，命名为BmEGF-1和BmEGF-2。BmEGF-1与果蝇Spitz有较高的同源性和一致的Rhomboid识别序列，BmEGF-2为Vein的同源分子。经原核表达和纯化获得了BmEGF-1胞外区段，利用Sf9细胞分泌BmEGFR胞外区段，并通过pull-down实验验证了两者之间存在相互作用。在BmE细胞中表达BmEGF-1后，通过Western blotting检测到ERK和p38 MAPK的磷酸化水平增强，说明其不仅能激活经典的ERK信号通路，还可能通过p38 MAPK信号通路参与其他生理过程，为进一步研究EGFR配体在家蚕中的生物学功能提供了参考。

摘要:为了探讨利用美洲商陆毛状根生产其药用成分的可能性，研究了美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素。结果表明，美洲商陆叶片外植体被发根农杆菌ATCC 15834感染约18 d后，从其叶片外植体形态学下端叶脉切口处产生毛状根，其中以预培养1 d，农杆菌感染20 min，共培养4 d时的毛状根诱导率最高，达到70%。PCR扩增和硅胶薄层层析结果显示，发根农杆菌Ri质粒的rolC基因以及冠瘿碱合成酶基因已在美洲商陆毛状根基因组中整合和表达。所获得的美洲商陆毛状根系都能在无外源激素的MS固体培养基上快速自主生长；其中以毛状根根系2的生长速度最快、分生侧根能力最强和根表面的根毛密度最高；毛状根根表面呈紫红色或呈白色。在供试的MS、1/2MS、B5和6,7-V液体培养基中，以无外源激素的MS培养基最适合美洲商陆毛状根根系生长。与无外源激素的MS培养基相比，6,7-V培养基更有利于毛状根中商陆皂苷甲的合成与积累。本文所建立的美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的适宜条件为今后利用其毛状根株系的规模培养来生产其药用有效成分商陆皂苷甲奠定了实验和技术基础。

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摘要:基于CRISPR/Cas9n double nick技术构建人DNAH2 (Homo sapiens dynein, axonemal, heavy chain 2) 基因敲除的U2OS稳定细胞株，旨在研究DNAH2基因的生物学功能。首先设计并合成A、B两个sgRNA (Single guide RNA) 以及各自的互补链，退火连接形成DNAH2 sgRNA-A、B双链，再分别与带有BbsⅠ粘性末端的pX462线性载体相连，形成pX462-DNAH2-A、pX462-DNAH2-B重组真核表达质粒。质粒共转染至U2OS细胞后，加入嘌呤霉素，以有限稀释法获得阳性单克隆细胞株，再以蛋白印迹实验检测DNAH2蛋白的表达，最后通过PCR-基因测序技术分析突变特点。结果显示A、B sgRNA双链成功插入pX462载体，U2OS-DNAH2-KO单克隆细胞株中DNAH2蛋白不表达，DNAH2基因发生移码突变，从而证实利用CRISPR/Cas9n double nick系统成功构建人DNAH2基因敲除的U2OS稳定细胞株，为研究DNAH2基因提供有利工具。

摘要:设计一种具有“微坝”和“微缝”结构的微流控芯片，能够物理隔离不同细胞，而且培养基中小分子营养物质可以自由流通。实验结果表明在芯片上可以共培养人肺腺癌细胞 (A549)、人胚肺成纤维细胞 (HLF-1) 和人内皮细胞 (HUVECs) 三种细胞，在72 h培养后三种细胞生长状态良好，具有细胞图形化的特点和功能，为下一步开展多种细胞相互作用等相关研究提供重要的技术平台。