科微学术
生物工程学报
ISSN 1000-3061
CN 11-1998/Q
主管单位： 中国科学院 创刊时间：1985年
主办单位： 中国科学院微生物研究所 出版刊期：月刊
中国微生物学会 邮发代号：82-13
主 编： 邓子新 院士 出版日期：每月25日
执行主编： 李寅
收录类型：北大中文核心期刊、中国科技核心期刊、CSCD核心期刊、中国知网、Medline/PubMed、Scopus、AJ、JST、CSA(NS)、IC、EMBASE
主要栏目：综述、动物及兽医生物技术、环境生物技术、工业生物技术、合成生物技术、农业生物技术、医药生物技术、组织工程与细胞培养、生物技术与方法、生物育种与工艺优化、高校生物学教学
- 2024年第40卷第12期
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2024,40(12):1-6, DOI: 10.13345/j.cjb.240967
摘要：
2024,40(12):4311-4323, DOI: 10.13345/j.cjb.240118
摘要：
登革热是一种蚊媒传播的疾病，在热带及亚热带地区流行，由于全球人员流动的增加，其流行范围逐年扩大。登革病毒是登革热的病原体，通常4种血清型病毒共同流行，第一次病毒感染产生的交叉反应性抗体会给其他血清型继发性感染带来很大风险，目前还没有能提供完全保护的疫苗和抗病毒药物。近年来随着抗体技术的不断发展，研究者已分离出大量针对登革病毒的单克隆抗体，并通过基于结构的分析阐明了其中和表位。本文重点介绍了与登革病毒中和活性相关的关键表位，并对这些表位在疫苗设计和治疗性抗体药物开发中的应用前景进行了展望，有助于系统梳理登革病毒中和抗体的研究进展，为推动新型疫苗和抗体药物的研发提供了理论基础与技术指导。
登革热是一种蚊媒传播的疾病，在热带及亚热带地区流行，由于全球人员流动的增加，其流行范围逐年扩大。登革病毒是登革热的病原体，通常4种血清型病毒共同流行，第一次病毒感染产生的交叉反应性抗体会给其他血清型继发性感染带来很大风险，目前还没有能提供完全保护的疫苗和抗病毒药物。近年来随着抗体技术的不断发展，研究者已分离出大量针对登革病毒的单克隆抗体，并通过基于结构的分析阐明了其中和表位。本文重点介绍了与登革病毒中和活性相关的关键表位，并对这些表位在疫苗设计和治疗性抗体药物开发中的应用前景进行了展望，有助于系统梳理登革病毒中和抗体的研究进展，为推动新型疫苗和抗体药物的研发提供了理论基础与技术指导。
2024,40(12):4324-4338, DOI: 10.13345/j.cjb.240366
摘要：
纳米抗体(nanobodies, Nbs)是在骆驼科动物和鲨鱼中发现的一种独特的单域抗体，即重链抗体可变区(variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody, VHH)，具有很强的抗原靶向性和结合能力，规避了传统抗体体积大、稳定性低、免疫原性高以及清除速度慢的缺点。Nbs与毒素、酶、放射性核苷酸、荧光基团等官能团的生物偶联，增强了Nbs的功能，使其在人与动物疾病诊断和治疗方面展现出潜在的应用价值。本文综述了Nbs的结构特性，Nbs库的构建、筛选以及亲和力成熟策略，概述了Nbs在诊断和治疗中的应用现状，为疫病的诊断试剂研发与临床治疗提供了参考。
纳米抗体(nanobodies, Nbs)是在骆驼科动物和鲨鱼中发现的一种独特的单域抗体，即重链抗体可变区(variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody, VHH)，具有很强的抗原靶向性和结合能力，规避了传统抗体体积大、稳定性低、免疫原性高以及清除速度慢的缺点。Nbs与毒素、酶、放射性核苷酸、荧光基团等官能团的生物偶联，增强了Nbs的功能，使其在人与动物疾病诊断和治疗方面展现出潜在的应用价值。本文综述了Nbs的结构特性，Nbs库的构建、筛选以及亲和力成熟策略，概述了Nbs在诊断和治疗中的应用现状，为疫病的诊断试剂研发与临床治疗提供了参考。
2024,40(12):4339-4350, DOI: 10.13345/j.cjb.240188
摘要：
脂质纳米颗粒递送系统是目前最具有应用前景的药物载体之一，其生物相容性好、无免疫原性且载药效率高。然而，未修饰的脂质纳米颗粒仍存在稳定性差、易水解和易被快速清除的问题。为了克服上述缺点，研究人员对脂质纳米颗粒进行了一系列的修饰，包括多肽修饰、抗体修饰、配体修饰、核酸适配体修饰、多糖修饰等。其中，多糖作为一类天然聚合物，修饰脂质纳米颗粒后表现出良好的生物相容性，而且还具有靶向目标器官和低毒性等优势。多糖修饰后的脂质纳米颗粒具有在临床治疗中发挥重要作用的潜力。本文综述了多糖修饰脂质纳米颗粒的制备及应用，为进一步研究与开发新型脂质纳米颗粒提供了参考。
脂质纳米颗粒递送系统是目前最具有应用前景的药物载体之一，其生物相容性好、无免疫原性且载药效率高。然而，未修饰的脂质纳米颗粒仍存在稳定性差、易水解和易被快速清除的问题。为了克服上述缺点，研究人员对脂质纳米颗粒进行了一系列的修饰，包括多肽修饰、抗体修饰、配体修饰、核酸适配体修饰、多糖修饰等。其中，多糖作为一类天然聚合物，修饰脂质纳米颗粒后表现出良好的生物相容性，而且还具有靶向目标器官和低毒性等优势。多糖修饰后的脂质纳米颗粒具有在临床治疗中发挥重要作用的潜力。本文综述了多糖修饰脂质纳米颗粒的制备及应用，为进一步研究与开发新型脂质纳米颗粒提供了参考。
2024,40(12):4351-4364, DOI: 10.13345/j.cjb.240191
摘要：
Ten-eleven translocation 1 (TET1)蛋白是一种α-酮戊二酸(alpha-ketoglutaric acid, α-KG)和Fe2+依赖性的双加氧酶，通过将5-甲基胞嘧啶(5-methyl-cytosine, 5-mC)羟化成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyl-cytosine, 5-hmC)，完成DNA的主动去甲基化修饰过程。TET1参与维持基因组甲基化稳态并实现表观遗传调控，异常表达的TET1与5-mC氧化衍生物已经成为各种生物学和病理学过程中的潜在标志物，尤其在胚胎发育和恶性肿瘤等领域中逐渐成为研究热点。本文介绍了双加氧酶TET1的结构和去甲基化作用的机制，综述了其在胚胎发育、免疫应答、干细胞调控、癌症发展和神经系统发育等过程中发挥表观遗传调控作用的研究现状，并简述了其上游调控机制，为相关领域的深入研究提供了新的思路。
Ten-eleven translocation 1 (TET1)蛋白是一种α-酮戊二酸(alpha-ketoglutaric acid, α-KG)和Fe2+依赖性的双加氧酶，通过将5-甲基胞嘧啶(5-methyl-cytosine, 5-mC)羟化成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyl-cytosine, 5-hmC)，完成DNA的主动去甲基化修饰过程。TET1参与维持基因组甲基化稳态并实现表观遗传调控，异常表达的TET1与5-mC氧化衍生物已经成为各种生物学和病理学过程中的潜在标志物，尤其在胚胎发育和恶性肿瘤等领域中逐渐成为研究热点。本文介绍了双加氧酶TET1的结构和去甲基化作用的机制，综述了其在胚胎发育、免疫应答、干细胞调控、癌症发展和神经系统发育等过程中发挥表观遗传调控作用的研究现状，并简述了其上游调控机制，为相关领域的深入研究提供了新的思路。
2024,40(12):4365-4381, DOI: 10.13345/j.cjb.240729
摘要：
骨骼肌纤维类型转化是极其复杂且重要的生理过程，影响骨骼肌肌肉功能和代谢水平，不仅受到外界环境变化的影响，还受内在生理机制的调控。因此深入探究肌纤维类型转化的生理过程对于治疗人类神经肌肉疾病以及提高家畜肉质具有重要意义。由骨骼肌分泌的细胞因子，即肌肉因子，对骨骼肌纤维类型转化具有重要作用，主要通过自分泌和旁分泌的形式作用于骨骼肌，参与骨骼肌内信号传导，调控肌纤维类型转化。本文介绍了各种骨骼肌纤维类型间的功能差异，并对影响不同骨骼肌纤维类型转化过程的肌肉因子及其调控肌纤维类型转化的作用及机制进行综述和展望，为改善家畜肉质和治疗骨骼肌相关疾病提供了理论依据。
骨骼肌纤维类型转化是极其复杂且重要的生理过程，影响骨骼肌肌肉功能和代谢水平，不仅受到外界环境变化的影响，还受内在生理机制的调控。因此深入探究肌纤维类型转化的生理过程对于治疗人类神经肌肉疾病以及提高家畜肉质具有重要意义。由骨骼肌分泌的细胞因子，即肌肉因子，对骨骼肌纤维类型转化具有重要作用，主要通过自分泌和旁分泌的形式作用于骨骼肌，参与骨骼肌内信号传导，调控肌纤维类型转化。本文介绍了各种骨骼肌纤维类型间的功能差异，并对影响不同骨骼肌纤维类型转化过程的肌肉因子及其调控肌纤维类型转化的作用及机制进行综述和展望，为改善家畜肉质和治疗骨骼肌相关疾病提供了理论依据。
2024,40(12):4382-4395, DOI: 10.13345/j.cjb.240192
摘要：
表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是绿茶中一类含量最高的次级代谢产物，具有抗氧化、抗癌和抗炎等多种生理活性。EGCG在调节卵母细胞老化的过程中起重要作用，主要通过增强卵母细胞的抗氧化能力、改善线粒体功能和减少细胞凋亡来延缓卵母细胞的衰老进程。本文对EGCG主要分子特性及其调节卵母细胞老化的作用机制进行综述，为深入理解EGCG在减缓卵母细胞老化中的作用提供了参考。
表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是绿茶中一类含量最高的次级代谢产物，具有抗氧化、抗癌和抗炎等多种生理活性。EGCG在调节卵母细胞老化的过程中起重要作用，主要通过增强卵母细胞的抗氧化能力、改善线粒体功能和减少细胞凋亡来延缓卵母细胞的衰老进程。本文对EGCG主要分子特性及其调节卵母细胞老化的作用机制进行综述，为深入理解EGCG在减缓卵母细胞老化中的作用提供了参考。
2024,40(12):4396-4407, DOI: 10.13345/j.cjb.240077
摘要：
抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是机体先天免疫中的一类小分子多肽，作为机体防御的第一道防线，在自然界中广泛存在。AMPs具有多种生物学活性且不易产生耐药性，但天然AMPs容易被体内的各种消化酶降解。在AMPs中引入非天然氨基酸、化学修饰、合理规避酶切位点进行氨基酸重排、肽的环化、纳米肽设计等提高AMPs蛋白酶稳定的方法不断出现。本文重点综述了提高AMPs蛋白酶稳定性的各种方法，以期为此领域的研究提供参考。
抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是机体先天免疫中的一类小分子多肽，作为机体防御的第一道防线，在自然界中广泛存在。AMPs具有多种生物学活性且不易产生耐药性，但天然AMPs容易被体内的各种消化酶降解。在AMPs中引入非天然氨基酸、化学修饰、合理规避酶切位点进行氨基酸重排、肽的环化、纳米肽设计等提高AMPs蛋白酶稳定的方法不断出现。本文重点综述了提高AMPs蛋白酶稳定性的各种方法，以期为此领域的研究提供参考。
2024,40(12):4408-4417, DOI: 10.13345/j.cjb.240482
摘要：
胡蜂毒肽(mastoparans, MP)是一类昆虫源的α-螺旋阳离子抗菌肽，具有广谱的抗微生物活性，对细菌、真菌、病毒及寄生虫的生长均有一定的抑制作用。通过氨基酸替换、肽段结构修饰、肽链环化及剂型改造等多种方法进行多肽改造，可增强胡蜂毒肽的生物学活性和靶向性，并降低其毒性。本文对胡蜂毒肽的结构、生物学功能及其修饰改造方法进行综述，并对以胡蜂毒肽为基础的抗菌药物研发进行了展望，为胡蜂毒肽作为新型抗微生物药物的研究提供了参考。
胡蜂毒肽(mastoparans, MP)是一类昆虫源的α-螺旋阳离子抗菌肽，具有广谱的抗微生物活性，对细菌、真菌、病毒及寄生虫的生长均有一定的抑制作用。通过氨基酸替换、肽段结构修饰、肽链环化及剂型改造等多种方法进行多肽改造，可增强胡蜂毒肽的生物学活性和靶向性，并降低其毒性。本文对胡蜂毒肽的结构、生物学功能及其修饰改造方法进行综述，并对以胡蜂毒肽为基础的抗菌药物研发进行了展望，为胡蜂毒肽作为新型抗微生物药物的研究提供了参考。
2024,40(12):4418-4438, DOI: 10.13345/j.cjb.240026
摘要：
Argonaute蛋白是广泛活跃于不同生物的整个生命周期、与小RNA (small RNA, sRNA)结合并调控基因表达的一类蛋白。脊椎动物Argonaute蛋白有2个分支，Ago蛋白和Piwi蛋白，均包含N、L1、L2、PAZ、MID和PIWI结构域。N结构域有助于sRNA单链加载；L1、L2起结构域连接作用；PAZ和MID结构域通过锚定sRNA发挥功能；部分Argonaute蛋白的PIWI结构域类似RNase H，具有核酸内切酶功能。Ago蛋白主要在转录及转录后水平调控基因表达；Piwi蛋白主要存在于生殖细胞，通过多种途径沉默转座子以保护机体基因组免受破坏，同时参与基因表达调控。本文结合近年来Argonaute蛋白在晶体结构、功能解析、表达模式等方面的研究进展，从蛋白结构、sRNA依赖性、基因表达调控机制、生物学功能等方面对脊椎动物Ago和Piwi蛋白分支进行比较阐述，以期阐明其在表观遗传调控中的作用，并为后续Argonaute蛋白的深入研究和实际应用提供参考。
Argonaute蛋白是广泛活跃于不同生物的整个生命周期、与小RNA (small RNA, sRNA)结合并调控基因表达的一类蛋白。脊椎动物Argonaute蛋白有2个分支，Ago蛋白和Piwi蛋白，均包含N、L1、L2、PAZ、MID和PIWI结构域。N结构域有助于sRNA单链加载；L1、L2起结构域连接作用；PAZ和MID结构域通过锚定sRNA发挥功能；部分Argonaute蛋白的PIWI结构域类似RNase H，具有核酸内切酶功能。Ago蛋白主要在转录及转录后水平调控基因表达；Piwi蛋白主要存在于生殖细胞，通过多种途径沉默转座子以保护机体基因组免受破坏，同时参与基因表达调控。本文结合近年来Argonaute蛋白在晶体结构、功能解析、表达模式等方面的研究进展，从蛋白结构、sRNA依赖性、基因表达调控机制、生物学功能等方面对脊椎动物Ago和Piwi蛋白分支进行比较阐述，以期阐明其在表观遗传调控中的作用，并为后续Argonaute蛋白的深入研究和实际应用提供参考。
2024,40(12):4439-4451, DOI: 10.13345/j.cjb.240080
摘要：
蓝舌病病毒(bluetongue virus, BTV)常通过媒介昆虫库蠓叮咬感染绵羊、牛、鹿等，引起家养及野生反刍动物蓝舌病(bluetongue, BT)。目前BT在全球亚热带甚至温带地区广泛分布，严重威胁世界畜牧业发展及国际贸易。本文介绍了BTV结构及其细胞侵入过程，并对宿主细胞抗BTV免疫应答以及BTV非结构蛋白NS3、NS4和结构蛋白VP3、VP4等拮抗宿主细胞天然免疫应答机制进行综述，为深入了解BTV拮抗宿主细胞干扰素(interferon, IFN)免疫应答的分子机制及研究BTV致病机制和新型疫苗提供了参考。
蓝舌病病毒(bluetongue virus, BTV)常通过媒介昆虫库蠓叮咬感染绵羊、牛、鹿等，引起家养及野生反刍动物蓝舌病(bluetongue, BT)。目前BT在全球亚热带甚至温带地区广泛分布，严重威胁世界畜牧业发展及国际贸易。本文介绍了BTV结构及其细胞侵入过程，并对宿主细胞抗BTV免疫应答以及BTV非结构蛋白NS3、NS4和结构蛋白VP3、VP4等拮抗宿主细胞天然免疫应答机制进行综述，为深入了解BTV拮抗宿主细胞干扰素(interferon, IFN)免疫应答的分子机制及研究BTV致病机制和新型疫苗提供了参考。
2024,40(12):4452-4466, DOI: 10.13345/j.cjb.240128
摘要：
胚胎植入涉及胚胎与母体子宫内膜间复杂的相互作用，目前对于胚胎植入仍然有许多问题有待探究。子宫内膜上皮类器官与子宫内膜组装体模型为体外研究胚胎植入的过程提供了一个全新的思路。本文总结了胚胎植入过程、雌孕激素协同、胚胎源信号对子宫内膜容受态建立的调控机制、子宫内膜类器官的建立、子宫内膜组装体以及利用内膜组装体探索母-胎互作的最新研究进展，为研究胚胎植入过程中胚胎与母体子宫间的交流互作提供了新策略。
胚胎植入涉及胚胎与母体子宫内膜间复杂的相互作用，目前对于胚胎植入仍然有许多问题有待探究。子宫内膜上皮类器官与子宫内膜组装体模型为体外研究胚胎植入的过程提供了一个全新的思路。本文总结了胚胎植入过程、雌孕激素协同、胚胎源信号对子宫内膜容受态建立的调控机制、子宫内膜类器官的建立、子宫内膜组装体以及利用内膜组装体探索母-胎互作的最新研究进展，为研究胚胎植入过程中胚胎与母体子宫间的交流互作提供了新策略。
2024,40(12):4467-4479, DOI: 10.13345/j.cjb.240263
摘要：
随着现代工业的发展，重金属水污染日益严重，对水生生态环境和人类健康构成潜在威胁。生物炭作为一种高效、低成本的吸附剂，对重金属离子有一定的吸附能力，经过改性后其吸附能力显著增强，合理利用生物炭能有效缓解环境污染问题。本文综述了生物炭的改性方法，对比了物理改性、生物改性和化学改性等不同改性方法的优缺点，分析了改性生物炭对重金属离子吸附能力的影响，总结了生物炭的改性机理。在此基础上，指出了未来生物炭在共存污染物问题的研究方向，为生物炭在重金属废水净化领域的应用提供了重要参考。
随着现代工业的发展，重金属水污染日益严重，对水生生态环境和人类健康构成潜在威胁。生物炭作为一种高效、低成本的吸附剂，对重金属离子有一定的吸附能力，经过改性后其吸附能力显著增强，合理利用生物炭能有效缓解环境污染问题。本文综述了生物炭的改性方法，对比了物理改性、生物改性和化学改性等不同改性方法的优缺点，分析了改性生物炭对重金属离子吸附能力的影响，总结了生物炭的改性机理。在此基础上，指出了未来生物炭在共存污染物问题的研究方向，为生物炭在重金属废水净化领域的应用提供了重要参考。
2024,40(12):4480-4492, DOI: 10.13345/j.cjb.240529
摘要：
砷(arsenic, As)是一种常见的有毒污染元素，微生物介导的砷形态转变是砷生物地球化学循环的重要组成部分。在砷的各类微生物代谢过程中，砷的耦合还原对环境影响较大，也是容易被忽视的过程。本文主要从砷的生物地球化学循环出发，介绍了甲烷氧化、厌氧铵氧化、铁(Fe)-硫(S)氧化与砷耦合还原的微生物协同机制，有机质、pH值以及氧化还原电位是影响砷耦合还原的主要因素。砷经耦合还原后，毒性和迁移性大大增加，可能会增加砷污染的风险。因此，进一步明确碳(C)、氮(N)、Fe、S等这些元素在砷耦合过程中的影响以及挖掘出更多的微生物耦合还原过程，在防治砷污染方面具有重要意义。
砷(arsenic, As)是一种常见的有毒污染元素，微生物介导的砷形态转变是砷生物地球化学循环的重要组成部分。在砷的各类微生物代谢过程中，砷的耦合还原对环境影响较大，也是容易被忽视的过程。本文主要从砷的生物地球化学循环出发，介绍了甲烷氧化、厌氧铵氧化、铁(Fe)-硫(S)氧化与砷耦合还原的微生物协同机制，有机质、pH值以及氧化还原电位是影响砷耦合还原的主要因素。砷经耦合还原后，毒性和迁移性大大增加，可能会增加砷污染的风险。因此，进一步明确碳(C)、氮(N)、Fe、S等这些元素在砷耦合过程中的影响以及挖掘出更多的微生物耦合还原过程，在防治砷污染方面具有重要意义。
2024,40(12):4493-4508, DOI: 10.13345/j.cjb.240084
摘要：
本研究旨在探究C57BL/6小鼠免疫口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)与塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA) 2种病原的免疫应答差异，为解析获得性免疫调控机制提供理论基础。将灭活纯化的FMDV与SVA抗原分别免疫C57BL/6小鼠，设置PBS免疫对照组；利用流式细胞术分析免疫14、28 d后各组小鼠脾淋巴细胞中Th1与Th2细胞的比例，并进行小鼠脾脏转录组测序和分析；通过体外抗原刺激鼠巨噬细胞验证筛选差异表达基因。结果显示，小鼠免疫14 d后，FMDV与SVA抗原免疫组诱导Th1/Th2型免疫应答水平无显著差异，免疫28 d后，SVA抗原免疫组诱导Th1型与Th2型免疫应答水平均高于FMDV抗原免疫组；转录组测序获得2种抗原免疫后2组共有差异基因Rsad2和Tspan8等，可能参与FMDV和SVA抗原激活Th1/Th2型免疫应答反应的过程；FMDV与SVA抗原体外刺激巨噬细胞分泌IL-12、IL-33，差异基因Tspan8、Rsad2的表达趋势与转录组测序结果一致，Rsad2的表达受I型干扰素(IFNα、IFNβ)的调控。本研究获得了2种小鼠脾脏中抗原免疫应答相关的差异基因，为进一步研究FMDV和SVA免疫应答机制奠定基础。
本研究旨在探究C57BL/6小鼠免疫口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)与塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA) 2种病原的免疫应答差异，为解析获得性免疫调控机制提供理论基础。将灭活纯化的FMDV与SVA抗原分别免疫C57BL/6小鼠，设置PBS免疫对照组；利用流式细胞术分析免疫14、28 d后各组小鼠脾淋巴细胞中Th1与Th2细胞的比例，并进行小鼠脾脏转录组测序和分析；通过体外抗原刺激鼠巨噬细胞验证筛选差异表达基因。结果显示，小鼠免疫14 d后，FMDV与SVA抗原免疫组诱导Th1/Th2型免疫应答水平无显著差异，免疫28 d后，SVA抗原免疫组诱导Th1型与Th2型免疫应答水平均高于FMDV抗原免疫组；转录组测序获得2种抗原免疫后2组共有差异基因Rsad2和Tspan8等，可能参与FMDV和SVA抗原激活Th1/Th2型免疫应答反应的过程；FMDV与SVA抗原体外刺激巨噬细胞分泌IL-12、IL-33，差异基因Tspan8、Rsad2的表达趋势与转录组测序结果一致，Rsad2的表达受I型干扰素(IFNα、IFNβ)的调控。本研究获得了2种小鼠脾脏中抗原免疫应答相关的差异基因，为进一步研究FMDV和SVA免疫应答机制奠定基础。
2024,40(12):4509-4520, DOI: 10.13345/j.cjb.240354
摘要：
本研究旨在利用铁蛋白制备携带非洲猪瘟病毒p30蛋白的纳米颗粒抗原，并对其免疫原性进行评价，为非洲猪瘟纳米疫苗研究提供实验基础。首先，将编码p30蛋白和SpyTag标签的基因序列融合后插入pCold-I载体，得到pCold-p30质粒。将编码SpyCatcher与铁蛋白的基因序列融合后插入pET-28a(+)载体得到pET-F-np质粒，并分别在大肠杆菌中诱导表达。然后，将亲和层析纯化后的p30蛋白与铁蛋白在体外偶联结合，用分子筛纯化后得到偶联p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒F-p30，利用粒径仪、透射电镜观察形态结构。将F-p30纳米颗粒蛋白免疫小鼠，评估其体液和细胞免疫应答。结果表明，本研究成功制备出偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒，颗粒结构约20 nm。F-p30在体外能被小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)高效摄取，与p30蛋白相比，F-p30纳米颗粒免疫小鼠诱导产生更高水平的特异性抗体和细胞因子，更有利于刺激淋巴结滤泡辅助T细胞(follicular helper T cell, TFH)、生发中心B细胞(germinal center B cell, GCB)和脾脏CD4+及CD8+T淋巴细胞的增殖。综上，本研究成功制备了偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒，能显著增强p30蛋白的免疫原性，为非洲猪瘟疫苗的研究奠定了基础。
本研究旨在利用铁蛋白制备携带非洲猪瘟病毒p30蛋白的纳米颗粒抗原，并对其免疫原性进行评价，为非洲猪瘟纳米疫苗研究提供实验基础。首先，将编码p30蛋白和SpyTag标签的基因序列融合后插入pCold-I载体，得到pCold-p30质粒。将编码SpyCatcher与铁蛋白的基因序列融合后插入pET-28a(+)载体得到pET-F-np质粒，并分别在大肠杆菌中诱导表达。然后，将亲和层析纯化后的p30蛋白与铁蛋白在体外偶联结合，用分子筛纯化后得到偶联p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒F-p30，利用粒径仪、透射电镜观察形态结构。将F-p30纳米颗粒蛋白免疫小鼠，评估其体液和细胞免疫应答。结果表明，本研究成功制备出偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒，颗粒结构约20 nm。F-p30在体外能被小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)高效摄取，与p30蛋白相比，F-p30纳米颗粒免疫小鼠诱导产生更高水平的特异性抗体和细胞因子，更有利于刺激淋巴结滤泡辅助T细胞(follicular helper T cell, TFH)、生发中心B细胞(germinal center B cell, GCB)和脾脏CD4+及CD8+T淋巴细胞的增殖。综上，本研究成功制备了偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒，能显著增强p30蛋白的免疫原性，为非洲猪瘟疫苗的研究奠定了基础。
2024,40(12):4521-4532, DOI: 10.13345/j.cjb.240456
摘要：
为了构建表达红斑丹毒丝菌SpaA和CbpB蛋白的口服重组枯草芽孢杆菌活载体候选疫苗菌株，经融合PCR及无缝克隆构建了重组整合质粒pDG1730-CBJA，使用自然法转化枯草芽孢杆菌KC菌株，通过壮观霉素抗性平板筛选、淀粉降解实验及PCR检测获得重组菌KC-spaA-cbpB。用免疫印迹及间接免疫荧光实验检测重组菌表达的SpaA和CbpB蛋白，并测定了重组菌在小鼠体内的遗传稳定性。构建壮观霉素抗性基因敲除质粒pMAD-∆sper，转化KC-spaA-cbpB，筛选、鉴定获得KC-spaA-cbpB::∆sper，并进行了小鼠的口服免疫实验。实验结果显示，重组菌KC-spaA-cbpB在菌体表面表达SpaA蛋白，在芽孢表面表达CbpB蛋白，在小鼠体内稳定。壮观霉素抗性基因敲除菌KC-spaA-cbpB::∆sper能表达SpaA和CbpB蛋白，其芽孢经灌胃免疫小鼠42 d后，小鼠血清中SpaA和CbpB蛋白的特异性抗体IgG和粪便中特异性sIgA均极显著高于阴性对照(P<0.01)，攻毒保护率为67.5%。本研究成功构建了表达红斑丹毒丝菌SpaA和CbpB蛋白的重组枯草芽孢杆菌，为研究猪丹毒口服活载体疫苗奠定了基础。
为了构建表达红斑丹毒丝菌SpaA和CbpB蛋白的口服重组枯草芽孢杆菌活载体候选疫苗菌株，经融合PCR及无缝克隆构建了重组整合质粒pDG1730-CBJA，使用自然法转化枯草芽孢杆菌KC菌株，通过壮观霉素抗性平板筛选、淀粉降解实验及PCR检测获得重组菌KC-spaA-cbpB。用免疫印迹及间接免疫荧光实验检测重组菌表达的SpaA和CbpB蛋白，并测定了重组菌在小鼠体内的遗传稳定性。构建壮观霉素抗性基因敲除质粒pMAD-∆sper，转化KC-spaA-cbpB，筛选、鉴定获得KC-spaA-cbpB::∆sper，并进行了小鼠的口服免疫实验。实验结果显示，重组菌KC-spaA-cbpB在菌体表面表达SpaA蛋白，在芽孢表面表达CbpB蛋白，在小鼠体内稳定。壮观霉素抗性基因敲除菌KC-spaA-cbpB::∆sper能表达SpaA和CbpB蛋白，其芽孢经灌胃免疫小鼠42 d后，小鼠血清中SpaA和CbpB蛋白的特异性抗体IgG和粪便中特异性sIgA均极显著高于阴性对照(P<0.01)，攻毒保护率为67.5%。本研究成功构建了表达红斑丹毒丝菌SpaA和CbpB蛋白的重组枯草芽孢杆菌，为研究猪丹毒口服活载体疫苗奠定了基础。
2024,40(12):4533-4545, DOI: 10.13345/j.cjb.240083
摘要：
为了筛选和鉴定与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)非结构蛋白15 (non-structural protein 15, Nsp15)互作的关键宿主蛋白，通过IP/pull-down beads结合质谱技术筛选、鉴定与PEDV非结构蛋白Nsp15互作的宿主蛋白，并利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)、激光共聚焦验证其互作关系，最后应用Western blotting和实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)初步明确宿主蛋白SLC25a3与PEDV之间的作用关系。本研究成功构建了Nsp15重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp15，并筛选出与PEDV Nsp15互作的宿主蛋白SLC25a3。免疫共沉淀及激光共聚焦结果显示PEDV Nsp15与宿主蛋白SLC25a3存在互作关系。宿主蛋白SLC25a3能够显著抑制PEDV复制且呈现剂量依赖性。本研究为进一步探究SLC25a3在抗PEDV免疫应答中的作用及机制提供了参考。
为了筛选和鉴定与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)非结构蛋白15 (non-structural protein 15, Nsp15)互作的关键宿主蛋白，通过IP/pull-down beads结合质谱技术筛选、鉴定与PEDV非结构蛋白Nsp15互作的宿主蛋白，并利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)、激光共聚焦验证其互作关系，最后应用Western blotting和实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)初步明确宿主蛋白SLC25a3与PEDV之间的作用关系。本研究成功构建了Nsp15重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp15，并筛选出与PEDV Nsp15互作的宿主蛋白SLC25a3。免疫共沉淀及激光共聚焦结果显示PEDV Nsp15与宿主蛋白SLC25a3存在互作关系。宿主蛋白SLC25a3能够显著抑制PEDV复制且呈现剂量依赖性。本研究为进一步探究SLC25a3在抗PEDV免疫应答中的作用及机制提供了参考。
2024,40(12):4546-4556, DOI: 10.13345/j.cjb.240275
摘要：
为探究糖酵解对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAMs)中复制的作用，以PRRSV感染PAMs为研究对象，采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、实时荧光定量PCR、病毒滴度测定和蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测PAMs感染PRRSV后糖代谢的变化，PRRSV蛋白和病毒滴度及细胞相关基因和蛋白的表达水平；并应用靶向低氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)特异性siRNA分析HIF-1α在病毒复制中的作用。结果显示，PRRSV感染增强PAMs糖酵解，上清液葡萄糖摄取和乳酸含量显著升高(P<0.05或0.01)，细胞内ATP显著降低(P<0.05)，己糖激酶2 (hexokinase 2, HK2)、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3 (6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3, PFKFB3)和丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase isozyme type M2, PKM2)含量显著升高(P<0.05或0.01)；抑制糖酵解会显著降低PRRSV蛋白表达和病毒滴度(P<0.01)；特异性siRNA敲低HIF-1α的表达后，糖酵解和PRRSV滴度显著降低(P<0.05)；抑制糖酵解过程后逆转了PRRSV抑制干扰素信号通路。本研究为探索糖酵解在PRRSV复制过程中的功能提供了理论支持。
为探究糖酵解对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAMs)中复制的作用，以PRRSV感染PAMs为研究对象，采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、实时荧光定量PCR、病毒滴度测定和蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测PAMs感染PRRSV后糖代谢的变化，PRRSV蛋白和病毒滴度及细胞相关基因和蛋白的表达水平；并应用靶向低氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)特异性siRNA分析HIF-1α在病毒复制中的作用。结果显示，PRRSV感染增强PAMs糖酵解，上清液葡萄糖摄取和乳酸含量显著升高(P<0.05或0.01)，细胞内ATP显著降低(P<0.05)，己糖激酶2 (hexokinase 2, HK2)、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3 (6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3, PFKFB3)和丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase isozyme type M2, PKM2)含量显著升高(P<0.05或0.01)；抑制糖酵解会显著降低PRRSV蛋白表达和病毒滴度(P<0.01)；特异性siRNA敲低HIF-1α的表达后，糖酵解和PRRSV滴度显著降低(P<0.05)；抑制糖酵解过程后逆转了PRRSV抑制干扰素信号通路。本研究为探索糖酵解在PRRSV复制过程中的功能提供了理论支持。
2024,40(12):4557-4572, DOI: 10.13345/j.cjb.240296
摘要：
本研究旨在探究microRNA(miRNA)对牛下丘脑可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide, CART)的转录后调控作用，并筛选调控关键miRNA。通过生物信息学分析来预测与牛CART 3ʹ非翻译区(3ʹ untranslated regions, 3ʹUTR)结合的潜在miRNA，发现CART 3ʹUTR存在7个miRNA结合位点，即bta-miR-377、bta-miR-331-3p、bta-miR-491、bta-miR-493、bta-miR-758、bta-miR-877和bta-miR-381结合位点；使用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR, RT-PCR)技术检测CART基因与靶miRNA在牛下丘脑内源性表达情况，发现它们均在牛下丘脑组织内表达；通过双荧光素酶报告实验验证CART 3ʹUTR与靶细胞miRNA结合位点，证明了CART 3ʹUTR与7个miRNA均具有靶向结合关系；通过细胞实验检测靶miRNA对外源性CART基因与CART蛋白表达的影响并筛选调控关键miRNA，结果表明，7个miRNA均能抑制外源CART信使RNA (messenger RNA, mRNA)的表达，其中以bta-miR-491的抑制作用最强，bta-miR-377、bta-miR-331-3p、bta-miR-491、bta-miR-493及bta-miR-381均能抑制外源性CART蛋白表达，其中以bta-miR-381的抑制作用最强；通过动物实验研究关键miRNA对下丘脑CART基因、CART蛋白表达及血清CART浓度的影响，结果表明，miR-491和miR-381可结合CART 3ʹUTR位点，调节下丘脑CART内源性表达并影响其血清浓度。本研究的结果表明，miR-491和miR-381是调节牛下丘脑CART表达的主要miRNA，可通过调节CART内源性表达进而影响血清CART浓度。
本研究旨在探究microRNA(miRNA)对牛下丘脑可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide, CART)的转录后调控作用，并筛选调控关键miRNA。通过生物信息学分析来预测与牛CART 3ʹ非翻译区(3ʹ untranslated regions, 3ʹUTR)结合的潜在miRNA，发现CART 3ʹUTR存在7个miRNA结合位点，即bta-miR-377、bta-miR-331-3p、bta-miR-491、bta-miR-493、bta-miR-758、bta-miR-877和bta-miR-381结合位点；使用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR, RT-PCR)技术检测CART基因与靶miRNA在牛下丘脑内源性表达情况，发现它们均在牛下丘脑组织内表达；通过双荧光素酶报告实验验证CART 3ʹUTR与靶细胞miRNA结合位点，证明了CART 3ʹUTR与7个miRNA均具有靶向结合关系；通过细胞实验检测靶miRNA对外源性CART基因与CART蛋白表达的影响并筛选调控关键miRNA，结果表明，7个miRNA均能抑制外源CART信使RNA (messenger RNA, mRNA)的表达，其中以bta-miR-491的抑制作用最强，bta-miR-377、bta-miR-331-3p、bta-miR-491、bta-miR-493及bta-miR-381均能抑制外源性CART蛋白表达，其中以bta-miR-381的抑制作用最强；通过动物实验研究关键miRNA对下丘脑CART基因、CART蛋白表达及血清CART浓度的影响，结果表明，miR-491和miR-381可结合CART 3ʹUTR位点，调节下丘脑CART内源性表达并影响其血清浓度。本研究的结果表明，miR-491和miR-381是调节牛下丘脑CART表达的主要miRNA，可通过调节CART内源性表达进而影响血清CART浓度。
2024,40(12):4573-4585, DOI: 10.13345/j.cjb.240039
摘要：
猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)是导致哺乳仔猪致命性腹泻的一种重要病原体，目前缺少有效防治该病毒的疫苗和药物。非结构蛋白13 (NSP13)是一种病毒编码的解旋酶，被认为是抗病毒药物的重要靶点，因此有必要对其解旋活性进行研究。本研究以PDCoV的NSP13基因为模板，将其插入到原核表达载体pET-28a中，构建重组质粒pET-28a-NSP13。NSP13蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并进行了纯化。验证了NSP13蛋白的活性，并且探究了影响NSP13解旋酶活性的因素。结果表明，PDCoV的NSP13蛋白能够在原核系统中表达，纯化后的NSP13具有解旋活性，能够解开具有5ʹtailed的双链DNA。此外，NSP13还具有促进核酸单链的碱基互补配对形成双链的退火功能。金属离子的种类会影响NSP13的解旋活性，但在0.5–6.0 mmol/L范围内的Mg2+浓度对NSP13解旋活性无明显影响。当溶液pH在4–9范围内，NSP13解旋活性无明显差异。在0.25–6.00 mmol/L范围内的ATP浓度对NSP13解旋活性存在微弱的影响，NSP13浓度≥80 nmol/L则会抑制解旋活性。本研究获得了重组表达的PDCoV NSP13蛋白并对其解旋酶活性进行了探究，为深入理解NSP13调控PDCoV复制的机制和抗冠状病毒药物的研发奠定了理论基础。
猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)是导致哺乳仔猪致命性腹泻的一种重要病原体，目前缺少有效防治该病毒的疫苗和药物。非结构蛋白13 (NSP13)是一种病毒编码的解旋酶，被认为是抗病毒药物的重要靶点，因此有必要对其解旋活性进行研究。本研究以PDCoV的NSP13基因为模板，将其插入到原核表达载体pET-28a中，构建重组质粒pET-28a-NSP13。NSP13蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并进行了纯化。验证了NSP13蛋白的活性，并且探究了影响NSP13解旋酶活性的因素。结果表明，PDCoV的NSP13蛋白能够在原核系统中表达，纯化后的NSP13具有解旋活性，能够解开具有5ʹtailed的双链DNA。此外，NSP13还具有促进核酸单链的碱基互补配对形成双链的退火功能。金属离子的种类会影响NSP13的解旋活性，但在0.5–6.0 mmol/L范围内的Mg2+浓度对NSP13解旋活性无明显影响。当溶液pH在4–9范围内，NSP13解旋活性无明显差异。在0.25–6.00 mmol/L范围内的ATP浓度对NSP13解旋活性存在微弱的影响，NSP13浓度≥80 nmol/L则会抑制解旋活性。本研究获得了重组表达的PDCoV NSP13蛋白并对其解旋酶活性进行了探究，为深入理解NSP13调控PDCoV复制的机制和抗冠状病毒药物的研发奠定了理论基础。
2024,40(12):4586-4593, DOI: 10.13345/j.cjb.240586
摘要：
为探索制备基于壳聚糖的超声耦合水凝胶垫最佳工艺，探讨其在超声检查中的潜在应用价值，本研究以壳聚糖、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、N-异丙基丙烯酰胺为主要材料，使用3因素3水平的正交试验优化自由基聚合法，制备基于壳聚糖的超声耦合水凝胶垫，对水凝胶垫的拉伸强度和超声图像质量进行表征。以原料比、聚合温度、冻干时间这3个因素为考察对象，筛选最优处方。采用扫描电子显微镜、万能试验机、超声诊断仪对其结构和性能进行表征。结果显示通过正交试验筛选出的最优处方为壳聚糖、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、N-异丙基丙烯酰胺的比例为2:0.55:17.27，聚合温度25 ℃，冻干时间48 h。在此条件下制备的超声耦合水凝胶垫外观透明、内部为多孔结构、黏附性良好、拉伸强度较高；第10天时溶胀度才出现缓慢下降，具有良好的溶胀性能；超声图像质量与医用超声耦合剂相比无明显差别。本研究分析了不同制备工艺对基于壳聚糖的超声耦合水凝胶垫的成胶影响，所制备的水凝胶垫外观透明，对人体温和无刺激，为超声检查提供了良好的透声材料。
为探索制备基于壳聚糖的超声耦合水凝胶垫最佳工艺，探讨其在超声检查中的潜在应用价值，本研究以壳聚糖、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、N-异丙基丙烯酰胺为主要材料，使用3因素3水平的正交试验优化自由基聚合法，制备基于壳聚糖的超声耦合水凝胶垫，对水凝胶垫的拉伸强度和超声图像质量进行表征。以原料比、聚合温度、冻干时间这3个因素为考察对象，筛选最优处方。采用扫描电子显微镜、万能试验机、超声诊断仪对其结构和性能进行表征。结果显示通过正交试验筛选出的最优处方为壳聚糖、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、N-异丙基丙烯酰胺的比例为2:0.55:17.27，聚合温度25 ℃，冻干时间48 h。在此条件下制备的超声耦合水凝胶垫外观透明、内部为多孔结构、黏附性良好、拉伸强度较高；第10天时溶胀度才出现缓慢下降，具有良好的溶胀性能；超声图像质量与医用超声耦合剂相比无明显差别。本研究分析了不同制备工艺对基于壳聚糖的超声耦合水凝胶垫的成胶影响，所制备的水凝胶垫外观透明，对人体温和无刺激，为超声检查提供了良好的透声材料。
2024,40(12):4594-4604, DOI: 10.13345/j.cjb.240252
摘要：
大肠杆菌Nissle 1917 (EcN)因生物相容性高、易基因改造等特点，常常被用于肿瘤细菌疗法。目前，大多数研究利用质粒载体构建EcN工程菌，存在基因表达不稳定、需要利用抗生素选择性压力来保持高拷贝数等问题。本研究以EcN中光敏剂5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, 5-ALA)的合成为例，利用噬菌体整合技术将5-ALA合成的关键基因hemAM、hemL单拷贝整合EcN基因组，然后利用化学诱导染色体进化(chemically inducible chromosomal evolution, CIChE)的方法提高hemAM、hemL拷贝数，进而促进5-ALA的稳定合成。通过体外细胞实验初步验证了EcN工程菌能将稳定合成的5-ALA递送至肿瘤细胞并抑制其生长，实验结果为EcN工程菌应用于肿瘤光动力治疗提供理论基础。
大肠杆菌Nissle 1917 (EcN)因生物相容性高、易基因改造等特点，常常被用于肿瘤细菌疗法。目前，大多数研究利用质粒载体构建EcN工程菌，存在基因表达不稳定、需要利用抗生素选择性压力来保持高拷贝数等问题。本研究以EcN中光敏剂5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, 5-ALA)的合成为例，利用噬菌体整合技术将5-ALA合成的关键基因hemAM、hemL单拷贝整合EcN基因组，然后利用化学诱导染色体进化(chemically inducible chromosomal evolution, CIChE)的方法提高hemAM、hemL拷贝数，进而促进5-ALA的稳定合成。通过体外细胞实验初步验证了EcN工程菌能将稳定合成的5-ALA递送至肿瘤细胞并抑制其生长，实验结果为EcN工程菌应用于肿瘤光动力治疗提供理论基础。
2024,40(12):4605-4615, DOI: 10.13345/j.cjb.240307
摘要：
本研究旨在构建宿主ADP-核糖基化因子4 (ADP-ribosylation factor 4, ARF4)和ADP-核糖基化因子5 (ADP-ribosylation factor 5, ARF5)基因敲除小鼠，明确ARF4和ARF5基因对寨卡病毒感染的作用。首先利用CRISPR-Cas9技术，获得ARF4和ARF5单基因敲除小鼠(ARF4KO和ARF5KO)，并通过杂交繁育获得双基因敲除小鼠(ARF4KO/ARF5KO)，通过PCR法鉴定小鼠基因型，定量RT-PCR法检测目标基因的敲除效果。之后，用寨卡病毒感染基因敲除小鼠，采集第2、4、 6天小鼠血液和各组织样本，提取核酸后用RT-qPCR法检测病毒载量，用HE染色观察组织病理变化。结果显示，用ARF4和ARF5特异引物，分别在ARF4KO–/+、ARF5KO–/–以及ARF4KO–/+/ARF5KO–/–小鼠扩增到与目标基因大小一致的条带。RT-qPCR检测结果显示，ARF4KO–/+小鼠各组织中ARF4 mRNA水平显著降低，其敲除效率在37.8%-50.0%之间，ARF5表达水平无变化。ARF5KO–/–小鼠组织中ARF5 mRNA完全敲除，ARF4无变化。ARF4KO–/+/ARF5KO–/–小鼠在肺、肾和睾丸中ARF4 mRNA水平显著降低，ARF5完全敲除。最后，用寨卡病毒分别感染基因敲除小鼠和野生型小鼠。结果显示，与野生型小鼠相比，ARF4KO–/+小鼠在各时间点血清中病毒载量均显著下降，但ARF5KO–/–小鼠与ARF4KO–/+/ARF5KO–/–小鼠无明显变化。同时，与野生型小鼠相比，ARF4KO–/+小鼠各组织病毒载量没有显著降低，但其大脑和睾丸的病理性改变减轻。本研究利用CRISPR-Cas9技术成功构建了ARF4和ARF5基因敲除小鼠，并证实ARF4是寨卡病毒感染必需的宿主蛋白，为后续深入研究ARF4和ARF5在寨卡病毒感染致病中的作用机制以及抗病毒药物研发奠定了基础。
本研究旨在构建宿主ADP-核糖基化因子4 (ADP-ribosylation factor 4, ARF4)和ADP-核糖基化因子5 (ADP-ribosylation factor 5, ARF5)基因敲除小鼠，明确ARF4和ARF5基因对寨卡病毒感染的作用。首先利用CRISPR-Cas9技术，获得ARF4和ARF5单基因敲除小鼠(ARF4KO和ARF5KO)，并通过杂交繁育获得双基因敲除小鼠(ARF4KO/ARF5KO)，通过PCR法鉴定小鼠基因型，定量RT-PCR法检测目标基因的敲除效果。之后，用寨卡病毒感染基因敲除小鼠，采集第2、4、 6天小鼠血液和各组织样本，提取核酸后用RT-qPCR法检测病毒载量，用HE染色观察组织病理变化。结果显示，用ARF4和ARF5特异引物，分别在ARF4KO–/+、ARF5KO–/–以及ARF4KO–/+/ARF5KO–/–小鼠扩增到与目标基因大小一致的条带。RT-qPCR检测结果显示，ARF4KO–/+小鼠各组织中ARF4 mRNA水平显著降低，其敲除效率在37.8%-50.0%之间，ARF5表达水平无变化。ARF5KO–/–小鼠组织中ARF5 mRNA完全敲除，ARF4无变化。ARF4KO–/+/ARF5KO–/–小鼠在肺、肾和睾丸中ARF4 mRNA水平显著降低，ARF5完全敲除。最后，用寨卡病毒分别感染基因敲除小鼠和野生型小鼠。结果显示，与野生型小鼠相比，ARF4KO–/+小鼠在各时间点血清中病毒载量均显著下降，但ARF5KO–/–小鼠与ARF4KO–/+/ARF5KO–/–小鼠无明显变化。同时，与野生型小鼠相比，ARF4KO–/+小鼠各组织病毒载量没有显著降低，但其大脑和睾丸的病理性改变减轻。本研究利用CRISPR-Cas9技术成功构建了ARF4和ARF5基因敲除小鼠，并证实ARF4是寨卡病毒感染必需的宿主蛋白，为后续深入研究ARF4和ARF5在寨卡病毒感染致病中的作用机制以及抗病毒药物研发奠定了基础。
2024,40(12):4616-4627, DOI: 10.13345/j.cjb.240432
摘要：
本研究旨在构建肌肉特异性合成启动子库，筛选出活性较高的肌肉特异性启动子，分析高活性启动子序列中启动子元件与其活性的关系，为人工合成启动子提供一定理论依据。选取19个源于肌肉特异性元件、保守元件、病毒调控序列的元件，随机连接构建肌肉特异性合成启动子库。构建荧光素酶质粒pCMV-Luc和pSPs-Luc，将以上质粒转染至成肌细胞系C2C12，通过荧光素酶活性检测评估合成启动子活性；利用另外2种非肌肉源细胞系HeLa和3T3验证高活性启动子的肌肉特异性，分析活性高、肌肉特异性好且测序比对正确的启动子序列，探索元件组成与启动子活性之间的关系。本研究成功构建肌肉特异性启动子库，筛选出有效合成启动子质粒321个，其中SP-301启动子活性为CMV活性的5.63倍；活性较高的15个启动子具有肌肉特异性；分析高活性且测序正确的启动子，发现元件组成与启动子活性之间存在一定关系。肌肉特异性元件在启动子中占比偏高，但与启动子活性强弱相关性较小，是组织特异性的决定元件；病毒元件在强活性启动子中含量均不低于20%，可能是影响启动子活性的关键元件；保守元件含量与启动子活性之间具有显著的相关性，其含量与启动子活性成正比。本研究为合成组织特异性高效启动子提供了一定理论基础，为原位基因传递体系的构建和应用提供了新思路。
本研究旨在构建肌肉特异性合成启动子库，筛选出活性较高的肌肉特异性启动子，分析高活性启动子序列中启动子元件与其活性的关系，为人工合成启动子提供一定理论依据。选取19个源于肌肉特异性元件、保守元件、病毒调控序列的元件，随机连接构建肌肉特异性合成启动子库。构建荧光素酶质粒pCMV-Luc和pSPs-Luc，将以上质粒转染至成肌细胞系C2C12，通过荧光素酶活性检测评估合成启动子活性；利用另外2种非肌肉源细胞系HeLa和3T3验证高活性启动子的肌肉特异性，分析活性高、肌肉特异性好且测序比对正确的启动子序列，探索元件组成与启动子活性之间的关系。本研究成功构建肌肉特异性启动子库，筛选出有效合成启动子质粒321个，其中SP-301启动子活性为CMV活性的5.63倍；活性较高的15个启动子具有肌肉特异性；分析高活性且测序正确的启动子，发现元件组成与启动子活性之间存在一定关系。肌肉特异性元件在启动子中占比偏高，但与启动子活性强弱相关性较小，是组织特异性的决定元件；病毒元件在强活性启动子中含量均不低于20%，可能是影响启动子活性的关键元件；保守元件含量与启动子活性之间具有显著的相关性，其含量与启动子活性成正比。本研究为合成组织特异性高效启动子提供了一定理论基础，为原位基因传递体系的构建和应用提供了新思路。
2024,40(12):4628-4644, DOI: 10.13345/j.cjb.240552
摘要：
为明确凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) F1代核心群体的遗传多样性和遗传结构，本研究利用15对多态性较高的微卫星引物对15个凡纳滨对虾全同胞家系进行简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)分子标记和遗传多样性分析。结果显示，在选择的15个SSRs位点中，共检测出112个等位基因(number of alleles, Na)，60.453个有效等位基因(number of effective alleles, Ne)，多态性信息含量(polymorphism information content, PIC)均值为0.648。15个F1代核心选育家系的平均Ne为1.925–2.626，平均观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)为0.425–0.783，平均期望杂合度(expected heterozygosity, He)为0.403–0.572。聚类分析表明，15个家系主要分为3个类群，遗传距离在0.252–0.574之间。各家系间遗传分化系数(fixation index, Fst)为0.112–0.278，表明群体间存在较大的遗传分化。本研究证明15个凡纳滨对虾家系的遗传多样性适中，为后续耐受高水平豆粕饲料的凡纳滨对虾家系选育工作提供了遗传学证据。
为明确凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) F1代核心群体的遗传多样性和遗传结构，本研究利用15对多态性较高的微卫星引物对15个凡纳滨对虾全同胞家系进行简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)分子标记和遗传多样性分析。结果显示，在选择的15个SSRs位点中，共检测出112个等位基因(number of alleles, Na)，60.453个有效等位基因(number of effective alleles, Ne)，多态性信息含量(polymorphism information content, PIC)均值为0.648。15个F1代核心选育家系的平均Ne为1.925–2.626，平均观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)为0.425–0.783，平均期望杂合度(expected heterozygosity, He)为0.403–0.572。聚类分析表明，15个家系主要分为3个类群，遗传距离在0.252–0.574之间。各家系间遗传分化系数(fixation index, Fst)为0.112–0.278，表明群体间存在较大的遗传分化。本研究证明15个凡纳滨对虾家系的遗传多样性适中，为后续耐受高水平豆粕饲料的凡纳滨对虾家系选育工作提供了遗传学证据。
2024,40(12):4645-4659, DOI: 10.13345/j.cjb.240331
摘要：
为建立稳定的鸡小肠三维(three-dimensional, 3D)类器官体外培养平台，本研究从18胚龄的AA肉鸡小肠中收集隐窝细胞，在L-WRN条件培养基的基础上，通过调节烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、LY2157299、CHIR99021、Jagged-1、FGF等细胞因子的配比，对鸡小肠类器官培养条件进行优化，成功筛选出适合鸡小肠类器官长期稳定生长的培养基。优化结果显示，添加了1.5 µmol/L CHIR99021后，类器官的形成效率和类器官直径显著提高；添加0.5 µmol/L Jagged-1时，类器官出现少量芽样组织；添加50 ng/mL FGF-2后，类器官出芽率显著提高。鸡小肠器官培养基中添加1.5 µmol/L CHIR99021、0.5 µmol/L Jagged-1和50 ng/mL FGF-2能够起到协同作用，提高类器官的形成效率及增殖分化速度，细胞干性的维持效果显著提高。采用HE染色、透射电镜、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR)、间接免疫荧光和免疫组化方法对鸡小肠类器官进行形态学、含有的细胞类型和体外培养特性进行研究。结果表明，体外培养的鸡小肠3D类器官与鸡肠道组织在形态学上保持一致，并含有各种分化的上皮细胞。综上所述，本研究成功建立了鸡小肠类器官培养平台，为后续鸡肠道生理、病理、宿主-病原体相互作用机制和药物研究提供了新方法。
为建立稳定的鸡小肠三维(three-dimensional, 3D)类器官体外培养平台，本研究从18胚龄的AA肉鸡小肠中收集隐窝细胞，在L-WRN条件培养基的基础上，通过调节烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、LY2157299、CHIR99021、Jagged-1、FGF等细胞因子的配比，对鸡小肠类器官培养条件进行优化，成功筛选出适合鸡小肠类器官长期稳定生长的培养基。优化结果显示，添加了1.5 µmol/L CHIR99021后，类器官的形成效率和类器官直径显著提高；添加0.5 µmol/L Jagged-1时，类器官出现少量芽样组织；添加50 ng/mL FGF-2后，类器官出芽率显著提高。鸡小肠器官培养基中添加1.5 µmol/L CHIR99021、0.5 µmol/L Jagged-1和50 ng/mL FGF-2能够起到协同作用，提高类器官的形成效率及增殖分化速度，细胞干性的维持效果显著提高。采用HE染色、透射电镜、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR)、间接免疫荧光和免疫组化方法对鸡小肠类器官进行形态学、含有的细胞类型和体外培养特性进行研究。结果表明，体外培养的鸡小肠3D类器官与鸡肠道组织在形态学上保持一致，并含有各种分化的上皮细胞。综上所述，本研究成功建立了鸡小肠类器官培养平台，为后续鸡肠道生理、病理、宿主-病原体相互作用机制和药物研究提供了新方法。
2024,40(12):4660-4669, DOI: 10.13345/j.cjb.240333
摘要：
维甲酸信号通路在调节脊椎动物发育、细胞分化和维持组织稳态平衡中发挥重要功能。作为催化视黄醛氧化成维甲酸的关键酶，乙醛脱氢酶1家族成员A2 (aldehyde dehydrogenase 1 family member A2, Aldh1a2)在调节心脏发育过程中具有重要功能，而其在心脏疾病中发挥的功能尚不明晰。本研究通过构建和包装用于过表达Aldh1a2的腺病毒(Ad-Aldh1a2)，将其感染原代心肌细胞后分析Aldh1a2过表达对心肌细胞生物学功能的影响。结果显示心肌细胞感染Ad-Aldh1a2后能够成功实现Aldh1a2的过表达；与感染Ad-GFP的对照组相比，感染Ad-Aldh1a2的心肌细胞尺寸明显增加，胚胎期基因心房利钠肽(atrial natriuretic factor, ANF)、脑利钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)和β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain, β-MHC)表达水平上调；此外，5-乙炔基-2ʹ-脱氧尿苷(EdU)掺入实验结果显示，Aldh1a2过表达使EdU掺入阳性信号的心肌细胞比例升高，检测增殖相关基因的表达发现细胞周期蛋白D2 (cycline D2, Ccnd2)和苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白-1 (budding uninhibited by benzimidazole 1, Bub1)的表达水平也明显升高。以上结果表明Aldh1a2过表达可促进心肌细胞肥大生长和增殖。本研究为进一步了解Aldh1a2在心脏疾病中的功能、发展心脏疾病的治疗策略提供了有益的基础。
维甲酸信号通路在调节脊椎动物发育、细胞分化和维持组织稳态平衡中发挥重要功能。作为催化视黄醛氧化成维甲酸的关键酶，乙醛脱氢酶1家族成员A2 (aldehyde dehydrogenase 1 family member A2, Aldh1a2)在调节心脏发育过程中具有重要功能，而其在心脏疾病中发挥的功能尚不明晰。本研究通过构建和包装用于过表达Aldh1a2的腺病毒(Ad-Aldh1a2)，将其感染原代心肌细胞后分析Aldh1a2过表达对心肌细胞生物学功能的影响。结果显示心肌细胞感染Ad-Aldh1a2后能够成功实现Aldh1a2的过表达；与感染Ad-GFP的对照组相比，感染Ad-Aldh1a2的心肌细胞尺寸明显增加，胚胎期基因心房利钠肽(atrial natriuretic factor, ANF)、脑利钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)和β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain, β-MHC)表达水平上调；此外，5-乙炔基-2ʹ-脱氧尿苷(EdU)掺入实验结果显示，Aldh1a2过表达使EdU掺入阳性信号的心肌细胞比例升高，检测增殖相关基因的表达发现细胞周期蛋白D2 (cycline D2, Ccnd2)和苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白-1 (budding uninhibited by benzimidazole 1, Bub1)的表达水平也明显升高。以上结果表明Aldh1a2过表达可促进心肌细胞肥大生长和增殖。本研究为进一步了解Aldh1a2在心脏疾病中的功能、发展心脏疾病的治疗策略提供了有益的基础。
2024,40(12):4670-4681, DOI: 10.13345/j.cjb.240255
摘要：
酶的结构和活性受环境pH值的影响。了解酶对极端pH值的适应机制并进行区分，对于阐明酶的分子机制和工业应用具有重要意义。本研究利用ESM-2蛋白质语言模型对最适pH值大于等于9和/或小于等于5的微生物的分泌蛋白进行编码，分别获得了47 725条和66 079条数据。在此基础上，本研究构建了一个基于氨基酸序列判别蛋白酸碱耐受性的深度学习模型。该模型准确率显著超过其他方法，在测试集上的整体准确率为94.8%，精确率为91.8%、召回率为93.4%。同时搭建了一个web预测平台(https://enzymepred.biodesign.ac.cn)，用户可以直接提交酶的蛋白质序列，预测其酸碱耐受性。本研究加速了酶在生物技术、制药和化工等多个领域的应用进程，为工业酶的快速筛选与优化提供了强有力的工具。
酶的结构和活性受环境pH值的影响。了解酶对极端pH值的适应机制并进行区分，对于阐明酶的分子机制和工业应用具有重要意义。本研究利用ESM-2蛋白质语言模型对最适pH值大于等于9和/或小于等于5的微生物的分泌蛋白进行编码，分别获得了47 725条和66 079条数据。在此基础上，本研究构建了一个基于氨基酸序列判别蛋白酸碱耐受性的深度学习模型。该模型准确率显著超过其他方法，在测试集上的整体准确率为94.8%，精确率为91.8%、召回率为93.4%。同时搭建了一个web预测平台(https://enzymepred.biodesign.ac.cn)，用户可以直接提交酶的蛋白质序列，预测其酸碱耐受性。本研究加速了酶在生物技术、制药和化工等多个领域的应用进程，为工业酶的快速筛选与优化提供了强有力的工具。
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摘要：
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
摘要：
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
摘要：
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
摘要：
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
摘要：
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
摘要：
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
摘要：
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
摘要：
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
摘要：
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
2021,37(9):3151-3161, DOI: 10.13345/j.cjb.200734
摘要：
单增李斯特菌是一种重要的食源性病原菌。单增李斯特菌的分布和存活与其形成生物膜的能力有关，生物膜对逆性环境有抵抗力，细菌会从生物膜中分离导致食品持续性的污染。生物膜的形成、成熟和结构取决于多种外部和内部因素，并且多种调控机制起着重要作用。文中旨在阐述单增李斯特菌生物膜形成过程中的调控机制 (包括胞内作用、胞间作用和种间作用)，以控制食品加工环境中致病性生物膜的形成，从而为食品安全提供新的干预策略。
单增李斯特菌是一种重要的食源性病原菌。单增李斯特菌的分布和存活与其形成生物膜的能力有关，生物膜对逆性环境有抵抗力，细菌会从生物膜中分离导致食品持续性的污染。生物膜的形成、成熟和结构取决于多种外部和内部因素，并且多种调控机制起着重要作用。文中旨在阐述单增李斯特菌生物膜形成过程中的调控机制 (包括胞内作用、胞间作用和种间作用)，以控制食品加工环境中致病性生物膜的形成，从而为食品安全提供新的干预策略。
摘要：
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
摘要：
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
2023,39(10):4275-4294, DOI: 10.13345/j.cjb.230297
摘要：
本研究旨在通过蛋白质工程手段获得结构均一性更好、活性更高、抗真菌能力更强的家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38的串联多聚体蛋白。利用原核表达技术获得BmSPI38串联多聚体蛋白，并通过蛋白酶抑制剂胶内活性染色、蛋白酶抑制实验和真菌生长抑制实验等探讨串联多聚体化对BmSPI38的结构均一性、抑制活性和抗真菌能力的影响。活性染色结果表明，基于多肽柔性接头的串联表达能够极大提高BmSPI38蛋白的结构均一性。蛋白酶抑制实验表明，基于接头的串联三聚体化和四聚体化能提高BmSPI38对微生物蛋白酶的抑制能力。孢子萌发实验表明，His6-SPI38L-tetramer对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）分生孢子萌发的抑制能力显著强于His6-SPI38-monomer。真菌生长抑制实验显示，能够通过串联多聚体化来增强BmSPI38对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和白色念珠菌（Candida albicans）的抑制能力。本研究成功实现BmSPI38的串联多聚体在大肠杆菌中的异源活性表达，并证实可通过串联多聚体化来增强BmSPI38的结构均一性和抗真菌能力，不仅可为培育抗真菌转基因家蚕提供重要的理论依据和新策略，还将推动BmSPI38的外源生产及在医疗领域的应用。
本研究旨在通过蛋白质工程手段获得结构均一性更好、活性更高、抗真菌能力更强的家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38的串联多聚体蛋白。利用原核表达技术获得BmSPI38串联多聚体蛋白，并通过蛋白酶抑制剂胶内活性染色、蛋白酶抑制实验和真菌生长抑制实验等探讨串联多聚体化对BmSPI38的结构均一性、抑制活性和抗真菌能力的影响。活性染色结果表明，基于多肽柔性接头的串联表达能够极大提高BmSPI38蛋白的结构均一性。蛋白酶抑制实验表明，基于接头的串联三聚体化和四聚体化能提高BmSPI38对微生物蛋白酶的抑制能力。孢子萌发实验表明，His6-SPI38L-tetramer对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）分生孢子萌发的抑制能力显著强于His6-SPI38-monomer。真菌生长抑制实验显示，能够通过串联多聚体化来增强BmSPI38对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和白色念珠菌（Candida albicans）的抑制能力。本研究成功实现BmSPI38的串联多聚体在大肠杆菌中的异源活性表达，并证实可通过串联多聚体化来增强BmSPI38的结构均一性和抗真菌能力，不仅可为培育抗真菌转基因家蚕提供重要的理论依据和新策略，还将推动BmSPI38的外源生产及在医疗领域的应用。
摘要：
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
摘要：
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
摘要：
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
摘要：
通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的三聚氰胺抗原检测方法，对奶制品及饲料中的三聚氰胺残留水平监测提供参考。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金，标记纯化的三聚氰胺单克隆抗体，喷于试纸的金标垫。将MEL-OVA （三聚氰胺和卵清白蛋白的偶练物） 和纯化的羊抗鼠IgG 分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (质控线) 处，通过挑选试纸条材料和调试工艺参数，并最终组装成试纸条。结果显示，制备的试纸监测体系方法检出限为50 mg/L。试纸条对牛奶、奶粉和饲料中的三聚氰胺残留的检出限分别为100?mg/L、1
通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的三聚氰胺抗原检测方法，对奶制品及饲料中的三聚氰胺残留水平监测提供参考。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金，标记纯化的三聚氰胺单克隆抗体，喷于试纸的金标垫。将MEL-OVA （三聚氰胺和卵清白蛋白的偶练物） 和纯化的羊抗鼠IgG 分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (质控线) 处，通过挑选试纸条材料和调试工艺参数，并最终组装成试纸条。结果显示，制备的试纸监测体系方法检出限为50 mg/L。试纸条对牛奶、奶粉和饲料中的三聚氰胺残留的检出限分别为100?mg/L、1
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